劉晨，謝巖黎，曹榮耀，程思忠

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南省糧油食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450001）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種類雌激素類真菌毒素，與動(dòng)物內(nèi)源性雌激素β-雌二醇結(jié)構(gòu)相似，又稱F-2毒素，是一種酚的二羥基苯酸的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)[1,2]。ZEN不僅能夠污染玉米，小麥和大豆等糧食作物，而且能夠污染飼料，引發(fā)動(dòng)物中毒，造成食品安全的問題。ZEN會(huì)造成生殖毒性、遺傳毒性和免疫毒性等毒性作用，產(chǎn)生的毒性通過對(duì)機(jī)體的生殖功能和免疫機(jī)能等的抑制作用造成對(duì)動(dòng)物與人類的健康的危害[3,4]。目前ZEN經(jīng)常在食品和飼料中被檢測(cè)出，因此找到一個(gè)安全、高效去除該毒毒性的方法尤為重要。

糧食在農(nóng)田中、運(yùn)輸期間以及作為食品和飼料成品加工和儲(chǔ)藏期間，都有可能出現(xiàn)被ZEN毒素污染的情況。在我國大部分地區(qū)農(nóng)產(chǎn)品樣品中，ZEN污染情況嚴(yán)重，檢出率較高，而且由于ZEN熱穩(wěn)定性極強(qiáng)，不能通過常規(guī)處理完全清除[5]。因此ZEN可以在谷物類的成品食物中檢測(cè)到，比如面包或饅頭。武亭亭等[6]對(duì)糧食加工過程中ZEN的污染情況進(jìn)行調(diào)查，檢測(cè)結(jié)果顯示玉米研磨加工中ZEN毒素檢出率達(dá)34%；小麥粉中ZEN毒素檢出率超出74%。

迄今為止，國內(nèi)外對(duì)ZEN的脫毒方法主要包括物理法，化學(xué)法和生物法三大類[7,8]。物理法主要包括輻射法，特殊材料吸附法和色選法等，化學(xué)法主要是讓ZEN與堿，氧化劑，有機(jī)試劑等發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，將ZEN轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)，降低毒性。目前化學(xué)法主要包括雙氧水處理法，臭氧處理法，碳酸鈉浸泡法等。雖然物理法和化學(xué)法可以達(dá)到一定的脫毒效果，但其仍然存在著一些不足比如脫毒產(chǎn)物不確定，脫毒效果不顯著，也可能脫毒過程中損失許多重要營養(yǎng)物質(zhì)，化學(xué)脫毒方法的缺點(diǎn)有脫毒不徹底，成本較高等等。生物法可以解決上述理化脫毒中存在的問題，生物法是在一種溫和的環(huán)境下進(jìn)行脫毒，不僅不會(huì)造成食品和飼料營養(yǎng)物質(zhì)的損失，適口性的改變，也不會(huì)帶來有毒有害的化學(xué)物質(zhì)。生物法脫毒機(jī)理有兩種方式：一種為微生物菌體吸附毒素，達(dá)到脫毒目的，其脫毒過程是微生物菌體可以吸附真菌毒素，形成穩(wěn)定復(fù)合體，這一吸附方式的缺點(diǎn)是特異性較差，且過程是可逆的，受多種因素的影響；第二種脫毒方式是微生物在發(fā)酵過程中分泌了的代謝產(chǎn)物可以降解真菌毒素，微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物為胞內(nèi)酶、胞外酶或次級(jí)代謝產(chǎn)物，可以使ZEN的毒性減弱甚至降解成為無毒的化合物。而且微生物生長速度很快，種類繁多，基因資源豐富，降解真菌毒素潛力巨大[9-11]。目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)可降解ZEN的微生物主要有芽孢桿菌屬[12-14]、酵母菌屬[15]、乳酸菌屬[16]和紅球菌屬[17]等菌株，對(duì)不動(dòng)桿菌屬降解ZEN鮮有報(bào)道。

