蘇可盈，楊貴卓，戴龐聰，李莉，徐曉飛，張學(xué)武*

（1.廣州工商學(xué)院工學(xué)院，廣東廣州 510850）（2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510642） （3.東莞華發(fā)生物科技有限公司，廣東東莞 523000）

新型冠狀病毒SARS-COV-2是于2019年底開(kāi)始流行的一種急性呼吸道感染病毒?？茖W(xué)家們分離出導(dǎo)致該疾病的病原體，并指出它是一種新的冠狀病毒，屬于2003年流行的非典型肺炎病毒SARS-COV的同一病毒家族[1]。目前，藥物治療的研究主要在于尋找SARS-COV-2蛋白酶（MPro）的抑制劑[2,3]和SARS-COV-2棘突蛋白（S蛋白）的抑制劑[4]。其中，SARS-COV-2棘突蛋白是一種糖蛋白，它能在冠狀病毒表面上形成類(lèi)似于冠狀樣外觀[5]，它是冠狀病毒SARS-COV-2識(shí)別宿主細(xì)胞的主要驅(qū)動(dòng)力，負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞上的ACE2受體結(jié)合，并介導(dǎo)宿主細(xì)胞膜和病毒膜的融合從而感染宿主細(xì)胞[6]。本研究旨在應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)篩選出SARS-COV-2棘突蛋白的抑制劑。分子對(duì)接是藥物篩選常用的方法，該方法能模擬某些配體物質(zhì)與特定的受體蛋白結(jié)合模式，再根據(jù)計(jì)算物理化學(xué)參數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)其結(jié)合勢(shì)能，兩者的結(jié)合勢(shì)能越低，說(shuō)明配合體越穩(wěn)定，配體對(duì)蛋白質(zhì)活性的抑制越強(qiáng)[7,8]，目前，分子對(duì)接已被廣泛用于低聚肽藥物的篩選，學(xué)者們已應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)從蝦夷扇貝[9]、發(fā)酵大豆制品[10]、吞拿魚(yú)[11]中成功篩選出了抑制SARS-CoV-2活性的低聚肽。

石金錢(qián)龜（學(xué)名：Mauremys mutica），又稱(chēng)石龜、黃喉擬水龜，在分類(lèi)上隸屬龜鱉目、潮龜科、擬水龜屬，在我國(guó)華東、華南等地分布較廣，也常見(jiàn)于越南、日本等國(guó)家。龜肉在我國(guó)作為食療和藥用有著悠久的發(fā)展歷史，龜肉營(yíng)養(yǎng)豐富，可滋陰養(yǎng)顏，增補(bǔ)保健，延年益壽，入藥可治療痛風(fēng)、糖尿病、肺結(jié)核。龜肉中粗蛋白含量約為16.46%，其中必需氨基酸占40%，其氨基酸模式基本能滿足FAO/WHO所推薦的人體所需的氨基酸模式[12]。且多項(xiàng)研究表明，龜肉多肽有抗氧化[13]、抗腫瘤[14]等生理功能。

由此可見(jiàn)，從傳統(tǒng)應(yīng)用角度和現(xiàn)代研究視角均能體現(xiàn)龜肉具有提高抵抗力的相關(guān)功能，所以龜肉蛋白對(duì)新冠肺炎病毒的作用值得探究。而現(xiàn)存對(duì)于龜肉酶解的研究中，龜肉蛋白的水解度較低（僅為15%左右）[14,15]，且所得肽類(lèi)分子較大，這在一定程度上抑制了龜肉肽類(lèi)生物活性的發(fā)揮。本研究用復(fù)合酶酶解龜肉，通過(guò)工藝優(yōu)化最大程度獲得分子量較小的低聚肽，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)模擬龜肉低聚肽與新冠肺炎病毒S蛋白的結(jié)合，以探究龜肉低聚肽抑制新冠肺炎病毒的潛能。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

