姚丹，李應，黎華君，于瀛龍，賀興江，詹洪平，周文才，萬煒，韋小平

（貴州省農業(yè)科學院現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展研究所，貴州貴陽 550006）

蜂蜜作為主要的蜂產品之一，按照植物來源可分為單花蜜和多花蜜，其所含的化學成分多樣性與植物源密不可分[1,2]。蜂蜜中除大量葡萄糖、果糖等碳水化合物和水分外，還含有少量活性物質，包括氨基酸、酶類、黃酮類、礦物質等[3,4]。由于不同蜜源植物分泌的小分子萜類、黃酮類、酚酸類等次生代謝產物及礦物質成分存在差異，使得不同種類蜂蜜的口感、功效存在差異[5]。目前，檢測蜂蜜中活性物質含量、糖類理化指標是鑒定蜂蜜品種和品質的重要手段[6-8]。糖類和活性物質是蜂蜜在維持血糖和血脂正常水平、抗氧化等方面發(fā)揮作用的原因[9-11]。

非靶向代謝組學（Untargeted metabolomics）是目前最為常用的代謝組學研究手段，通過液相色譜-質譜聯(lián)用（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）、氣相色譜-質譜聯(lián)用（Gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS）等技術手段來篩選待測樣品中已知和未知代謝物的定量信息，來對生物現(xiàn)象進行總體認識[12-14]。近年來這一技術被廣泛應用于鑒定食品品質及產地、摻假摻雜等溯源工作中[15]。陳志燕等[16]采用GC-MS技術鑒定了枇杷蜜、益母草蜜等5種蜂蜜中共25種代謝物，其中枇杷蜜中糠醛含量最高，益母草蜜中油酸乙酯含量最高；孫雨安等[17]采用基于頂空固相微萃取GC-MS分析了7種蜂蜜中44種共有代謝物，主要成分脫氫芳樟醇的含量為6.86×10-3～1222.70×10-3μg/g。粟有志等[18]采用SPME-GC-MS檢測新疆地區(qū)沙棗蜜、棉花蜜等4種單花蜜，檢出144種代謝物，其中芳樟醇、2-(1,1-二甲基)-環(huán)己醇和聯(lián)苯為沙棗蜜的特征性成分，3-苯基丙烯醛、3-苯基-2-丙烯醇為棉花蜜的特征性成分。Jandri?等[19]研究了澳大利亞不同產地來源的蜂蜜，其單氯和多氯在蜂蜜之間存在差異。Georgios等[20]利用HRMS靶向和非靶向代謝組學對10種蜂蜜的酚類化合物分析，篩選出16個差異代謝物，其中脫落酸在楊梅蜜中含量最高。

我國西南地區(qū)是特色蜜源植物野薔薇和藍莓的主要生長地區(qū)之一。目前關于野薔薇蜜成分分析的相關文獻尚未見報道。貴州省是我國藍莓的最大種植區(qū)，是實現(xiàn)藍莓蜜商品化生產的唯一省份，前期對藍莓蜜的研究結果顯示，藍莓蜜的酸度偏高、易結晶，槲皮素、對羥基苯甲酸含量較高[21]，為進一步了解藍莓蜜的理化性質，還需要對藍莓蜜營養(yǎng)成分進一步分析。因此，本研究選擇野薔薇蜜、藍莓蜜為研究對象，以高品質的荊條蜜、野桂花蜜作為參考，利用GC-MS技術，根據(jù)代謝物的功能分類和代謝通路分析，在代謝水平上研究不同特色蜂蜜所含代謝物差異。本研究對豐富鑒別蜂蜜真假、溯源識別有重要意義，為確定特色蜂蜜藍莓蜜、野薔薇蜜特征性物質奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料藍莓蜜、野薔薇蜜、荊條蜜、野桂花蜜分別采集自貴州省丹寨縣、麻江縣、播州區(qū)、德江縣、息烽縣和銅仁市6地區(qū)，均為自然成熟封蓋中蜂蜂蜜，共13個樣本，每個樣本3個生物學重復。