目前常見的對(duì)蛋白質(zhì)粗提取的方法為鹽沉法。鹽沉法最常見是逐步提高溶液中硫酸銨的濃度，使蛋白質(zhì)的濃度逐步降低形成沉淀，以達(dá)到對(duì)蛋白質(zhì)粗分離的目的。鹽沉法的缺點(diǎn)使鹽用量較大，容易造成蛋白失活。而單寧沉淀法是指單寧可以和蛋白質(zhì)形成一種不溶于水的復(fù)合物，1 mol的單寧可以和12 mol的蛋白質(zhì)結(jié)合[18]，之后找到一種合適的解析劑將蛋白質(zhì)從單寧-蛋白質(zhì)的復(fù)合物中解析出來。通常會(huì)選擇聚氧化乙烯、聚乙二醇和山梨糖醇作為解析劑實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的解析。曲麗麗等[19]對(duì)微生物發(fā)酵液進(jìn)行單寧沉淀后，使用了聚乙二醇作為解析液，成功的從沉淀中解析出了纖維素酶。

本研究旨在從微生物含量豐富的農(nóng)田土壤中，分離、篩選出可以有效降解ZEN的菌株，初步探究降解機(jī)理，并使用單寧-聚乙二醇法進(jìn)行粗蛋白的提取。為生物降解ZEN提供理論依據(jù)，為ZEN污染問題提供一種解決方案。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 樣品

采集河南省鄭州市、濮陽市周邊生長農(nóng)作物的土壤，共計(jì)14份樣品。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

ZEN標(biāo)準(zhǔn)品純度≥98%，上海源葉生物公司；單寧、聚乙二醇6000，上海生工生物工程股份有限公司；甲醇、乙腈色譜純級(jí)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，杭州濱和微生物有限公司。

富集培養(yǎng)基：蔗糖10 g/L，磷酸二氫鉀1.52 g/L，磷酸氫二鈉2.44 g/L，硫酸鎂0.20 g/L，硫酸銨0.50 g/L，胰蛋白胨5 g/L，瓊脂20 g/L（固體培養(yǎng)基）pH 7.2。

初篩無機(jī)鹽培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1.52 g/L，磷酸氫二鈉2.44 g/L，硫酸鎂0.20 g/L，硫酸銨0.50 g/L，瓊脂20 g/L（固體培養(yǎng)基）pH 7.2。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母浸粉5 g/L，瓊脂20 g/L（固體培養(yǎng)基）pH 7.2。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜，安捷倫科技有限公司；QL-861漩渦振蕩器，海門市林貝爾儀器制造有限公司；LDZ立式高壓蒸汽滅菌器，上海甲康療器械廠；霉菌培養(yǎng)箱，上海齊客科學(xué)儀器；雙功能氣浴恒溫振蕩器，上海萊特實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；氮吹濃縮裝置，天津奧特賽思斯儀器有限公司；冷凍高速離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ZEN的檢測(cè)方法

樣品中ZEN濃度經(jīng)二氯甲烷提取回收后甲醇復(fù)溶，使用高效液相色譜法測(cè)定，色譜柱安捷倫ZORABX Ecliupse Plus 95A C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：（水:甲醇=20:80）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測(cè)器：波長236 nm。

式中：

D——ZEN的降解率，%；

C0——空白對(duì)照組ZEN的濃度，μg/mL；

C——降解后ZEN濃度，μg/mL。

1.2.2 ZEN降解菌株的篩選

使用采集的土壤樣品，稱取10 g樣品于錐形瓶中，加入90 mL無菌生理鹽水，37 ℃恒溫振蕩3 h，取出后靜置30 min。吸取1 mL上清液于10 μg/mL ZEN的液體富集培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、160 r/min的恒溫氣浴振蕩器培養(yǎng)48 h。吸取100 μL 10 μg/mL ZEN涂布至無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，待毒素晾干后，吸取100 μL富集培養(yǎng)后菌液涂布至含毒素的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，放置霉菌培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察生長情況。將生長情況良好的菌落挑至LB固體培養(yǎng)基上，劃線傳代得到單一菌株。

