馬娟，張怡雯，董晨陽(yáng)，柴洋洋,2*，郭慶啟,2

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

（2.黑龍江省森林食品資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150040)

黃精是百合科黃精屬（Polygonatum）的藥食同源植物[1]。全國(guó)大部分地區(qū)都有分布，主要產(chǎn)于寧夏、甘肅、廣西、陜西、黑龍江、河北、遼寧、貴州、湖南、云南等地[2]。據(jù)報(bào)道黃精具有許多藥理作用和生物學(xué)活性，例如抗氧化和抗衰老，此外還具有抗骨質(zhì)疏松、神經(jīng)保護(hù)、增強(qiáng)免疫力、抗糖尿病、抗疲勞和抗癌作用，同時(shí)也有治療疲勞、虛弱、糖尿病、咳嗽、消化不良、食欲不振、性功能障礙、背痛和劇烈疼痛的作用。由于黃精含有多種活性成分，例如生物堿、黃酮、類固醇皂苷、木質(zhì)素、氨基酸和多糖，才能發(fā)揮如此豐富的生物活性[3]。

糖尿病是一種由于遺傳等因素引起的，因先天性或后天體內(nèi)胰腺分泌胰島素不足，使得糖代謝、脂肪代謝紊亂的疾病。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療本病方法較多，如注射胰島素、口服降血糖藥等，大多數(shù)都以西藥為主，然而使用西藥控制不可避免長(zhǎng)期用藥，同時(shí)一些并發(fā)癥的出現(xiàn)也讓治療的風(fēng)險(xiǎn)增大。糖尿病在中醫(yī)中被分類成“消渴病”[4]。滋陰清熱法是本病的主要治療原則[5]。而中藥的使用，不僅能有效延緩肝、腎的損傷，發(fā)揮溫合的藥效，同時(shí)適用于大多數(shù)患者。徐錦龍等[6]已就黃精多糖顯著降低糖尿病大鼠模型血糖水平的機(jī)制進(jìn)行研究并得出黃精中藥制劑治療2型糖尿病不劣于單純西藥治療的結(jié)論，賈璐等[7]也通過觀察小鼠血糖水平證實(shí)了黃精多糖具有降低高血糖小鼠空腹血糖值等作用。

腸道微生物群是人體最大的生物系統(tǒng)[8]，同時(shí)，腸道菌群有助于平衡人類與環(huán)境之間的動(dòng)態(tài)平衡，而代謝異常會(huì)導(dǎo)致腸道菌群功能失調(diào)，內(nèi)部環(huán)境紊亂以及病原體的繁殖[9]。因此，如何逆轉(zhuǎn)腸道菌群的失衡已成為糖尿病的治療策略[10]。大量研究表明，益生菌可以有效地干擾糖尿病患者的胰島素分泌從而抵抗2型糖尿病[11]，冉雄等[12]通過系統(tǒng)地評(píng)估，得出參芪復(fù)合物導(dǎo)致2型糖尿病患者的菌群代謝產(chǎn)物為內(nèi)毒素、短鏈脂肪酸、膽汁酸、吲哚等，所以通過研究腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成的調(diào)節(jié)情況考察植物活性成分的血糖調(diào)控作用具有一定的研究?jī)r(jià)值。

王俊杰等[13]發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的黃精中都含有18種氨基酸，但是不同地區(qū)黃精氨基酸的含量存在差異性，而不同產(chǎn)地的黃精其化學(xué)成分含量也不盡相同。因此本研究旨在測(cè)定分析六個(gè)不同產(chǎn)地（安徽、湖南、云南、黑龍江、遼寧、廣西）黃精的主要化學(xué)成分（水分、灰分、皂苷、多糖、粗蛋白、粗纖維、粗脂肪）的含量差異，就六個(gè)不同產(chǎn)地的黃精對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、葡萄糖透析延遲指數(shù)進(jìn)行分析比較，選取有效化學(xué)成分含量較高、降糖性能較好的黃精進(jìn)一步體外酵解培養(yǎng)，通過16S rDNA測(cè)序?qū)ε囵B(yǎng)液的菌群進(jìn)行分析，探究腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成情況，分析黃精降血糖作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精樣品分別選自六個(gè)不同產(chǎn)地，其中安徽黃精產(chǎn)地為安徽省池州市青陽(yáng)縣九華山，湖南黃精產(chǎn)地為湖南省永州市祁陽(yáng)縣掛榜山，云南黃精由云南省臨滄市云縣信合農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供，黑龍江黃精由黑龍江省哈爾濱市阿城區(qū)天門山農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)股份有限公司提供，遼寧黃精產(chǎn)地為遼寧省鞍山市海城市析木鎮(zhèn)，廣西黃精產(chǎn)地為廣西省百色市西林縣那哈村王子山，獲得材料后，將表面泥土洗凈，用刀切成薄片（0.5 cm左右），置于45 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎，過40目篩后放入保鮮袋冷凍保存。