1.2 實驗試劑與儀器

甲醇（CAS：67-56-1，HPLC級），CNW Technologies；JXFSTPRP-24研磨儀，上海凈信科技有限公司；YM-080S超聲機，深圳市方奧微電子有限公司；Forma 900 series離心機，Thermo Fisher Scientific；LNG-T98真空濃縮器，太倉市華美生化儀器廠；L-2-氯苯丙氨酸（CAS：103616-89-3，純度≥98%），上海恒柏生物科技；甲氧胺鹽（CAS：593-56-6，純度：AR），TCI；吡啶（CAS：110-86-1，純度：HPLC級），Adamas；DHG-9023A烘箱，上海一恒科學儀器有限公司；氯仿（CAS：67-66-3，HPLC級），Adamas；Agilent 7890氣相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用儀（配有Agilent DB-5MS毛細管柱），J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA。

1.3 實驗方法

1.3.1 代謝物提取

取10 mg蜂蜜樣本于2 mL EP管，加入1000 μL預冷的甲醇提取液，渦旋30 s；35 Hz研磨儀處理4 min，冰水浴超聲10 min，將樣本4 ℃ 12000 r/min離心15 min，取50 μL上清液于1.5 mL EP管中，每個蜂蜜樣本各取30 μL混合成QC樣本，在真空濃縮器中干燥，加入5 μL內標L-2-氯苯丙氨酸繼續(xù)干燥，之后向干燥好的代謝物中加入100 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽溶于20 mg/mL吡啶），輕搖混勻并放入80 ℃烘箱孵育30 min，后在每個蜂蜜樣品中加入100 μL BSTFA（含有1% TMCS，V/V）、混勻，于70 ℃孵育1.5 h，冷卻至室溫（25 ℃左右），向混合的樣本中加入5 μL FAMEs并溶于氯仿，隨機上機檢測。

1.3.2 上機檢測

Agilent 7890氣相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用儀配有Agilent DB-5MS毛細管柱（30 m×250 μm×0.25 μm），GC-TOF-MS具體分析條件為：以無分流模式注入1 μL等份蜂蜜樣本，氦氣用作載氣，前部入口流量為3 mL/min，通過色譜柱的氣體流速為1 mL/min。初始溫度為50 ℃并保持1 min，然后以10 ℃/min的速率升高至310 ℃，310 ℃恒溫保持8 min。注入、傳輸線和離子源溫度分別為280 ℃、280 ℃和250 ℃。電離電壓為-70 eV，在溶劑延遲6.25 min后，以每秒12.5個光譜的速率在m/z范圍為50～500的全掃描模式下測定蜂蜜樣本質譜數(shù)據(jù)。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用ChromaTOF軟件（V 4.3x，LECO）對質譜數(shù)據(jù)進行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析[22]。對物質定性工作中，使用了LECO-Fiehn Rtx5數(shù)據(jù)庫，包括質譜匹配及保留時間指數(shù)匹配。最后，將QC樣本中檢出率50%以下或RSD＞30%的峰去除[23]。使用Heatmap R R[24,25]包對測定的代謝物作聚類熱圖；藍莓蜜、野薔薇蜜、荊條蜜、野桂花蜜四種蜂蜜之間兩者間根據(jù)差異倍數(shù)、t檢驗的p值和OPLS-DA模型獲得的變量重要性投影（variable importance in project，VIP）評分，將VIP＞1，F(xiàn)C＞1、pvalue＜0.05的代謝物定義為差異代謝物（significant changed metabolites，SCMs），同時將得到的相應差異代謝物通過代謝通路數(shù)據(jù)庫KEGG Pathways（KEGG,www.genome.jp/kegg）進行注釋。

2 結果與討論

2.1 四種蜂蜜GC-MS數(shù)據(jù)質量、PCA分析和重復性評估

QC樣本TIC出峰保留時間、峰面積都重疊良好；內標在QC樣品中峰面RSD≤30%，其相對標準偏差為11.66%；QC樣本相關性≥0.9，顯示本次系統(tǒng)穩(wěn)定性、實驗方法、樣本質量均為良好，數(shù)據(jù)質量良好，可作進一步分析。