將分離純化出的單一菌株挑至LB液體培養(yǎng)基中，于160 r/min、37 ℃恒溫發(fā)酵培養(yǎng)48 h，得到純培養(yǎng)物的發(fā)酵液。移取發(fā)酵液950 μL于離心管中，加入50 μL 100 μg/mL ZEN毒素，渦旋30 s混合均勻，使降解體系中ZEN的終濃度定為5 μg/mL，以無菌培養(yǎng)基與ZEN混合作為空白對(duì)照。將離心管放置于恒溫氣浴搖床中培養(yǎng)，條件設(shè)為37 ℃、150 r/min、48 h，3組平行實(shí)驗(yàn)。取3倍體積二氯甲烷萃取，渦旋振蕩2 min，棄去上層水相，將剩余二氯甲烷層放置于氮吹濃縮裝置中37 ℃恒溫緩慢吹干，吸取1 mL甲醇復(fù)溶殘余物，渦旋振蕩1 min，用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，打入進(jìn)樣瓶中，使用高效液相紫外檢測(cè)器檢測(cè)。其中降解率最高的命名為A.lwoffi.Haut.1。

1.2.3 ZEN降解菌株的鑒定

形態(tài)及生化實(shí)驗(yàn)鑒定：將A.lwoffi.Haut.1在LB固體平板上劃線，放置于37 ℃下培養(yǎng)24 h。觀察其菌落的形態(tài)。沾取少量菌落，涂至載玻片上，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察菌體顏色及特征。使用無菌針挑取A.lwoffi.Haut.1的純培養(yǎng)物，接種于不同種類的生化反應(yīng)管中，于37 ℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定糖、鹽類、MR、VP、吲哚實(shí)驗(yàn)等12種生理生化指標(biāo)，觀察并記錄結(jié)果。

16S rDNA鑒定：將A.lwoffi.Haut.1菌株劃線分離出單一菌落，純化培養(yǎng)后，對(duì)菌株的DNA進(jìn)行提取與擴(kuò)增。將得到的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析，將比對(duì)分析出的數(shù)據(jù)使用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 ZEN降解菌株降解ZEN的動(dòng)力曲線

取菌株發(fā)酵液950 μL與50 μL 100 μg/mL的ZEN混合，反應(yīng)體系為1 mL，毒素終濃度為5 μg/mL。混合后于160 r/min、37 ℃培養(yǎng)，分別在0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h測(cè)定ZEN降解率。

1.2.5 ZEN降解菌株降解ZEN活性物質(zhì)定位

將菌株發(fā)酵液在4 ℃、8000 r/min離心10 min，移取離心后的上清液于10 mL離心管中，放置4 ℃冰箱中保存，剩余沉淀菌體使用滅菌后的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗沉淀兩次后，再次使用PBS緩沖液重懸，制成菌懸液。將菌懸液放置冰上，置于超聲波細(xì)胞破碎器內(nèi)，超聲3 s，間隔3 s，持續(xù)15 min，然后12000 r/min冷凍離心20 min，取上清液用0.22 μm的抽濾器無菌抽濾得到濾液即為胞內(nèi)提取物。分別取5 mL上清液進(jìn)行121 ℃高溫加熱處理20 min，制得處理組1，加入蛋白酶K，濃度定為5 mg/mL，制得處理組2，加入5 mg蛋白酶K和0.05 g SDS制得處理組3，并對(duì)分別取950 μL菌株上清液、菌懸液、胞內(nèi)提取物和處理組1、2、3與50 μL ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)液置于滅菌的10 mL離心管中，旋渦30 s，使ZEN終濃度為5 μg/mL。氣浴搖床置于暗處，培養(yǎng)條件設(shè)置為150r/min、37 ℃、48 h，3組平行實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定降解率。

1.2.6 ZEN降解菌株降解酶的初步分離提取

取上清液100 mL于燒杯中，低溫條件下緩慢加入研磨后的硫酸銨，硫酸銨最終濃度為60%，放入4 ℃冰箱過夜，12000 r/min冷凍離心10 min獲得蛋白沉淀。沉淀重新溶解在5 mL磷酸（PB）緩沖液（20 mmol/L，pH 7.3）中，隨后，樣品用3 ku的透析袋4 ℃透析24 h，交換液為蒸餾水。取透析過的樣品950 μL與50 μL ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)液置于滅菌的10 mL離心管中，旋渦30 s，使ZEN終濃度為5 μg/mL。反應(yīng)48 h后，測(cè)定降解率。