石金錢(qián)龜由廣東省東莞市華南協(xié)同創(chuàng)新研究院提供；氫氧化鈉、鹽酸，均為分析純，天津鼎盛鑫公司；木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，均為食品級(jí)，北京鴻潤(rùn)寶順科技有限公司；硼砂、十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛OPA，均為分析純，天津福晨公司；1,4二巰基蘇糖醇DTT、絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，均為色譜純，恒遠(yuǎn)博泰生物科技有限公司。

RT-6100全自動(dòng)酶標(biāo)儀，杜雷公司；AB104電子天平，瑞士梅特勒公司；數(shù)顯PH計(jì)，上海雷磁；KD-10N真空冷凍干燥機(jī)，鄭州科達(dá)；UV-1000紫外可見(jiàn)光光度計(jì)，上海儀電；HH-S21-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博訊；TD5臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)納赫特；JJ-2高速組織搗碎機(jī)，常州億通；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海雙旭；THZ-100恒溫振蕩培養(yǎng)器，上海赫田。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龜肉水解液的制備

龜肉蛋白的酶解工藝流程如下：

取肉→攪碎→調(diào)節(jié)料液比（1:6）→調(diào)節(jié)pH值→加酶→恒溫密封酶解→沸水浴滅酶→低溫高速離心→取上清液

將冷凍于-4 ℃的石金錢(qián)龜室溫解凍，剔骨去皮，保留龜肉，準(zhǔn)確稱(chēng)量龜肉，按料液比（1:6）加入蒸餾水，置于高速組織搗碎機(jī)攪拌至無(wú)相連龜肉纖維，制得龜肉原漿。取50 mL龜肉原漿于100 mL錐形瓶，用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)原液pH值，添加相應(yīng)的蛋白酶，用保鮮膜封口后于55 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)器保溫酶解，期間保持pH恒定。酶解結(jié)束后于沸水浴中保溫6 min，冷卻至室溫后于低溫高速離心機(jī)8000 r/min 15 min，取上清液冷凍保存，已備后續(xù)水解度的測(cè)定。

1.2.2 龜肉蛋白液水解度的測(cè)定

本文采用鄰苯二甲醛法（OPA法）進(jìn)行龜肉蛋白液水解度的測(cè)定，并作了適當(dāng)調(diào)整。OPA法測(cè)定步驟：標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定（ODcontrol）：將400 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到一個(gè)裝有3 mL OPA試劑的測(cè)試管中混合均勻（5 s）后精確靜置2 min后立即讀取340 nm的吸光值；空白試驗(yàn)（ODblank）：吸取400 μL去離子水參照標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定進(jìn)行；樣品測(cè)定（ODsample）：吸取400 μL樣品溶液參照標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定進(jìn)行。得出結(jié)果按公式（1）（2）（3）計(jì)算水解度。

式中：

C——稀釋倍數(shù)；

A——料液比0.167；

P——蛋白含量；

β——查表得0.40；

α——查表得1.00；

htot——查表得7.6。

1.2.3 酶組合的篩選

在參考現(xiàn)有研究[14,15]的基礎(chǔ)上，選擇了動(dòng)物蛋白酶解常用的風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶進(jìn)行探究，且該三種酶的最適pH值和最適溫度相近，便于酶解條件的控制。利用風(fēng)味蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:1、風(fēng)味蛋白酶:中性蛋白酶=1:1、木瓜蛋白酶:中性蛋白酶=1:1三種酶組合進(jìn)行酶解，酶解條件為：加酶量5%（m/V，兩酶總質(zhì)量/龜肉原漿）、pH 7、55 ℃、酶比例為1:1（酶解開(kāi)始時(shí)同時(shí)加入）、酶解時(shí)間5 h，測(cè)定水解度，確定最適的酶組合。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