藍莓蜜、野薔薇蜜、荊條蜜、野桂花蜜4種蜂蜜的主成分分析中，第1主成分占58.71%，第2主成分占37.17%，總和為95.88%，第1、2主成分已包含不同蜂蜜的大部分物質信息（圖1a）。重復性評估采用斯皮爾曼等級相關系數(shù) r（Spearman Rank Correlation），同一樣本的3個生物學重復樣本的斯皮爾曼等級相關系數(shù)r2≥0.9，重復性良好，不同樣本之間樣本相關性不高（圖1b）。

圖1 樣本組內、組間PCA分析及相關性圖 Fig.1 PCA and correlation diagram within and between sample groups

2.2 四種蜂蜜的代謝物功能注釋

2.2.1 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋

由于蜂蜜中所含成分包含植物分泌的代謝物、蜜蜂加工過程的代謝物以及其它物質，因此，本次KEGG數(shù)據(jù)庫注釋選用的是所有物種數(shù)據(jù)庫進行注釋。其注釋結果顯示，本次所鑒定到的90個代謝物（見表1）在pathway level 2條目的top 20注釋信息繪圖以及注釋（圖2）。孫雨安等[17]分析的7種蜂蜜中共有的化合物僅有44種；Jose等[5]測定不同單花蜜中的氨基酸、蛋白質、總酚含量，含量差異使得不同蜂蜜在抗氧化、抑菌等方面存在差異。本次鑒定到的90個代謝物分別富集到了總覽，碳水化合物代謝和膜運輸?shù)饶K相關的210條信號通路上，其中總覽模塊有次級代謝物的生物合成（16個）、脂肪酸代謝（16個）、氨基酸的生物合成（16個）等9條通路；碳水化合物代謝模塊有肌醇磷酸代謝（10個）、氨基糖和核苷酸糖代謝（7個）、丙酮酸代謝（7個）等8條通路；膜運輸模塊有3條信號通路，分別為ABC運輸（7個）、磷酸轉移酶系統(tǒng)（PTS）（7個）、細菌分泌系統(tǒng)（7個）。對改善機體消化的重要物質進一步分析，消化系統(tǒng)模塊中脂肪消化與吸收（5個）、蛋白質消化與吸收（5個）等通路上有代謝物富集。綜上，蜂蜜中的所含的物質較為豐富，且所含的代謝物與物質代謝、氨基酸及其他有機物代謝密切相關。

圖2 KO pathway level 2條目top20注釋信息繪圖以及注釋 Fig.2 KO pathway level 2 entry top20 annotation information drawing and annotation

表1 代謝物名稱、分子量、保留時間、定性離子等信息 Table 1 Metabolite name, retention time, qualifier ion and other information

續(xù)表1

續(xù)表1

去甲腎上腺素（NE；ID：meta_159）同時富集在唾液分泌（1個）、胃酸分泌（1個）等通路；其中在內分泌系統(tǒng)模塊中NE、葡萄糖-1-磷酸（ID：meta_133）

同時富集到卵巢類固醇生成、雌激素信號通路、催產素信號通路等通路。Yu等[26]表明了兒茶酚胺類激素會影響微生物組、營養(yǎng)吸收及腸道固有的免疫系統(tǒng)；NE是天然的兒茶酚胺類激素，是Fe的載體，可促進體外微生物的生長、代謝，營養(yǎng)狀況和生物膜形成[27-29]。本次測定4種蜂蜜均檢出NE，這可能是蜂蜜能治療腹瀉和美容養(yǎng)顏的原因之一。并且NE富集到唾液分泌、胃酸分泌通路上，因此NE很可能是蜜蜂在蜂蜜釀造這一過程中分泌產生，這有待于進一步驗證，以作為真假蜂蜜判別的重要依據(jù)。

2.2.2 HMDB（Human Metabolome Database）數(shù)據(jù)庫注釋

HMDB數(shù)據(jù)庫注釋結果顯示，代謝物分別歸類到酚類（1個）、非金屬氧陰離子化合物（1個）、脂肪?；?個）、羧酸及其衍生物（2個）、有機氧化合物（5個）、吡啶及其衍生物（1個）6個分類。其中NE歸類到酚類上；麥芽糖（maltose；ID：meta_184）、海藻糖（trehalose；ID：meta_182）、葡萄糖-1-磷酸、肌醇（inositol；ID：meta_156）歸類到有機氧化合物上。說明蜂蜜中的酚類、有機氧化物等與人體代謝密切相關。

