李燕青，傅婉玉，江矞穎，王元白，莊建龍

(福建省泉州市婦幼保健院 兒童醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心,泉州 362000)

染色體核型分析中出現(xiàn)衍生染色體、標記染色體、染色體嵌合等情況，可結(jié)合染色體微陣列技術(shù)(chromosomal microarray analysis,CMA)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)等分子檢測技術(shù)進一步檢測[1]。利用分子診斷技術(shù)可明確異常染色體的斷裂點及確定該片段的基因組成[2]，利于遺傳咨詢及幫助妊娠結(jié)局選擇。本文結(jié)合染色體核型和單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)技術(shù)對13號染色體長臂拷貝數(shù)異常的8例胎兒及其家系進行遺傳學(xué)分析，并隨訪妊娠結(jié)局，為遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧分析2017年7月1日至2021年7月1日于福建省泉州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心就診并同時行羊水/臍血染色體核型及SNP-array檢查的高危孕婦共2868例。孕婦高危因素包括夫妻雙方之一染色體異常、無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(non-invasive prenatal testing,NIPT)高風(fēng)險、胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常、胎兒超聲軟指標異常、孕婦高齡、唐篩高風(fēng)險等指征。行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦在檢測前均充分知情并簽署知情同意書。

1.2 細胞培養(yǎng)及染色體核型分析 采用超聲引導(dǎo)行羊膜腔穿刺術(shù)/臍血穿刺術(shù)，抽取30mL羊水或2mL臍血用于染色體核型分析和SNP-array檢測。20mL用于羊水細胞培養(yǎng)，羊水培養(yǎng)進行細胞收獲、染色體制備、染色，進行核型分析。羊水細胞共計數(shù)可分析核型30個，分析5個核型。1mL臍血用于臍血細胞培養(yǎng)，計數(shù)可分析核型20個，分析5個核型。染色體的命名依據(jù)人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制標準(ISCN 2020)。

1.3 SNP-array檢測 10mL羊水或1ml臍血樣本及夫妻雙方外周血各3mL送至第三方檢測公司(北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗所)進行SNP-array檢測。按試劑盒說明書，提取羊水細胞基因組DNA，經(jīng)稀釋消化、擴增、純化，將芯片上的探針與用生物素進行標記后的相應(yīng)待測片段進行雜交、洗滌、結(jié)合染色后放入Affymetrix公司GeneChip掃描儀掃描，采用Chromosome Analysis Suite(ChAS)v4.0軟件對掃描檢測熒光信號進行分析。根據(jù)ACMG指南，通過查詢DGV、OMIM、Pubmed、DECIPHER以及UCSC數(shù)據(jù)庫對拷貝數(shù)變異(copy number variants,CNVs)的臨床意義進行分析。

2 結(jié) 果

2.1 染色體核型結(jié)果 家系1胎兒染色體核型分析發(fā)現(xiàn)Y衍生染色體，父母染色體結(jié)果顯示該衍生染色體由于父親染色體t(Y;13)(q11.23;q32)導(dǎo)致。家系2胎兒存在13號衍生染色體，父母染色體結(jié)果顯示該衍生染色體由于母親inv(13)(p11.1q21.3)導(dǎo)致。家系3胎兒存在額外小標記染色體(marker)，遺傳自其父親(47,XY,+mar)，胎兒的奶奶核型亦為47,XN,+mar，見表1。家系4～8胎兒羊水染色體核型結(jié)構(gòu)及數(shù)目未見明顯異常。

2.2 SNP-array結(jié)果 SNP-array檢測結(jié)果顯示：例1為男性胎兒，在Y染色體Yq11.223q11.23區(qū)段存在3.3Mb片段的缺失，內(nèi)含CDY1(400016)、DAZ1(400003)、DAZ3(400027)、DAZ2(400026)等8個OMIM基因。胎兒在13號染色體13q31.3q34區(qū)段存在20.2Mb片段的重復(fù)，內(nèi)含ZIC2(603073),NALCN(611549)等70個OMIM基因。例2胎兒在13號染色體13q21.31q34區(qū)段存在50.4Mb片段重復(fù)，內(nèi)含ZIC2(603073)、EDNRB(131244)等104個OMIM基因。例3胎兒在13號染色體13q33.1q34區(qū)段存在11.9Mb片段的重復(fù)，內(nèi)含COL4A1(120130)、COL4A2(120090)、CHAMP1(616327)等37個OMIM基因。經(jīng)ACMG指南和ClinGen的共同共識，例1～3胎兒拷貝數(shù)變異判讀為致病性。例4～7胎兒在13號染色體13q12.12區(qū)段均存在1.4Mb片段的重復(fù)，內(nèi)含SGCG(608896)、SACS(604490)等7個OMIM基因，經(jīng)ACMG指南和ClinGen的共同共識，該片段重復(fù)臨床意義尚不明確。例8胎兒在13號染色體13q33.1區(qū)段存在1.0Mb片段的重復(fù)，涉及FGF14(601515)、ERCC5(133530)等6個OMIM基因。經(jīng)ACMG指南和ClinGen的共同共識，該片段重復(fù)的臨床意義尚不明確。見表1。