清潔級(jí)昆明小鼠購(gòu)自青島大任富城畜牧有限公司（許可證號(hào)：SCXK(Lu)2014-0007）。

薯蕷皂苷元、蒽酮、考馬斯亮藍(lán)G-250、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、可溶性淀粉、粘蛋白、胰蛋白胨、阿拉伯半乳聚糖、瓜爾豆膠、L-半胱氨酸鹽酸鹽，上海源葉生物科技有限公司；蛋白胨、酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白，美國(guó)BiotoPPed公司；香草醛、3,5-二硝基水楊酸，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醇，遼寧泉瑞試劑有限公司；正丁醇，天津市富宇精細(xì)化有限公司；高氯酸，天津政成化學(xué)制品有限公司；石油醚，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；磷酸，天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；濃硫酸、濃鹽酸，西隴化工股份有限公司；苯酚，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；其它藥品試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

培養(yǎng)基（g/L）：可溶性淀粉5 g、蛋白胨5 g、胰蛋白胨5 g、酵母提取物4.5 g、NaCl 4.5 g、KCl 4.5 g、果膠2 g、粘蛋白4 g、絡(luò)蛋白（干酪素）3 g、阿拉伯半乳聚糖2 g、NaHCO31.5 g、一水合硫酸鎂0.69 g、瓜爾豆膠1 g、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.8 g、磷酸二氫鉀0.5 g、磷酸氫二鉀0.5 g、膽酸鹽0.4 g、CaCl20.08 g、FeSO4·7H2O 0.5 g、吐溫80 1 mL、刃天青4 mL（0.025%，m/V），121 ℃下滅菌15 min使用[14]。

1.2 儀器與設(shè)備

FW 100高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；B-220恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；BS-224-S電子分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器公司；UV-6300紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SB25-12DTD超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；XK96-A快速混合機(jī)，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；SPetramax 2e全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)MD公司；超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；TGL-16G離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 黃精化學(xué)成分測(cè)定

1.3.1.1 水分含量測(cè)定

參考GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》，采用直接干燥法測(cè)定。

1.3.1.2 灰分含量測(cè)定

參考GB 5009.4-2016《食品中灰分的測(cè)定》，采用灼燒法測(cè)定。

1.3.1.3 多糖含量測(cè)定

參考藍(lán)松[15]的方法，采用苯酚-硫酸法測(cè)定。

使用紫外分光光度計(jì)，重復(fù)測(cè)定三次后除去異常數(shù)據(jù)，取平均值，以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到y(tǒng)=13.266x +0.1049，R2=0.9997的回歸方程。

1.3.1.4 皂苷含量測(cè)定

參考苑璐等[16]的測(cè)量方法進(jìn)行對(duì)照品溶液的制備及供試品溶液的制備，稱取60 ℃干燥至恒重的黃精粉末2 g，加入石油醚50 mL，40 ℃超聲提取30 min，過濾，藥渣揮干溶劑后，加入80%乙醇，40 ℃超聲提取30 min，功率60 W，過濾，取濾液，蒸干溶劑后加入10 mL 0.5 mol/L鹽酸，混勻，40 ℃超聲提取45 min。再用正丁醇超聲提取2次，正丁醇用量分別為30、10 mL，后揮去正丁醇，用甲醇定容至10 mL，即得供試品溶液。

通過紫外分光光度計(jì)，采用香草醛-冰醋酸法測(cè)定，重復(fù)測(cè)定三次后除去異常數(shù)據(jù)，取平均值，以總皂苷的含量以吸光度為縱坐標(biāo)，薯蕷皂苷元濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到y(tǒng)=2.1871x+0.1161，R2=0.9997的回歸方程。

1.3.1.5 粗脂肪含量測(cè)定

參考GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測(cè)定》，采用索氏抽提法測(cè)定。

1.3.1.6 粗蛋白含量測(cè)定

參考柳蔭等[17]的方法，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的制備，使用紫外分光光度計(jì)，重復(fù)測(cè)定三次后除去異常數(shù)據(jù)，取平均值，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到y(tǒng)=0.901x+0.0062，R2=0.999的回歸方程，并結(jié)合王遠(yuǎn)茜等[18]的研究?jī)?nèi)容，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。取20 g鮮黃精，在料液比1:5（g/mL），pH為9（NaOH溶液調(diào)節(jié)）的條件下放置于4 ℃冰箱浸提4 h，過濾之后用HCl分別調(diào)pH至3.5，過濾后再離心，取上清液密封保存。濾渣再提取一次，合并濾液。取樣品溶液0.1 mL于試管中，各加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，充分混合，放置10 min，以試劑空白為對(duì)照，波長(zhǎng)595 nm處比色，測(cè)定吸光度值。