分別吸取20 mL無細(xì)胞上清液于50 mL的離心管中，加入單寧使終濃度分別定為2、5、10、15、20 mg/mL，渦旋振蕩2 min，靜置提取2 h，4000 r/min冷凍離心10 min。取上清液950 μL與50 μL ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)液置于滅菌的10 mL離心管中，旋渦30 s，使ZEN終濃度為5 μg/mL。反應(yīng)48 h后，測(cè)定降解率，確定出單寧沉淀的最佳濃度。選擇最佳單寧濃度沉淀蛋白，然后分別加入6、8、10、12、14 mg/mL聚乙二醇溶液，渦旋振蕩2 min，靜置提取2 h，4000 r/min冷凍離心10 min。取上清液950 μL與50 μL ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)液置于滅菌的10 mL離心管中，旋渦30 s，使ZEN終濃度為5 μg/mL。反應(yīng)48 h后，測(cè)定降解率，確定聚乙二醇解析單寧-蛋白質(zhì)復(fù)合物的最佳濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2021軟件進(jìn)行分析

2 結(jié)果與分析

2.1 ZEN降解菌株的篩選

對(duì)14個(gè)土壤樣品進(jìn)行篩選，初篩得到14株菌株，可在ZEN為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，復(fù)篩得到6株菌株，可降解培養(yǎng)基中的ZEN。其中從河南省滎陽市小麥土壤中分離出的A.lwoffi.Haut.1降解率達(dá)到93.54%，其他菌株降解率如表1所示。圖1為A.lwoffi.Haut.1降解ZEN的HPLC色譜對(duì)比圖，由圖1可知，該菌株與ZEN共同培養(yǎng)48 h后，ZEN峰（5.21 min）顯著降低。因此，選擇A.lwoffi.Haut.1進(jìn)行后續(xù)的研究。

表1 分離來自不同樣品的降解ZEN的菌株 Table 1 Isolation of ZEN degrading strains from different samples

圖1 A.lwoffi.Haut.1降解ZEN前后的HPLC色譜對(duì)比圖 Fig.1 HPLC chromatographic contrast of A.lwoffi.Haut.1 before and after degradation of ZEN

2.2 ZEN降解菌株的鑒定

如圖2所示，A.lwoffi.Haut.1在LB培養(yǎng)基上涂布培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)：菌落形狀呈褶皺、低凸起、邊緣波浪狀，菌落顏色為不透明灰白色。革蘭氏染色結(jié)果為陰性菌，在顯微鏡下，呈短棒狀，符合不動(dòng)桿菌形態(tài)。采用各種細(xì)菌微量生化反應(yīng)管結(jié)果顯示，A.lwoffi.Haut.1能夠利用葡萄糖，其余葡萄糖酸鹽、枸椽酸鹽、甘露醇、木糖、山梨糖、蔗糖利用為陰性，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、MR實(shí)驗(yàn)和吲哚實(shí)驗(yàn)為陰性。與魯氏不動(dòng)桿菌生理生化特征相似度很高[20]。

圖2 A.lwoffi.Haut.1的菌落形態(tài)及革蘭氏染色情況 Fig.2 Colony morphology and Gram staining of A.lwoffi.Haut.1

對(duì)A.lwoffi.Haut.1的16S rDNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，序列如圖3所示全長約為1300 bp，測(cè)序后，將得出的結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析比對(duì)，結(jié)果顯示，該菌株與魯氏不動(dòng)桿菌的16S rDNA基因序列相似度高達(dá)99.90%。由圖4所示，系統(tǒng)發(fā)育樹中該菌株與魯氏不動(dòng)桿菌在同一分支上。通過生理生化特征和16S rDNA基因序列分析可初步鑒定A.lwoffi.Haut.1為魯氏不動(dòng)桿菌。