取三份150 mL石金錢(qián)龜龜肉原漿，將酶配比設(shè)置為風(fēng)味蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:1、1:2、2:1，加酶量為3%、pH 7、55 ℃、酶解5 h，操作步驟按“1.2.1”，測(cè)定樣品水解度，確定水解度最高的酶配比。取四份150 mL石金錢(qián)龜龜肉原漿，將加酶量設(shè)置為1%、3%、5%、7%，采用最適的酶配比，其他反應(yīng)條件同上，進(jìn)行水解反應(yīng)，操作步驟按“1.2.1”，測(cè)定樣品水解度，確定最適的加酶量。取四份150 mL石金錢(qián)龜龜肉原漿，pH設(shè)置為5、6、7、8，采用最適的酶配比和加酶量，其他反應(yīng)條件同上，進(jìn)行水解反應(yīng)，操作步驟按“1.2.1”，測(cè)定樣品水解度，確定最適pH值。取七份150 mL石金錢(qián)龜龜肉原漿，酶解時(shí)間設(shè)置為2、3、4、5、6、7，采用最適的酶配比、加酶量和pH值進(jìn)行水解反應(yīng)，操作步驟按“1.2.1”，測(cè)定樣品水解度，確定最適水解時(shí)間。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)探究所得的最優(yōu)酶解條件的基礎(chǔ)上，對(duì)風(fēng)味蛋白酶占比、加酶量、pH、時(shí)間四個(gè)因素設(shè)置更細(xì)致的梯度條件，以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)探究。試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平表 Table 1 Factor and level for orthogonal experiment

1.2.6 UPLC-MS法分離龜肉低聚肽

利用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法分離龜肉低聚肽并鑒定低聚肽結(jié)構(gòu)。所用超高效液相色譜儀為T(mén)hermo Fisher Scientific TMQ Exactive，色譜柱為Aquity UPLC BEH C18色譜柱，粒徑1.7 μm，質(zhì)譜儀為組合型四級(jí)桿Orbitrap質(zhì)譜儀。A相為0.1%甲酸水溶液，B相為0.1%甲酸乙腈溶液，進(jìn)樣量20 μL，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣盤(pán)溫度10 ℃。洗脫參數(shù)設(shè)置為0 min：95% A相、5% B相；30 min：60% A相、40% B相；30.1 min：95% A相、5% B相；35 min：95% A相、5% B相。檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置：正離子模式；Sheath gas flow rate：45 L/min；Aux gas flow rate：15 L/min；Sweep gas flow rate：2 L/min；霧化電壓：3.50 kV；毛細(xì)管溫度：320 ℃；S-lens RF level：55.0；Aux gas heater temp：350 ℃；掃描范圍是200～3000m/z。獲得樣品的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖。

1.2.7 Peaks Studio解析低聚肽序列

使用Peaks Studio X軟件的DB search和de novo模塊對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行解析。DB search蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源為UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）Plukenetia volubilis物種，DB search解析參數(shù)設(shè)置為：Parent Mass Error Tolerance 20.0×10-6，F(xiàn)ragment Mass Error Tolerance 0.1 u，Max Missed Cleavages 100。De novo解析參數(shù)設(shè)置為Parent Mass；Error Tolerance 20.0×10-6，F(xiàn)ragment Mass Error Tolerance 0.1 u。篩選出可信度大于95%的低聚肽序列進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.8 Peptide Ranker生物活性評(píng)價(jià)

Peptide Ranker 是一種基于新型神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的生物活性肽預(yù)測(cè)服務(wù)器，用于預(yù)測(cè)低聚肽具有生物活性的概率[16]。低聚肽的生物活性用“Score”表示，數(shù)值越高，表示低聚肽的預(yù)測(cè)活性越高，選擇“Score＞0.5”的低聚肽進(jìn)行后續(xù)的分子對(duì)接。

1.2.9 石金錢(qián)龜?shù)途垭呐cSARS-Cov-2 S蛋白活性結(jié)構(gòu)域的分子對(duì)接

本研究用HPEPDOCK進(jìn)行分子對(duì)接。HPEPDOCK是一種新穎的Web服務(wù)器，可通過(guò)分層算法將蛋白質(zhì)-肽對(duì)接。HPEPDOCK并未進(jìn)行冗長(zhǎng)的模擬來(lái)精煉肽構(gòu)象，而是通過(guò)MODPEP程序生成的肽構(gòu)象的整體來(lái)考慮肽的靈活性[17]，HPEPDOCK Web服務(wù)器可從http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/獲得。先從PDB（https://www.rcsb.org/）中找出SARS-Cov-2病毒S蛋白的活性結(jié)構(gòu)，其編號(hào)為7DWZ，EMData來(lái)源為EMD-30890。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)設(shè)3組平行，數(shù)據(jù)采用x±SD表示，用Excel、SPSS 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶組合的篩選