1.3.1.7 粗纖維含量測(cè)定

參考GB/T 5009.10-2003《植物類食品中粗纖維的測(cè)定》，采用堿提酸沉法測(cè)定。

1.3.1.8 水提物與醇提物制備

參考梁小瑞等[19]的方法，分別稱取不同產(chǎn)地黃精粉末5 g，分別加100 mL蒸餾水浸泡2 h（料液比為1:20），加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液并離心分離3000 r/min，離心20 min，上清液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至5 mL，所得即為水提物。

參考武曉英等[20]的方法，精密稱取5 g黃精粉末，加入40 mL的80%乙醇（m/V=1:8），浸泡24 h，回流提取3次，每次2 h，以4000 r/min離心10 min，合并離心上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇至無醇味，所得即為醇提物。

1.3.1.9 黃精水提物及醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

參考包瑞敏等[21]和趙堂彥等[22]的方法，水提物進(jìn)行稀釋，吸取400 μL樣品加100 mL水即為待測(cè)水提物樣品溶液；在試管中加入1000 μL磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.8，0.05 mol/L），200 μLα-葡萄糖苷酶溶液（0.2 U/mL），100 μL樣品溶液；37 ℃水浴20 min；加入200 μL PNPG溶液（0.02 mol/L）；繼續(xù)37 ℃水浴20 min；加入800 μL Na2CO3溶液（1 mol/L）停止反應(yīng)；于405 nm處測(cè)定其吸光值。同時(shí)做相同體系下的樣品對(duì)照組（用磷酸鹽緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液，加入PNPG溶液后再加入NA2CO3溶液）、樣品空白組（用磷酸鹽緩沖溶液代替α-葡萄糖苷酶溶液，加入PNPG溶液后再加入NA2CO3溶液）。醇提物不稀釋，操作方法與上述相同。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式如下：

式中：

A——樣品組吸光度；

B——樣品對(duì)照組吸光度；

C——樣品空白組吸光度。

1.3.1.10 黃精水提物及醇提物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用

參考趙堂彥等[22]、馬利華等[23]的方法，水提物進(jìn)行稀釋，吸取400 μL樣品加100 mL水即為待測(cè)水提物樣品溶液；在試管中加入200 μL黃精提取液混合500 μL的α-淀粉酶（0.50 mg/mL）的磷酸鈉緩沖溶液（0.02 mol/L，pH 6.9，含0.006 mol/L NaCl為穩(wěn)定劑）；37 ℃水浴孵育5 min；加入500 μL淀粉溶液（0.02 g/mL，0.02 mol/L鈉緩沖溶液，pH 6.9，含0.006 mol/L NaCl）；37 ℃水浴孵育5 min；加入500 μL二硝基水楊酸停止反應(yīng)；沸水中進(jìn)一步孵育5 min；反應(yīng)混合物冷卻后，在540 nm處讀取吸光度；同時(shí)做相同體系下的樣品對(duì)照組（除淀粉溶液外，所有試劑和酶都有）。醇提物未稀釋，加入1 mL二硝基水楊酸，其余步驟均相同。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式如下：

式中：

A對(duì)照樣品吸光度——不加淀粉溶液時(shí)540 nm處吸光度；

A樣品吸光度——加淀粉溶液時(shí)540 nm處吸光度。

1.3.1.11 葡萄糖透析延遲指數(shù)的測(cè)定

參考龔衛(wèi)華等[24]和黃冬云等[25]的方法，準(zhǔn)確稱取0.2000 g樣品粉末和0.0200 g葡萄糖加入到10 mL的蒸餾水中；連續(xù)攪拌1 h，裝入截留量為7000的透析袋中；將透析袋放入250 mL錐形瓶中；250 mL錐形瓶中加入150 mL蒸餾水；37 ℃恒溫振蕩；于30、60、90、120 min吸取葡萄糖透析液2 mL；測(cè)定葡萄糖的質(zhì)量濃度，采用硫酸蒽酮比色法[26]測(cè)定葡萄糖的含量，620 nm處測(cè)定吸光度，以x為葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL），y為吸光度計(jì)算回歸方程，得到y(tǒng)=6.5071x +0.0034，R2=0.9977的標(biāo)準(zhǔn)曲線；同時(shí)做相同體系下的樣品對(duì)照組（加入粉末樣品，不加葡萄糖）、空白對(duì)照組（加入葡萄糖，不加粉末樣品）。葡萄糖透析延遲指數(shù)（GDRI/%）的計(jì)算公式如下：

式中：

C樣——樣品溶液的葡萄糖質(zhì)量濃度；

C背——樣品對(duì)照的葡萄糖質(zhì)量濃度；

C空——空白對(duì)照的葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.3.2 黃精水提物體外模擬酵解培養(yǎng)