圖3 A.lwoffi.Haut.1 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳 Fig.3 A.lwoffi.Haut.1 strain 16S rDNA PCR product electrophoresis

圖4 A.lwoffi.Haut.1的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.4 Phylogenetic tree of A.lwoffi.Haut.1

2.3 ZEN降解菌株降解ZEN的動(dòng)力曲線

由圖5可知，隨著時(shí)間的增加，菌株發(fā)酵液的ZEN降解率不斷增大，在24 h時(shí)，降解率可達(dá)83.99%，在36、48、60和72 h時(shí)，ZEN降解率分別為90.46%、93.54%、94.06%和94.56%，在36 h之后，降解率穩(wěn)定在90%以上。因此，最佳反應(yīng)時(shí)間為36 h。

圖5 A.lwoffi.Haut.1降解ZEN的動(dòng)力曲線 Fig.5 Kinetic curve of ZEN degradation by A.lwoffi.Haut.1

2.4 ZEN降解菌株降解活性物質(zhì)的定位

由圖5可知，振蕩培養(yǎng)48 h后，A.lwoffi.Haut.1菌液的降解率為93.54%，同批次菌液制備出的無細(xì)胞上清液、菌懸液和胞內(nèi)提取物對(duì)ZEN的降解率分別為82.31%、21.33%和6.67%。對(duì)無細(xì)胞上清液進(jìn)行加熱（處理組1）、蛋白酶K（處理組2）和蛋白酶K+SDS處理（處理組3）。由圖5可知，處理組1、2和3對(duì)ZEN降解率分別為20.10%、41.67%和18.68%。魏單平等[13]分離出一株解淀粉芽孢桿菌，菌株的發(fā)酵液和上清液對(duì)ZEN降解率為95.60%和68.93%，經(jīng)加熱、蛋白酶K和蛋白酶K+SDS處理后，上清液降解活性下降，推斷降解活性物質(zhì)主要為胞外酶。本研究結(jié)果說明，A.lwoffi.Haut.1的降解活性物質(zhì)主要集中在無細(xì)胞上清液中。將無細(xì)胞上清液進(jìn)行不同處理后，降解率均出現(xiàn)明顯下降。因此推斷無細(xì)胞上清液中的降解活性物質(zhì)主要是菌體分泌到體外的某種蛋白，并具有一定的耐熱能力。具體主要降解活性物質(zhì)有待后續(xù)研究。

2.5 ZEN降解菌株降解酶的粗提取

鹽沉法中使用60%的硫酸銨沉淀得到的蛋白中ZEN降解酶含量較少或活性喪失比較嚴(yán)重，降解率為20.30%。

由圖6可知，隨著單寧濃度的不斷增加，單寧沉淀后的上清液對(duì)ZEN的降解率不斷下降，當(dāng)單寧濃度為15 mg/mL時(shí)，上清液降解率為12.33%，并在此之后降解率下降變的緩慢。結(jié)果說明，單寧濃度為15 mg/mL時(shí)，單寧對(duì)降解酶的沉淀最為完全。

圖6 A.lwoffi.Haut.1的菌液、培養(yǎng)上清液、菌懸液、胞內(nèi)提取物和處理組1、2、3對(duì)ZEN的降解率 Fig.6 A. loffi.Haut.1, culture supernatant, suspension, intracellular extract and treatment groups 1, 2 and 3 to the degradation rate of ZEN