表1 13號染色體長臂拷貝數(shù)異常胎兒的產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局

2.3 父母驗證及妊娠結(jié)局隨訪 家系6～8父母驗證均提示胎兒13號染色體微重復(fù)遺傳自父親。家系8孕婦SNP-array結(jié)果提示14號染色體低比例嵌合。經(jīng)遺傳咨詢，家系1孕婦及家屬仍決定繼續(xù)妊娠，2021年8月剖宮產(chǎn)一男孩，電話隨訪家屬自述孩子生長發(fā)育良好。家系4于2019年12月經(jīng)陰分娩一男孩；家系6于2020年4月剖宮產(chǎn)一女孩；家系7足月剖宮產(chǎn)一女孩，出生體重4kg；家系8于2020年8月經(jīng)陰分娩一女孩，電話隨訪家屬均訴目前體健。家系2、3、5選擇終止妊娠。

3 討 論

標準型13-三體綜合征患者主要特征為嚴重智力低下、特殊面容、手足及生殖器畸形，并可伴有嚴重的致死性畸形，患兒1年生存率約8%。13號染色體長臂拷貝數(shù)異常的存活兒童在臨床上較罕見[3]，其重復(fù)片段大小與臨床表型有關(guān)。對13號染色體長臂拷貝數(shù)異常進行分析發(fā)現(xiàn)，大片段重復(fù)(大于5Mb)的病例可能與嚴重的發(fā)育遲緩和輕微的畸形特征有關(guān)，而微重復(fù)(5Mb以下)的病例出生后未發(fā)現(xiàn)異常表型[4-6]。

13號染色體長臂拷貝數(shù)異常是常見的染色體異常之一，父母一方多為染色體平衡易位或倒位的攜帶者，只有少數(shù)是新發(fā)異常[7]。本研究中有6例胎兒家系驗證提示親代染色體異常。平衡易位攜帶者一般表型正常，但其配子形成過程中，由于出現(xiàn)對位分裂、鄰位分離和3∶1分離，可形成18種配子，其中1種正常，1種平衡易位，其余均為部分三體或部分單體，可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常[8]。家系1夫婦因婚后不孕行夫妻雙方外周血染色體核型檢查發(fā)現(xiàn)丈夫染色體平衡易位，胎兒Y衍生染色體遺傳自父親，SNP-array顯示該Y衍生染色體在Yq11.223q11.23區(qū)段存在3.3Mb片段的缺失，位于AZFc區(qū)段，該缺失可導(dǎo)致男性無精、少精、不育[9]。同時，胎兒在13號染色體13q31.3q34區(qū)段存在20.2Mb片段的重復(fù)。已有相似和小于該片段重復(fù)與面部形狀異常，心臟畸形、胼胝體發(fā)育異常、不能生長發(fā)育、全面發(fā)育遲緩、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、椎體形態(tài)異常、耳朵異常、腭裂、小頭畸形(nsv492052、nsv916370、nsv532454、nsv2771437，Pathogenic)及低位耳、手異常、注意力缺陷、多動障礙、自閉癥、運動遲緩、智力障礙、癲癇發(fā)作、曳行步態(tài)(Patient:327125,Pathogenic)等臨床表型相關(guān)的病例報道。也有研究報道在自閉癥、面部畸形、智力障礙等臨床表型的患者中檢測到累及13q34區(qū)段的重復(fù)[4,10-11]。經(jīng)遺傳咨詢，孕婦及家屬仍決定繼續(xù)妊娠，目前嬰兒生后4個月，家屬自述孩子生長發(fā)育良好，但因年齡較小無法對其精神認知發(fā)育及生殖方面進行評估，建議密切關(guān)注嬰兒健康狀況。

家系2胎兒在13號染色體13q21.31q34區(qū)段存在50.4Mb片段重復(fù)，內(nèi)含ZIC2、EDNRB等104個OMIM基因，ZIC2基因單倍劑量不足會導(dǎo)致全前腦畸形和其他腦畸形[12]，但與遠端13號染色體的重復(fù)無關(guān)[13]。Jobanputra等[6]報道的8例13q重復(fù)患者包含ZIC2基因，均未出現(xiàn)全前腦畸形或腦畸形，該基因主要與血管畸形、癲癇、面容異常等臨床表型相關(guān)。經(jīng)家系驗證，孕婦及長女均存在13號染色體臂間倒位。臂間倒位也是常見的染色體畸變，攜帶者可形成4種類型的配子，1種正常，1種臂間倒位，2種為倒位染色體的部分缺失或重復(fù)，不平衡重組的配子受精后可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常[14]。孕婦曾足月剖宮產(chǎn)一男孩，出生后因先天性心臟病夭折；孕婦的哥哥生育一男一女，均智力低下。因未行進一步檢查，其不良孕產(chǎn)史及不良家族史是否與染色體結(jié)構(gòu)異常相關(guān)，尚不清楚。