1.3.2.1 糞便接種物的制備

建立2型糖尿病鼠模型采用高脂飲食-鏈脲霉素誘導(dǎo)的方法[27]，同時(shí)采用應(yīng)激性排便法，輕提起小鼠尾部，后按壓小鼠腹部，收集其新鮮糞便于無菌EP管中，用PBS緩沖液按固液比1:4的比例配置成20%的固液混合物，渦旋混勻，分別使用3層無菌紗布過濾，得到糞便濾液，以上操作均在厭氧操作臺(tái)中完成。

1.3.2.2 體外模擬酵解培養(yǎng)

將黃精水提物進(jìn)行體外酵解[28]后作為實(shí)驗(yàn)組（TFE），酵解培養(yǎng)體系的組成為45%糞便液、45%發(fā)酵培養(yǎng)基、10%黃精水提物，同時(shí)以無菌蒸餾水作為對(duì)照（正常小鼠NFC，糖尿病小鼠TFC）。將樣品發(fā)酵液若干移入滅菌后的10 mL EP管中，用橡膠塞塞緊后放入裝有厭氧產(chǎn)氣包的厭氧培養(yǎng)袋中，再置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.3.2.3 pH的測(cè)定

在酵解0、6、12、24、48 h時(shí)，從樣品組與對(duì)照組中分別取2 mL測(cè)定pH，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.2.4 16S rDNA測(cè)序分析

將酵解培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)液于-80 ℃凍存，后送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序，分析其菌群變化情況。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，得到的數(shù)據(jù)采用Origin 2021軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用Mean±SD/SE表示，并用SPSS 26.0軟件進(jìn)行處理分析，以單因素方差分析和t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異顯著性比較，不同小寫字母表示不同組別之間數(shù)據(jù)差異顯著（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分含量分析

通過對(duì)六個(gè)產(chǎn)地（安徽、湖南、云南、廣西、遼寧、黑龍江）的主要活性成分即水分、灰分、皂苷、多糖、粗蛋白、粗纖維、粗脂肪的含量測(cè)定，結(jié)果如表1所示，黃精的各活性成分間存在顯著差異性（p＜0.05）。各產(chǎn)地黃精水分含量較大，范圍在75.40% ～91.88%，都達(dá)到了75%以上，廣西產(chǎn)黃精的水分高達(dá)91.88%，與其他5種有顯著差異（p＜0.05），比較后可知，水分含量從高到低依次為：廣西＞遼寧＞云南＞湖南＞黑龍江＞安徽；灰分的含量在1.59%～3.82%，可見灰分的含量都未超過5%，湖南灰分與其他五個(gè)產(chǎn)地差異顯著，而廣西與黑龍江的灰分含量差異不顯著，六個(gè)產(chǎn)地灰分含量從高到低依次為：湖南＞云南＞安徽＞遼寧＞黑龍江＞廣西；六個(gè)產(chǎn)地粗脂肪的含量為6.30%～8.70%，都小于10%且大于5%，其中云南、遼寧的黃精粗脂肪差異不顯著，廣西、湖南的黃精粗脂肪差異不顯著，安徽、黑龍江黃精粗脂肪差異不顯著，六個(gè)產(chǎn)地粗脂肪含量從高到低依次為：云南＞遼寧＞湖南＞廣西＞黑龍江＞安徽；粗纖維的含量范圍在0.80%～ 4.48%，黑龍江地區(qū)的黃精粗纖維含量最少，只有0.8%，且與其它地區(qū)黃精粗纖維含量有顯著差異（p＜0.05），而廣西的粗纖維含量達(dá)到4.48%，與其它地區(qū)黃精粗纖維含量顯著差異（p＜0.05），六個(gè)產(chǎn)地粗纖維含量從高到低依次為：廣西＞遼寧＞安徽＞湖南＞云南＞黑龍江；皂苷是黃精中較為重要的活性成分，這六個(gè)產(chǎn)地的皂苷范圍是0.66～1.28 mg/mL，其中湖南、廣西兩地的皂苷濃度都大于1 mg/mL，與其它地區(qū)黃精皂苷含量有顯著差異（p＜0.05），六個(gè)產(chǎn)地皂苷含量從高到低依次為：湖南＞廣西＞安徽＞云南＞遼寧＞黑龍江；同樣的，黃精多糖也是黃精活性成分中較為重要的部分，其中含量范圍為0.01～0.03 mg/mL，黑龍江的黃精其多糖含量較其他地區(qū)最有優(yōu)勢(shì)，達(dá)到了0.03 mg/mL，且與其它地區(qū)黃精多糖含量有顯著差異（p＜0.05），六個(gè)產(chǎn)地多糖含量從高到低依次為：黑龍江＞湖南＞安徽＞廣西＞云南＞遼寧，而湖南、廣西兩地的黃精多糖、皂苷含量位于前列；粗蛋白的含量范圍在0.45～0.68 mg/mL，除黑龍江與云南外，其余產(chǎn)地黃精的粗蛋白含量都在0.60 mg/mL以上，六個(gè)產(chǎn)地粗蛋白含量從高到低依次為：廣西＞安徽＞遼寧＞湖南＞云南＞黑龍江。通過對(duì)比分析各個(gè)產(chǎn)地活性成分含量，廣西黃精的水分含量最高，并且其無機(jī)成分相對(duì)較少，黃精多糖含量較高，同時(shí)廣西黃精的皂苷含量名列前茅，與湖南黃精的皂苷含量相差不多，粗纖維粗蛋白含量也最多；同時(shí)湖南黃精的皂苷含量最高，其余活性成分含量同樣較高，因此選擇湖南產(chǎn)地與廣西產(chǎn)地的黃精進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表1 不同產(chǎn)地黃精中化學(xué)成分的含量 Table 1 Contents of chemical compositions in Polygonatum

