朱昕蕓，李春波，華克勤

(復(fù)旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200000)

宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌是臨床常見的婦科三大惡性腫瘤，也是女性最主要的死亡原因。據(jù)估計，在2020年，全球新增病例約130萬，其中有50%死亡。宮頸癌最常見，且發(fā)病有年輕化的趨勢。近些年，隨著宮頸癌篩查意識的提高和HPV疫苗的推廣應(yīng)用，宮頸癌的發(fā)病率明顯降低，但在我國及廣大發(fā)展中國家比例仍較高。子宮內(nèi)膜癌發(fā)生率僅次于宮頸癌，近年來，由于高脂高熱飲食和低運動量生活方式的影響，子宮內(nèi)膜癌在我國的發(fā)病率呈上升趨勢。卵巢癌發(fā)生率雖不如前兩者，但死亡率卻高居婦科惡性腫瘤之首。卵巢癌早期診斷困難，大多數(shù)患者在Ⅲ～Ⅳ期才被確診，患者的5年生存率約為30%。為了更深層次地理解腫瘤的生物學特點，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序以組織作為研究對象，研究結(jié)果是一個細胞群體的平均基因表達量，在各亞群的所有細胞中測量mRNA水平，難以描述細胞間的異質(zhì)性[1]。近些年，隨著單細胞測序技術(shù)的發(fā)展，可有效解決這一問題。與反映基因突變和平均表達水平的傳統(tǒng)批量RNA測序相比，scRNA-seq(single-cell RNA sequencing)測量的是單個細胞的多組學特征，這些scRNA-seq數(shù)據(jù)為腫瘤分子分型和精確治療提供支持證據(jù)[2]。本文就單細胞測序在婦科惡性腫瘤中的研究進展予以綜述,旨在探尋該技術(shù)在婦科惡性腫瘤的基礎(chǔ)研究及診治方面可能帶來的重要變革。

1 單細胞測序技術(shù)概述

單細胞測序技術(shù)是通過將組織或體液中的細胞群分離成單個細胞并對其遺傳物質(zhì)進行高通量測序分析的技術(shù)手段[3]。與傳統(tǒng)的組織測序不同，單細胞測序是將單個細胞中的核酸(DNA或RNA)物質(zhì)進行基因組或轉(zhuǎn)錄組的測序[4]，尤其適用于識別新標記、稀有亞群和進化模式[2]。

腫瘤是正常細胞經(jīng)歷一系列的基因突變以及突變在體細胞中的積累發(fā)展而成的。這些基因突變會導致細胞惡性分化，如無限增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成等。在細胞分化過程中，腫瘤細胞中的遺傳特性差異形成了復(fù)雜的腫瘤異質(zhì)性。同時，腫瘤所在的微環(huán)境也發(fā)生劇烈變化，影響著腫瘤的進展和治療效果。目前，單細胞測序技術(shù)已應(yīng)用于各種類型的惡性腫瘤中，同時也在婦科惡性腫瘤中得到廣泛應(yīng)用。

2 單細胞測序技術(shù)在婦科惡性腫瘤中的應(yīng)用

2.1 腫瘤的異質(zhì)性研究 所謂“腫瘤異質(zhì)性”，涉及到腫瘤患者之間的異質(zhì)性和腫瘤細胞之間的差異性。在腫瘤細胞內(nèi)既有致病的亞群，也有非致病的亞群，不同的細胞表現(xiàn)出不同的生物學功能。而腫瘤細胞間的遺傳和非遺傳性差異即被稱為腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[5]。

Regner等[6]利用scRNA-seq和單細胞水平轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)分析技術(shù)(scATAC-seq)分別對手術(shù)切除后立即處理的卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌進行單細胞下的匹配轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)可及性分析，揭示了腫瘤的細胞異質(zhì)性，并將染色質(zhì)可及性變化與基因表達定量地聯(lián)系起來。Li等[7]利用scRNA-seq技術(shù)對宮頸癌中單個細胞進行分析，通過比較腫瘤源性內(nèi)皮細胞和正常內(nèi)皮細胞的表達差異，揭示了不同代謝基因和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號通路在內(nèi)皮細胞惡變中所起的重要生物學功能。Hashimoto等[8]通過Nx1-seq技術(shù)對子宮內(nèi)膜樣腺癌組織進行單細胞轉(zhuǎn)錄組分析，通過比較子宮內(nèi)膜側(cè)(Endometrial side，E側(cè))和肌層浸潤側(cè)(Myometrial infiltration side，M側(cè))兩個部位的癌組織細胞群之間的差異，發(fā)現(xiàn)E側(cè)許多細胞對與腫瘤發(fā)生相關(guān)的特異性標記物呈陽性反應(yīng)，而作為預(yù)后標志物的浸潤性T細胞則在E側(cè)較少，由此可見具有高度惡性潛能的細胞存在于腫瘤組織的同一部位。Li等[9]利用scRNA-seq分析卵巢癌細胞間異質(zhì)性，并確定了1124個差異表達基因，這些差異表達的基因富集于多種與腫瘤相關(guān)的途徑，如代謝途徑、腫瘤途徑和PI3K-Akt信號通路。Olbrecht等[10]對高級別漿液性卵巢癌(high-grade serous ovarian cancer，HGSOC)進行單細胞測序，通過評估單個細胞中的分子亞型特征，預(yù)測不同分子亞型對預(yù)后的影響。非遺傳異質(zhì)性(non-genetic heterogeneity，NGH)由腫瘤細胞狀態(tài)間的相互分化所致，代表了腫瘤的適應(yīng)能力，其量化受到遺傳異質(zhì)性的干擾。Hu等[11]對6000個輸卵管上皮(fallopian tube epithelium，F(xiàn)TE)細胞的轉(zhuǎn)錄組進行調(diào)查，使用亞型特征對漿液性卵巢癌(serous ovarian cancer，SOC)的表達數(shù)據(jù)進行反卷積，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)存在大量NGH，闡明了癌細胞中遺傳自起源細胞的表型異質(zhì)性。