復(fù)合酶水解結(jié)果如圖1所示，“風(fēng)味蛋白酶+木瓜蛋白酶”組石金錢(qián)龜肉的水解度最高，為24.12%，高于“中性蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶”組合（21.92%）和“木瓜蛋白酶+中性蛋白酶”組合（16.61%）。“木瓜蛋白酶+風(fēng)味蛋白酶”組合的水解度最高的原因可能是木瓜蛋白酶是內(nèi)切的巰基蛋白酶，且酶切位點(diǎn)具有非特異性[18]，使其酶切作用具備更多的可能性，從而能產(chǎn)生更豐富的短肽鏈。而風(fēng)味蛋白酶同時(shí)具有外切和內(nèi)切特性，酶切位點(diǎn)多樣，有利于短肽的生成，且已有研究表明其對(duì)水產(chǎn)品的酶解效果較好[18]。因此選擇“風(fēng)味蛋白酶+木瓜蛋白酶”組合進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 復(fù)合蛋白酶對(duì)石金錢(qián)龜肉水解度的影響 Fig.1 Effect of combination of emzyme on degree of hydrolysis

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)分析

2.2.1 酶配比對(duì)水解度的影響

風(fēng)味蛋白酶與木瓜蛋白酶的不同酶配比對(duì)水解度影響如圖2所示。由圖2可知，風(fēng)味蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:1時(shí)水解度最高，為25.43%，與風(fēng)味蛋白酶:木瓜蛋白酶=2:1時(shí)的水解度（24.81%）相近，但風(fēng)味蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:2時(shí)水解度明顯下降。所以，選取風(fēng)味蛋白酶:木瓜蛋白酶=1:1進(jìn)行后續(xù)研究。

圖2 復(fù)合酶的酶配比對(duì)水解度的影響 Fig.2 Effect of proportion of composite emzyme on degree of hydrolysis

2.2.2 pH值對(duì)水解度的影響分析

pH值對(duì)水解度影響如圖3所示。隨pH升高，酶解液的水解度呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH=6時(shí)，水解度最高，為23.16%，當(dāng)pH＞6時(shí)水解度持續(xù)下降，可能是堿性環(huán)境破壞了酶的空間結(jié)構(gòu)，亦可能是堿性環(huán)境抑制了酶活性，造成酶活性降低，從而影響水解過(guò)程[18]。

圖3 pH對(duì)水解度的影響 Fig.3 Effect of pH on degree of hydrolysis

2.2.3 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響分析

本試驗(yàn)酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響如圖4所示，結(jié)果顯示，龜肉酶解2 h～5 h的水解度逐漸增大，酶解時(shí)間為6 h時(shí)水解度最高，為24.82%，此階段酶的作用位點(diǎn)較多，且活性中心并未飽和，6 h后，水解度輕微下降至20%左右，從而選擇酶解時(shí)間6 h作后續(xù)研究。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 Fig.4 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

2.2.4 加酶量對(duì)水解度的影響分析

加酶量對(duì)水解度影響如圖5所示，加酶量在7%以下時(shí)，水解度隨加酶量的增加而呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明酶解開(kāi)始時(shí)，增加酶用量會(huì)增加酶與底物的接觸率，促進(jìn)水解反應(yīng)。當(dāng)加酶量為7%時(shí)，水解度最高，為27.78%，所以選擇加酶量7%作后續(xù)研究。