圖3 Top 20 class繪圖結果以及注釋 Fig.3 Top 20 class drawing results and comments

2.2.3 差異代謝物分析

2.2.3.1 OPLS-DA分析

利用差異分組的正交偏最小二乘法判別分析（ orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis，OPLS-DA），R（3.3.2）軟件包ropls計算的OPLS-DA模型得分顯示各組間R2X＞0.68、R2Y＞0.59、Q2Y都在0.50左右，認為是有效的模型（圖4a～f）。

圖4 OPLS-DA得分圖 Fig.4 OPLS-DA score chart

2.2.3.2 差異代謝物Veen分析

在不同蜂蜜樣本之間，共檢測出差異代謝物12種（圖5）。荊條蜜相比于藍莓蜜差異代謝物有4種，分別為2-酮丁酸（ID：meta_43）、分析物407（ID：meta_170）、脯氨酸（ID：meta_79）、麥芽糖，其中2-酮丁酸下調表達，其它物質上調表達。野薔薇蜜相比于藍莓蜜的差異代謝物有3個，分別為2-酮丁酸、分析物389（ID：meta_160）、硬脂酸（ID：meta_163）均為下調表達。Alissandrakis等[30]認為所檢測同一樣本單花蜜都存在某一化合物，在其它蜂蜜該化合物不存在或含量較少時，此化合物是該單花蜜的特征性物質。經過兩兩蜂蜜比較后的結果，在藍莓蜜中2-酮丁酸的含量顯著高于其它3種蜂蜜的含量，2-酮丁酸可初步確定為藍莓蜜中所含，目前，2-酮丁酸應用于食品添加劑的中文名稱為2-氧代丁酸，主要用于天然香味料。

圖5 不同組別的差異代謝物Veen圖 Fig.5 Veen diagram of different metabolites in different groups

野桂花蜜相比于藍莓蜜差異代謝物有6種，分別為肌醇（meta_156）、分析物407（meta_170）、乳糖2（meta_174）、乳果糖1（meta_175）、海藻糖（meta_182）、麥芽糖。除麥芽糖以外，其余物質都為下調表達。肌醇可降低膽固醇，在幫助體內脂肪的再分配以及供給腦細胞營養(yǎng)上，扮演重要的角色[31,32]，在藍莓蜜中硬脂酸、肌醇含量高于其它3種蜂蜜的含量，藍莓蜜可能在增強免疫力、護肝等效果優(yōu)于其它3種蜂蜜。

野薔薇蜜相比于野桂花蜜，檢測出1個未知的顯著下調表達代謝物，ID為meta_140；野薔薇蜜與荊條蜜的代謝物比較，未檢出差異顯著的代謝物。3-己烯二酸開環(huán)可得到山梨酸，山梨酸是國際上應用最廣泛的防腐劑之一，能有效抑制微生物生長、繁殖[33]。粟有志等[18]認為當某些揮發(fā)性物質雖然在所檢測的單花蜜中不完全存在，但其出現(xiàn)次數(shù)較高，在其他蜂蜜中不存在或存在時含量較低，也應將它確定為單花蜜的特征性物質。本次檢測中3-己烯二酸僅存在于野薔薇蜜中，因此，野薔薇蜜可能在防止食物發(fā)霉、變質方面具有更好效果，以及3-己烯二酸可確定為野薔薇蜜中所含。