2.2 降血糖性能比較分析

本研究通過測(cè)定六個(gè)產(chǎn)地黃精水提物、醇提物對(duì)于α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶兩種酶的抑制率，初步分析比較各個(gè)產(chǎn)地的降血糖性能，結(jié)果如圖1所示，廣西黃精水提物與醇提物對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制能力最強(qiáng)，其中黃精水提物的抑制率為98.36%，黃精醇提物的抑制率為97.93%，較其余5個(gè)產(chǎn)地的黃精對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制作用有顯著性差異（p＜0.05），六個(gè)產(chǎn)地黃精水提物對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制率由高到低排序?yàn)椋簭V西＞湖南＞黑龍江＞安徽＞云南＞遼寧，六個(gè)產(chǎn)地黃精醇提物對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制率由高到低排序?yàn)椋簭V西＞黑龍江＞安徽＞遼寧＞湖南＞云南。

圖1 黃精水提物及醇提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用 Fig.1 Inhibitory effect of aqueous and ethanol extracts of Polygonatum on α-glucosidase

如圖2所示，在α-淀粉酶的抑制率結(jié)果中可以看到，各個(gè)產(chǎn)地黃精水提物對(duì)于α-淀粉酶的抑制率明顯高于黃精醇提物對(duì)于此酶的抑制率，例如遼寧黃精的水提物對(duì)于α-淀粉酶的抑制率達(dá)到了85.16%，而遼寧黃精醇提物對(duì)于α-淀粉酶的抑制率只達(dá)到了20.87%，差異極顯著（p＜0.05），這表明不同的處理方法及提取方式都會(huì)對(duì)其化學(xué)成分和功效造成影響。其中六個(gè)產(chǎn)地黃精水提物對(duì)于α-淀粉酶的抑制率由高到低排序?yàn)椋喊不眨驹颇希竞邶埥緩V西＞湖南＞遼寧；六個(gè)產(chǎn)地黃精醇提物對(duì)于α-淀粉酶的抑制率由高到低排序?yàn)椋汉希竞邶埥景不眨驹颇希緩V西＞遼寧。

圖2 黃精水提物及醇提物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用 Fig.2 Inhibitory effect of aqueous and ethanol extracts of Polygonatum on α-amylase

結(jié)合2.1部分對(duì)各個(gè)產(chǎn)地活性成分含量的分析比較，廣西黃精其水提物與醇提物對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制性較其余產(chǎn)地差異較顯著（p＜0.05），同時(shí)廣西黃精水提物對(duì)于α-淀粉酶的抑制率也較高，為91.85%；湖南黃精的水提物對(duì)于這兩個(gè)酶的抑制率與廣西黃精相比較，差異略顯著（p＜0.05），然而也處于較高水平，其水提物對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到了90.24%，且湖南黃精醇提物對(duì)于α-淀粉酶的抑制率為六個(gè)產(chǎn)地中最高，達(dá)到了54.21%；除此之外，黑龍江黃精也值得我們關(guān)注，由上一部分化學(xué)成分含量分析可知，黑龍江黃精中多糖含量較高，而其水提物與醇提物對(duì)于α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶的抑制率都達(dá)到了較高水平。綜上所述，廣西黃精相對(duì)于其他產(chǎn)地黃精有較好的降血糖活性。