單寧沉淀時(shí)，選定最佳濃度15 mg/mL，沉淀采用不同濃度的聚乙二醇溶液解析。由圖6可知，當(dāng)聚乙二醇溶液濃度為10 mg/mL時(shí)，解析出的上清液降解率為64.33%，之后隨著濃度增大，降解率出現(xiàn)了輕微下降的趨勢(shì)。曲麗麗[19]使用硫酸銨沉淀法、單寧-聚乙二醇沉淀法和超濾法進(jìn)行黑曲霉發(fā)酵液中纖維素酶的提取，對(duì)比結(jié)果顯示，硫酸銨鹽沉法容易導(dǎo)致酶失活，且鹽用量較大，超濾法中膜易受污染，單寧-聚乙二醇法有著方便和快捷的優(yōu)點(diǎn)，并且提取酶活率高達(dá)93.50%。本研究結(jié)果說明，硫酸銨鹽沉法很容易造成A.lwoffi.Haut.1降解酶的失活，因此采用單寧-聚乙二醇沉淀法提取降解酶，當(dāng)單寧濃度為15 mg/mL，聚乙二醇溶液濃度為10 mg/mL時(shí)，解析出的降解酶活性較高，隨著濃度增大，出現(xiàn)降解率下降的現(xiàn)象，初步推斷為，聚乙二醇的濃度過大導(dǎo)致影響降解酶的降解效果。

圖7 不同單寧濃度沉淀后與不同聚乙二醇溶液濃度解析后上清液的降解率 Fig.7 Degradation rate of supernatant after precipitation with different tannin concentration and resolution with different polyethylene glycol solution concentration

3 討論

相對(duì)比鄧桃等[21]篩選出的一株對(duì)ZEN降解率最高為85.77%的醋酸鈣不動(dòng)桿菌，魏單平等[13]分離出一株解淀粉芽孢桿菌，菌株的發(fā)酵液和上清液對(duì)ZEN降解率為95.60%和68.93%，本研究獲得的菌株對(duì)ZEN降解率最高為93.54%，降解效果較好，并且該菌株的無細(xì)胞上清液降解率為82.31%，證明上清液中胞外酶活性較高。因此，該菌株有利于后期對(duì)降解酶的提取。有研究表明不動(dòng)桿菌具有代謝多種有機(jī)化合物的能力，被認(rèn)為具有巨大的生物技術(shù)潛力[22-24]，并且已知不動(dòng)桿菌菌株通常容納大量的可移動(dòng)元素，包括不同大小的質(zhì)粒[22]。質(zhì)粒除了能夠進(jìn)行自我復(fù)制和傳播編碼模塊外，還可以攜帶不同數(shù)量的基因，使宿主細(xì)胞能夠在一種對(duì)生長具有致命性或限制性的環(huán)境中生存。

4 結(jié)論

本研究中所獲得的魯氏不動(dòng)桿菌為玉米赤霉烯酮的生物脫毒提供了新的研究材料，在本研究的基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和毒性研究，并且對(duì)降解粗蛋白進(jìn)行分離純化以及對(duì)降解基因進(jìn)行挖掘研究。

4.1 本研究中從河南鄭州市、濮陽市周邊耕地的土壤樣品中篩選出一株能夠高效降解ZEN的菌株A.lwoffi.Haut.1，經(jīng)形態(tài)、生理生化鑒定和16S rDNA鑒定為魯氏不動(dòng)桿菌。

4.2 該菌株在pH 7.2的LB培養(yǎng)基中37 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h后，對(duì)初始濃度為5 μg/mL的ZEN降解率為93.54%。

4.3 菌株的降解活性定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株的上清液具有較強(qiáng)的降解效果，通過對(duì)無細(xì)胞上清液的加熱、蛋白酶K和蛋白酶K+SDS，無細(xì)胞上清液降解ZEN能力下降明顯，結(jié)果表明，上清液中降解ZEN的活性物質(zhì)是某種或者多種未知的酶。

4.4 使用單寧-聚乙二醇法和鹽沉法對(duì)無細(xì)胞上清液進(jìn)行降解粗蛋白的提取，結(jié)果表明，60%硫酸銨沉淀得到的蛋白，ZEN降解率為20.30%，提取出有活性的降解酶較少。當(dāng)單寧濃度為15 mg/mL，聚乙二醇溶液濃度為10 mg/mL時(shí)，提取效果最好，提取出的上清液降解率為64.33%。在蛋白提取中，可能損失一定量的降解活性物質(zhì)，本研究證明提取出粗蛋白的上清液降解率與無細(xì)胞上清液降解率相比出現(xiàn)了一定的下降。