已有研究表明麥芽糖具有排毒養(yǎng)顏，補脾柔肝，促進鈣、鎂、鋅等礦物質吸收的特性；乳果糖被稱為腸道益生菌的增生劑，緩解腸道菌群紊亂，促進腸道益生菌繁殖[34]。脯氨酸、麥芽糖、去甲腎上腺素、蔗糖這些物質同時富集到了碳水化合物的吸收與消化、蛋白質消化與吸收、脂肪消化與吸收等信號通路上，這可能是解釋蜂蜜具有美容養(yǎng)顏、促進消化吸收的原因之一。上述4種蜂蜜麥芽糖、乳果糖的含量順序為：野桂花蜜＞荊條蜜＞藍莓蜜＞野薔薇蜜，因此，在促進腸道蠕動消化吸收效果強弱順序可能為野桂花蜜＞荊條蜜＞藍莓蜜＞野薔薇蜜。海藻糖可穩(wěn)定人體細胞的細胞膜，與體內的蛋白質結合來保證皮膚水嫩，減少皺紋和色斑生成[35]；脯氨酸是身體中膠原蛋白和軟骨所需的氨基酸，幫助人體合成蛋白質[36]；海藻糖、脯氨酸的含量順序為：荊條蜜＞野桂花蜜＞藍莓蜜＞野薔薇蜜，因此，在促進蛋白質合成、結合效果強弱順序可能為野桂花蜜＞荊條蜜＞藍莓蜜＞野薔薇蜜。

2.2.3.3 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

藍莓蜜vs野薔薇蜜中僅有1個下調差異代謝物硬脂酸，分別富集到脂肪酸生物合成、植物次生代謝產物的生物合成等4條通路上。脂肪酸對于視覺、神經以及肝臟等方面具有重要作用[37,38]，相對于野薔薇蜜而言，藍莓蜜可能更有利于明目、保護肝臟等作用。野薔薇蜜與荊條蜜、野桂花蜜相比，所含的顯著差異代謝物，不具有ko富集功能。

研究表明人體對不同蜂蜜中的碳水化合物消化和吸收能力不同，碳水化合物在幫助促進人體內代謝物的消化吸收具有重要作用[39,40]。通過ko富集分析，藍莓蜜vs荊條蜜組有2個具有富集功能的上調差異代謝物，脯氨酸、麥芽糖分別富集到ABC運輸（2個）、代謝途徑（2個）、氨酰tRNA生物合成（1）等18條通路（表2）。藍莓蜜vs野桂花蜜組中3個具有富集功能的上調差異代謝物，肌醇、麥芽糖、海藻糖分別富集到代謝途徑（3個）、磷酸轉移酶系統(tǒng)（2個）、抗壞血酸鹽和醛酸鹽代謝（1個）等14條通路（表3）。荊條蜜vs野桂花蜜組中4個具有富集功能的下調差異代謝物，蔗糖、肌醇、脯氨酸、海藻糖分別富集在代謝途徑（4個）、次級代謝物生物合成（4個）、磷酸轉移酶系統(tǒng)（2個）等25條通路（表4）?？梢?，蜂蜜有助于人體內糖類、脂類物質的代謝及吸收，且不同蜂蜜所含碳水化合物在人體內的吸收和代謝有較大差異，這與Sancheztapia等[39]和Al-Waili等[40]結果一致。

表2 藍莓蜜vs荊條蜜差異代謝物富集前10 KEGG通路 Table 2 Top 10 KEGG pathways of differential metabolites enrichment between blueberry honey and vitex honey

表4 荊條蜜vs野桂花蜜差異代謝物富集前10 KEGG通路 Table 4 Top 10 KEGG pathways of differentiated metabolites enrichment between vitex honey and wild osmanthus honey

3 結論

本研究基于非靶向代謝組學對4種中蜂蜂蜜進行分析，共檢測到2-酮丁酸、海藻糖、肌醇、硬脂酸等12種差異代謝物與糖類、脂類、維生素類物質代謝與吸收密切相關，NE同時存在于4種蜂蜜中，且同時富集在唾液分泌、胃酸分泌、胰腺分泌等信號通路上，未來可作為真假蜂蜜判別的重要依據(jù)。其中藍莓蜜可能在增強免疫、保護肝臟等方面更為突出，更適合作為天然香料添加劑，2-酮丁酸可認為是藍莓蜜的特征性物質；3-己烯二酸獨特存在于野薔薇蜜中，初步可判定為特征性物質；根據(jù)差異代謝物顯著程度，本次檢測的4種蜂蜜在促進人體消化吸收、幫助蛋白質結合及合成的強弱順序可能為：野桂花蜜＞荊條蜜＞藍莓蜜＞野薔薇蜜。