同時(shí)進(jìn)行葡萄糖透析指數(shù)的測(cè)定，當(dāng)葡萄糖在胃腸道中被延遲吸收時(shí)，血液中的血糖含量將會(huì)減少[24]。葡萄糖透析延遲指數(shù)（GDRI）可是一個(gè)重要的體外指標(biāo)，對(duì)于預(yù)測(cè)纖維對(duì)胃腸道葡萄糖吸收的延遲具有重要作用[29]。不同產(chǎn)地黃精水提物和醇提物的葡萄糖透析指數(shù)結(jié)果如圖3所示，隨著時(shí)間的增加，安徽、湖南兩地黃精的葡萄糖透析指數(shù)先增長(zhǎng)后下降，在60 min時(shí)，安徽黃精的葡萄糖透析指數(shù)達(dá)到最高（87.19%）；廣西黃精的葡萄糖透析指數(shù)則一直呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，由30 min時(shí)的45.53%上升到了120 min時(shí)的73.25%，云南黃精的葡萄糖透析指數(shù)呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì)，30 min時(shí)已經(jīng)達(dá)到了最高（97.32%），60、90 min時(shí)都有所下降，120 min時(shí)云南黃精的葡萄糖透析指數(shù)又增長(zhǎng)回93.31%；遼寧、黑龍江的葡萄糖透析指數(shù)增大后減小，隨后繼續(xù)增大，后減小，90 min時(shí)，兩地黃精都達(dá)到最高水平，遼寧黃精的葡萄糖透析指數(shù)為93.78%，黑龍江黃精的葡萄糖透析指數(shù)為96.28%；本試驗(yàn)中，各產(chǎn)地黃精的GDRI要顯著高于橄欖核中提取纖維的GDRI（22%～29%）、芒果皮中纖維的GDRI（21%）和楊桃果渣纖維的GDRI（25%）、麥麩中纖維的GDRI（5.3%）[30]。

圖3 不同時(shí)間各個(gè)產(chǎn)地黃精水提物、醇提物葡萄糖透析指數(shù)的變化情況 Fig.3 Changes of glucose dialysis index of water extract and alcohol extract of Polygonatum from different places of origin at different time

總體來看，云南黃精的葡萄糖透析能力優(yōu)于其他產(chǎn)地黃精，各地黃精在葡萄糖透析指數(shù)達(dá)到最高水平時(shí)差異不顯著，但各地黃精在30、60、90、120 min時(shí)的葡萄糖透析指數(shù)變化趨勢(shì)不同，這可能與黃精的來源和內(nèi)在結(jié)構(gòu)、其活性成分含量都有一定關(guān)系。

2.3 16S rDNA結(jié)果分析

根據(jù)六個(gè)產(chǎn)地黃精化學(xué)成分含量及降血糖性能的綜合比較分析，選用廣西黃精的水提物進(jìn)行體外酵解培養(yǎng)。將培養(yǎng)液進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序。

2.3.1 feature分布Venn圖分析

如圖4所示，三個(gè)組中feature表達(dá)均為非零，即為三個(gè)組共有的feature的豐度為120，同理，若存在feature只存在于一個(gè)分組，則該feature為該分組特有，可以看到，NFC的特有feature豐度為435，TFC的特有feature豐度為483，TFE的特有feature豐度為285。而NFC與TFC共有feature的豐度為143，NFC的特有feature豐度為412，TFC的特有feature豐度為460，此兩組共有的feature的相對(duì)豐度較低，表明正常小鼠與糖尿病小鼠腸道菌群組成及優(yōu)勢(shì)菌群差異顯著。TFC與TFE這兩個(gè)組別是我們重點(diǎn)比較的一組，其中共有的feature的豐度為289，TFC的特有feature豐度為314，TFE的特有feature豐度為116，這表明了黃精的提取物對(duì)于糖尿病患者的腸道菌群有一定的影響，從而導(dǎo)致了特有feature的產(chǎn)生與相對(duì)豐度的變化。最后一組對(duì)比為NFC與TFE，共有feature的豐度為129，其中NFC的特有feature豐度為426，TFE的特有feature豐度為276，可以看到，此兩組的feature差異顯著，即正常小鼠的腸道菌群與經(jīng)過培養(yǎng)的糖尿病小鼠的腸道菌群的菌種與數(shù)量差異顯著。