聯(lián)合傳統(tǒng)細胞遺傳學(xué)檢測技術(shù)與先進的分子檢測技術(shù)，可對額外小標記染色體進行分析以明確其致病性[15]。家系3胎兒因無創(chuàng)13-三體高風(fēng)險、胎兒鼻骨發(fā)育不良行介入性產(chǎn)前診斷，羊水染色體核型為47,XN,+mar，即胎兒存在無法被細胞遺傳學(xué)技術(shù)識別的標記染色體，SNP-array明確了mar為13q33.1q34區(qū)段11.9Mb的重復(fù)，根據(jù)ACMG指南判讀為致病性拷貝數(shù)變異。ClinVar數(shù)據(jù)庫中查詢到已有相似片段的重復(fù)與面部畸形(nsv534153)、發(fā)育遲緩(nsv993433)等臨床表型相關(guān)的病例報道。也有研究報道，在自閉癥、面部畸形、智力殘疾等臨床表型的患者中檢測到累及13q34區(qū)段的重復(fù)[11]。對于胎兒染色體結(jié)構(gòu)重排或標記染色體，建議同一實驗室對家系成員進行外周血染色體核型分析，以便進行溯源和(或)對比分析[1]。家系染色體核型驗證提示胎兒父親及奶奶均存在mar染色體，胎兒的mar遺傳自表型正常的親代。Moscovich等[10]報道了1例36歲女性存在染色體13q34重復(fù)(位于本病例重復(fù)區(qū)域內(nèi))，表型為全面發(fā)育遲緩、面部畸形、身材高大、乳腺癌和肌張力障礙，該變異遺傳自表型正常的父親，同時患者的哥哥攜帶有相同重復(fù)但是表型正常，提示該片段重復(fù)外顯率不同。經(jīng)充分遺傳咨詢，孕婦及家屬選擇終止妊娠，再次妊娠經(jīng)羊水染色體核型及SNP-array檢查后生育1例健康女嬰。

產(chǎn)前診斷中檢出VOUS往往會給臨床遺傳咨詢帶來很大的挑戰(zhàn)，并給孕婦及家庭帶來很多壓力，甚至常常導(dǎo)致過度的終止妊娠[16]。家系4～7胎兒SNP-array芯片檢測結(jié)果均顯示在13號染色體13q12.12區(qū)段存在1.4Mb片段的重復(fù)，已有相似片段重復(fù)與發(fā)育遲緩(nsv529836,nsv931131,Uncertain significance)，自閉癥(nsv529838,Uncertain significance)，面部形狀異常、喂養(yǎng)困難、智力障礙(nsv529774,Uncertain significance)，宮內(nèi)發(fā)育遲緩(nsv869411,Uncertain significance)等臨床表型相關(guān)的病例報道。但是也有大于該片段重復(fù)而無臨床表型的病例報道(esv3892311,esv2422502)。該片段重復(fù)的臨床意義尚不明確(VOUS)。其中家系6、7經(jīng)驗證遺傳自表型正常的親代，經(jīng)隨訪家系4、6、7胎兒出生后均健康，因此本研究認為該片段的重復(fù)應(yīng)為偏良性可能。家系5因胎兒水腫選擇終止妊娠，因未進一步檢查，其致病原因未明確。

在高危妊娠中，NIPT可檢測幾乎所有唐氏綜合征、18-三體和13-三體病例，假陽性率很低[17]。本研究中家系2、3、8均因NIPT高風(fēng)險行產(chǎn)前診斷。NIPT技術(shù)的廣泛應(yīng)用緩解了產(chǎn)前診斷的壓力，但其存在一定的局限性，如少數(shù)因cfDNA含量低導(dǎo)致檢測失敗等[18]，家系7孕婦因兩次NIPT檢測均提示母體血液中胎兒cfDNA含量不足，無法出具報告。由于母血游離DNA來自胎盤和母體，因此除外NIPT技術(shù)因素，與產(chǎn)前診斷結(jié)果不一致的原因包括母體本身為該染色體的嵌合體、胎兒-胎盤染色體不一致、母體攜帶CNVs[19]。家系8孕婦NIPT結(jié)果提示14號染色體數(shù)偏多，羊水染色體核型及SNP-array均未發(fā)現(xiàn)胎兒存在14號染色體異常，家系驗證SNP-array提示孕婦疑似14號染色體低比例嵌合，因拒絕FISH檢查未能進一步確診。

綜上所述，SNP-array不僅能明確診斷13號染色體長臂拷貝數(shù)異常，還能明確其重復(fù)的范圍及涵蓋基因，有助于13號染色體長臂拷貝數(shù)異常的臨床咨詢。對于胎兒13號染色體長臂拷貝數(shù)異常臨床意義的判讀應(yīng)慎重，結(jié)合親代驗證情況及超聲等輔助檢查結(jié)果，有利于妊娠結(jié)局的選擇。