圖5 加酶量對(duì)水解度的影響 Fig.5 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)四個(gè)因素設(shè)置了更細(xì)致的水平梯度，對(duì)酶解條件進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化。由表1和表2可知，各因素對(duì)水解度影響大小順序?yàn)椋猴L(fēng)味蛋白酶占比＞pH值＞酶解時(shí)間＞加酶量。在本實(shí)驗(yàn)中，最優(yōu)方案為A3B1C1D1。則確定復(fù)合蛋白酶酶解石金錢(qián)龜肉的最佳工藝參數(shù)為：風(fēng)味蛋白酶:木瓜蛋白酶=7:3、加酶量為7%、pH為5.5、酶解時(shí)間為4 h，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得知此條件下的水解度為42.56%。該酶解效果大大優(yōu)于現(xiàn)有研究中單一酶的水解效果，如張永進(jìn)等[19]分別探究了復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)中華草龜龜肉和龜血的酶解反應(yīng)，所得水解度約為20%；徐杰等[18]使用風(fēng)味蛋白酶對(duì)珍珠龍膽石斑魚(yú)肉酶解，5 h后其水解度僅為9.99%；陶美潔等[20]用風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶等4種酶分別酶解貽貝蒸煮液，所得的水解度最大為13.98%?？梢?jiàn)，用單一酶對(duì)肉類(lèi)蛋白進(jìn)行水解時(shí)，水解度較低，且時(shí)間較長(zhǎng)。而李軍等[21]用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶等多種酶復(fù)配而成的復(fù)合蛋白酶對(duì)鰱魚(yú)骨膠原蛋白進(jìn)行水解，得到水解度高達(dá)49%，與本研究水解度測(cè)定的結(jié)果有一定相似性。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Table 2 Result of orthogonal experiment

2.4 HPLC-MS分離與de novo肽序列測(cè)定

利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)優(yōu)化后的酶解低聚肽進(jìn)行分離，可得質(zhì)譜圖（如圖6所示）。把質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Peak Studio 8.5軟件進(jìn)行de novo分析，可測(cè)得可信度（ALC）在50%以上的低聚肽序列共510條，肽鏈長(zhǎng)度介于“四肽”至“十六肽”之間，低聚肽占比為89.7%。其中“ALC＞95%”的低聚肽序列共20條，肽鏈長(zhǎng)度介于“四肽”至“七肽”之間，低聚肽占比為100%。低聚肽是指由2～9個(gè)氨基酸脫水縮合而成的短肽，分子量一般在1000 u以下，與多肽相比，低聚肽有溶解性好，性能穩(wěn)定，安全性高，更易吸收的特點(diǎn)。如二肽和三肽可以通過(guò)腸道內(nèi)的PepT1和PepT2肽類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)直接吸收[22]，四肽和五肽可以通過(guò)細(xì)胞旁路緊密連接途徑運(yùn)輸[23]，這樣的吸收方式消耗能量更小。

圖6 石金錢(qián)龜樣品的高效液相色譜-質(zhì)譜圖 Fig.6 HPLC-MS diagram of Mauremys mutica peptide

表3 De novo肽測(cè)序解析結(jié)果 Table 3 Peptide sequences determined by De novo

2.5 Peptide Ranker生物活性評(píng)價(jià)

利用Peptide Ranker平臺(tái)對(duì)“ALC＞95%”的20條低聚肽進(jìn)行生物活性預(yù)測(cè)，按分?jǐn)?shù)由高至低排列如下，Score＞0.5的低聚肽共6條，占總數(shù)的30%，篩選出Score＞0.5的低聚肽進(jìn)行后續(xù)研究，肽序列分別為：LDFFK、LDFFKAL、FRVL、AFRVL、AGGKPFQ、SPFRVT。

表4 肽序列的Peptide Ranker評(píng)分結(jié)果 Table 4 Peptide Ranker score of peptide sequences

2.6 龜肉低聚肽與S蛋白活性結(jié)構(gòu)域的分子對(duì)接

S蛋白是存在于SARS-CoV-2病毒表面的蛋白結(jié)構(gòu)域，S蛋白利用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）作為細(xì)胞受體，在感染期間介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞膜的融合，從而感染人體細(xì)胞[24]。由PDB（https://www.rcsb.org/）可知S蛋白的編號(hào)為7DWZ。該蛋白結(jié)構(gòu)域由A、B、C三條低聚肽鏈組成，肽序列總長(zhǎng)度為1283。利用HPEPDOCK服務(wù)器對(duì)“Peptide Ranker Score＞0.5”的低聚肽進(jìn)行分子對(duì)接，每個(gè)低聚肽的最佳對(duì)接模型如圖7所示。