圖4 三個(gè)組分的Venn圖 Fig.4 Venn diagram of three components

2.3.2 Alpha多樣性分析

稀釋曲線（rarefaction curve）通過模擬重新取樣的過程，觀察NFC、TFC、TFE三組中物種及菌群變化的趨勢(shì)，估計(jì)樣本中的物種豐富程度。如圖5a稀釋曲線所示，橫坐標(biāo)代表隨機(jī)抽取的序列數(shù)量，縱坐標(biāo)代表觀測(cè)到的feature數(shù)量?？梢钥吹絅FC的chao1指數(shù)為245.50～297.64，TFC的chao1指數(shù)為266.00～327.40，TFE的chao1指數(shù)為200.00～246.13，同時(shí)通過圖5b看到NFC的shannon指數(shù)為5.61～5.97，TFC的shannon指數(shù)為5.86～6.00，TFE的shannon指數(shù)為5.26～5.67，其所有樣本的數(shù)據(jù)的覆蓋率都達(dá)到了1.00（0.999以上），即在相同的測(cè)序深度下，TFC中的feature數(shù)目的豐度大于NFC，同時(shí)NFC的feature數(shù)目的豐度大于TFE。也就是在一定程度上TFC的豐富度和多樣性高于NFC，同時(shí)NFC的豐富度和多樣性高于TFE，表明糖尿病小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)比正常小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而經(jīng)黃精提取物干預(yù)后，糖尿病小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)變得簡(jiǎn)單，改善了糖尿病小鼠腸道菌群的紊亂情況。從上圖曲線中我們也可以看到，曲線在測(cè)序深度為0～500的范圍內(nèi)繼續(xù)上升，而到后面曲線趨于平緩，這說明估算測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠，且測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，達(dá)到飽和。

圖5 三個(gè)組分的chao1指數(shù)稀釋曲線圖（a）和shannon指數(shù)稀釋曲線圖（b） Fig.5 Chao1 exponential dilution curve (a) and shannon exponential dilution curve (b) of the three components

2.3.3 物種分析

如圖6所示，默認(rèn)選取豐度最高的30個(gè)物種分類，將每個(gè)分組樣本的相對(duì)豐度進(jìn)行柱狀圖展示。柱狀圖的形式便于更直觀地進(jìn)行樣品豐度的比較。在各個(gè)層級(jí)中，我們可以直觀的看到優(yōu)勢(shì)菌種的表達(dá)情況，及在各個(gè)不同處理中的變化趨勢(shì)。在本文中我們重點(diǎn)關(guān)注門、屬水平的分類，代表性強(qiáng)且分類層級(jí)清晰便于比較，易于分析。

門水平下各組分樣品豐度如圖6a所示，在糖尿病鼠的糞便濾液與黃精水提取液體外厭氧培養(yǎng)48 h小時(shí)后，豐度顯著降低的菌門有Firmicutes厚壁菌門、Bacteroidetes類桿菌門等，豐度顯著增大的菌門有Actinobacteria放線菌門、Proteobacteria變形菌門等。

圖6 各組分樣品門水平（a）和屬水平（b）的柱狀圖 Fig.6 The histogram of each component sample gate level (a) and genus level (b)

屬水平下，經(jīng)黃精水提物干預(yù)后，糖尿病小鼠的腸道菌群中豐度降低的菌群有Faecalibacterium糞桿菌門、Agathobacter無桿菌、Dialiste戴阿里斯特桿菌、Blautia布芬特式菌、Parabacteroides擬桿菌、Escherichia-Shigella大腸桿菌志賀氏菌、Lachnoclostridium巨單胞菌門、Allisonella阿里松氏菌、Fusicatenibacter融合桿菌等，豐度顯著降低的菌群有Prevotellaceae_NK3B31_group普雷沃氏菌、Ruminococcus_2瘤胃球菌等；而豐度增大的菌有Bacteroides擬桿菌、Collinsella柯林斯氏菌、Parasutterella副沙門氏菌、Klebsiella克雷伯菌、Alistipes理研菌科另枝菌等，豐度顯著增大的菌群有Bifidobacterium雙歧桿菌等。

Bacteroidetes類桿菌門的代謝產(chǎn)物都在厭氧感染中起著重要作用，故Bacteroidetes類桿菌門為有害菌，說明黃精提取物使病鼠腸道菌群中的有害菌門減少，具有有益作用。Proteobacteria變形菌門可以發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，對(duì)糖尿病小鼠而言是有益菌門，而此菌的變化情況與范順明等[31]研究的生知母-生黃柏對(duì)糖尿病小鼠降糖過程中變形菌門的變化情況相同。門水平下，黃精提取液對(duì)于病鼠的腸道菌群構(gòu)造與各優(yōu)勢(shì)菌門的豐度都有很大的改變，有益菌門豐度相應(yīng)增大，而有害菌門豐度減小。

Bifidobacterium雙歧桿菌是一種腸道有益微生物，李俊潔等[32]已就此菌的藥理作用進(jìn)行研究，雙歧桿菌具有降低血脂等功能，故對(duì)于糖尿病等代謝疾病作用優(yōu)良。Faecalibacterium糞桿菌門為化能有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，發(fā)酵代謝，是厭氧菌門，糖化血紅蛋白是監(jiān)測(cè)糖尿病人血糖水平的重要指標(biāo)，研究發(fā)現(xiàn)，糞桿菌豐度與糖化血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)[33]。Prevotellaceae_NK3B31 _group普雷沃氏菌擅長(zhǎng)消化腸道中的糖蛋白。Ruminococcus_2瘤胃球菌是一種異型發(fā)酵菌群，維生素分解菌群。

綜上所述，在黃精水提物干預(yù)后，改善了糖尿病小鼠腸道菌群中優(yōu)勢(shì)菌門的豐度和多樣性，Proteobacteria變形菌門、Bifidobacterium雙歧桿菌等有益菌豐度增大，而Prevotellaceae_NK3B31_group普雷沃氏菌、Ruminococcus_2瘤胃球菌等有害菌豐度降低，這意味著黃精有效改善糖尿病小鼠腸道菌群紊亂，具有一定降血糖性能。

2.3.4 黃精水提物體外酵解培養(yǎng)pH變化

分別在體外酵解0、6、12、24、48 h時(shí)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行pH的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如下：

如圖7所示，NFC、TFC、TFE三組整體pH值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中正常小鼠糞便液的pH值顯著低于糖尿病小鼠糞便液的pH值，根據(jù)2.3.2 Alpha多樣性分析結(jié)果可知，正常小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)比糖尿病小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且前者腸道菌群中菌群的豐度大于后者，導(dǎo)致正常小鼠的糞便液中有機(jī)酸含量更高，pH值更低。而經(jīng)過黃精提取物培養(yǎng)后的培養(yǎng)液的pH值遠(yuǎn)小于未經(jīng)培養(yǎng)的正常小鼠與糖尿病小鼠的糞便液，這可能是由于隨著體外酵解培養(yǎng)時(shí)間的增加，小鼠腸道菌群中一些產(chǎn)酸菌的繁殖速度變快，其產(chǎn)生的短鏈脂肪酸等有機(jī)酸含量增加，短鏈脂肪酸等有機(jī)酸能夠改善肥胖小鼠的血糖水平，并提高胰島素敏感性[33]。前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過黃精提取物的干預(yù)后，糖尿病小鼠腸道菌群中一些產(chǎn)酸菌如變形菌門（Proteobacteria）等的豐度增大，從而導(dǎo)致TFE組pH值整體小于TFC組，且下降趨勢(shì)明顯，同時(shí)酸性環(huán)境對(duì)有益菌的生存、繁殖具有推動(dòng)作用，而抑制有害菌門的增值，這意味著黃精可以顯著改善糖尿病小鼠腸道菌群的pH值與血糖水平，使其趨于穩(wěn)定狀態(tài)。

圖7 不同時(shí)間黃精水提物體外酵解液pH的變化情況 Fig.7 Changes of the pH of the extracorporeal fermentation solution of Polygonatum water extract

3 結(jié)論

3.1 通過對(duì)比分析六個(gè)產(chǎn)地黃精的化學(xué)成分含量，廣西黃精的水分、粗纖維、粗蛋白都顯著高于其他產(chǎn)地黃精，湖南黃精的多糖與皂苷含量顯著高于其它產(chǎn)地，而廣西黃精的提取物對(duì)于α-葡萄糖苷酶的抑制率同樣較優(yōu)。廣西黃精的葡萄糖透析指數(shù)一直呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，各地黃精的葡萄糖透析指數(shù)變化趨勢(shì)不同，這可能與黃精的來源和內(nèi)在結(jié)構(gòu)、其活性成分含量都有一定關(guān)系。故本研究選用廣西黃精水提物體外酵解培養(yǎng)，后經(jīng)16S rDNA高通量測(cè)序及分析發(fā)現(xiàn)，在門水平與屬水平下，各有益菌門豐度增大，如變形菌門（Proteobacteria）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）等，而普雷沃氏菌（Prevotellaceae_NK3B31_group）、瘤胃球菌（Ruminococcus_2）等有害菌門豐度降低。研究[32]發(fā)現(xiàn)，黑木耳中的黑木耳多糖主要是由木糖、果糖、甘露糖以及葡萄糖組成的雜多糖，其對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制作用，且體外降血糖活性較強(qiáng)。而白云飛等[33]所研究的黑木耳多糖與銀耳多糖、山楂黃酮復(fù)配物促進(jìn)小鼠腸道菌群中乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等有益細(xì)菌的生長(zhǎng)與本文中黃精提取物干預(yù)后促進(jìn)小鼠腸道菌群中變形菌門（Proteobacteria）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）等有益細(xì)菌生長(zhǎng)，趨勢(shì)一致，這說明黃精提取物的干預(yù)對(duì)于糖尿病小鼠腸道菌群的紊亂有著一定的改善作用，且黃精具有體外降血糖活性。

3.2 本研究比較分析了不同產(chǎn)地各化學(xué)成分的含量差異，并對(duì)不同產(chǎn)地黃精的降血糖性能進(jìn)行測(cè)定，結(jié)合16S rDNA進(jìn)行物種分析，充分證實(shí)了黃精的調(diào)節(jié)作用，為黃精在糖尿病防治方面提供理論依據(jù)。