圖7 肽序列與S蛋白分子對(duì)接構(gòu)象 Fig.7 Docking image of peptides and S protein

龜肉低聚肽與S蛋白的分子對(duì)接能模擬龜肉低聚肽對(duì)S蛋白的結(jié)合方式，Docking Score是指該復(fù)合體的結(jié)合能，Docking Score越小，說(shuō)明復(fù)合體越穩(wěn)定，則該龜肉低聚肽對(duì)SARS-CoV-2 S蛋白的潛在抑制能力越強(qiáng)。6條低聚肽的Docking Score如表5所示，由表可知，6條低聚肽與S蛋白均有高親和力（Docking Score＜-100）,其中LDFFK、LDFFKAL、FRVL、AGGKPFQ、SPFRVT與S蛋白具有極高親和力（Docking Score＜-140）。本團(tuán)隊(duì)前期以玉米、小麥、大豆、燕麥等7種植物為研究對(duì)象[25]，僅發(fā)現(xiàn)與SARS-CoV-2病毒親和力高的低聚肽（Docking Score＜-140）14條，且親和力最高的低聚肽VQVVN Docking Score僅為-152.4，其值高于本研究中的低聚肽LDFFKAL（Docking Score=-169.68），說(shuō)明本研究的石金錢(qián)龜?shù)途垭囊种芐ARS-CoV-2病毒活性的潛能更大。

表5 肽序列的Docking Sore結(jié)果 Table 5 Docking Sore of peptide sequences

此前，很多學(xué)者也發(fā)現(xiàn)了能抑制某些病毒的低聚肽序列。如：SainZ等[24]對(duì)抑制肽的研究中指出，有Wimley-White界面疏水性的低聚肽可以防止非典型肺炎病毒（SARS-CoV）融合宿主細(xì)胞膜的糖蛋白融合；Struck等[26]明確指出，六肽“YKYRYL”可以抑制SARS-CoV病毒與ACE2受體結(jié)合，從而防止細(xì)胞被感染；Zhao等[27]發(fā)現(xiàn)多肽“NGAICWGPCPTA FRQIGNCGHFKVRCCKIR”有較好的對(duì)抗SARS-CoV病毒和MERSCoV病毒的活性。

3 結(jié)論

本研究首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)摸索了石金錢(qián)龜龜肉蛋白的最佳酶解條件制備出了石金錢(qián)龜?shù)途垭?，其最佳酶解條件為：風(fēng)味蛋白酶:木瓜蛋白酶=7:3、加酶量為7%、pH為5.5、酶解時(shí)間為4 h，此時(shí)的水解度為42.56%，此水解度高于絕大多數(shù)同期的肉類(lèi)水解的相關(guān)研究。然后，把石金錢(qián)龜?shù)途垭挠肏PLC-MS分離，結(jié)果導(dǎo)入Peaks Studio進(jìn)行解析，可信度（ALC＞95%）較高的低聚肽共20條，均為低聚肽。經(jīng)過(guò)Peptide Ranker篩選得到6條低聚肽與SARS-COV-2棘突蛋白（S蛋白）進(jìn)行分子對(duì)接，低聚肽序列分別是LDFFK、LDFFKAL、FRVL、AFRVL、AGGKPFQ、SPFRVT，其與S蛋白均表現(xiàn)出高親和力（Docking Score＜-100），Docking Score在-138.50～ -169.68之間。其中，LDFFKAL與S蛋白親和力最高，Docking Score=-169.68。總的來(lái)說(shuō)，經(jīng)工藝優(yōu)化后，本研究制得了水解度較高的石金錢(qián)龜龜肉酶解物，且從中篩選出的石金錢(qián)龜?shù)途垭呐cS蛋白的親和力較高，有較強(qiáng)的抑制SARS-COV-2病毒作用的潛能，可作為SARS-COV-2病毒藥物篩選的重點(diǎn)研究對(duì)象。