2.2 腫瘤的微環(huán)境研究 腫瘤微環(huán)境是指腫瘤或癌癥干細胞所生存的細胞環(huán)境，由許多具有一系列不同生物學作用的細胞類型組成，除了惡性細胞外，還包含淋巴管、腫瘤脈管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的細胞，以及脂肪細胞和成纖維細胞[12]。對腫瘤微環(huán)境中不同類型的細胞進行分析，可探究微環(huán)境中各種組分對腫瘤細胞生物學功能的影響，同時為腫瘤患者的免疫治療提供個體化指導方案。

Guo等[13]利用scRNA-seq技術(shù)對子宮內(nèi)膜癌(EC)和癌旁組織進行微環(huán)境分析，發(fā)現(xiàn)EC樣本中上調(diào)的基因主要與腫瘤生物學行為有關(guān)，如促進上皮細胞增殖及增強RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)的功能，提示腫瘤的惡性程度；瘤旁對應(yīng)物中表達水平較高的基因主要與蛋白水解的負調(diào)控及其相關(guān)的酶有關(guān)，而蛋白水解酶在腫瘤微環(huán)境中具有活性，被認為與腫瘤進展相關(guān)。Cochrane等[14]對子宮內(nèi)膜癌的單細胞測序發(fā)現(xiàn)了纖毛細胞標記物(DYDC2、CTH、FOXJ1、和p73)和分泌細胞標記物MPST在子宮內(nèi)膜腫瘤中表達，并與子宮內(nèi)膜癌患者的疾病特異性和總生存期呈正相關(guān)。Hornburg等[15]對15個卵巢腫瘤的微環(huán)境進行了scRNA-seq分析，描述了不同表型和功能的T細胞和骨髓細胞狀態(tài)，以及它們在腫瘤免疫表型(tumor immune phenotypes，TIPs)中的差異性富集。Launonen等[16]在BRCA1/2mut(BRCA1/2 mutation)HGSOC中發(fā)現(xiàn)了一個具有獨特表型和較強免疫監(jiān)視的腫瘤微環(huán)境，且BRCA1/2mut腫瘤中CD8+和CD4+T細胞增強的腫瘤免疫相互作用與增殖性腫瘤細胞亞群的預(yù)后有關(guān)。

癌相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAF)被廣義定義為位于腫瘤內(nèi)或腫瘤附近的成纖維細胞，已從前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌等多種惡性組織中分離得到，但在卵巢癌標本中相對少見[17]。Izar等[18]對晚期HGSOC患者惡性腹水的scRNA-seq研究顯示，惡性與非惡性細胞的細胞狀態(tài)和程序存在顯著差異。在非惡性細胞中可觀察到CAF的多樣性，其中炎性CAF大量表達IL-6和其他細胞因子，并可能促進腫瘤生長和耐藥性。

2.3 腫瘤的進展與轉(zhuǎn)移 單細胞測序技術(shù)能識別并表征一些在腫瘤進展與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細胞亞群及異?；?，包括他們在原發(fā)腫瘤中的定位，以及遺傳與非遺傳因素、內(nèi)在與外在因素對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響[19]。scRNA-seq可提供單個腫瘤細胞中基因表達和單核苷酸突變的全面信息，用以探究原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤之間的遺傳和轉(zhuǎn)錄異致性，從而分析某些腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與基因突變的關(guān)系，為探究并控制腫瘤的轉(zhuǎn)移提供新途徑[20]。

Gu等[21]利用scRNA-seq技術(shù)，通過比較宮頸癌和宮頸炎患者成纖維細胞和內(nèi)皮細胞中基因的差異性表達，發(fā)現(xiàn)在數(shù)種惡性腫瘤中曾報道的幾種癌癥標記基因——包括參與翻譯起始的基因RPL10和RPS3，與參與鐵代謝的調(diào)節(jié)基因FTLs——在宮頸癌的內(nèi)皮細胞中顯著升高，它們可通過各種代謝途徑參與腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移和侵襲。Olalekan等[22]對6例卵巢癌患者大網(wǎng)膜中分離的9885個細胞進行了單細胞RNA測序，并基于免疫特征將樣本分為高T細胞浸潤(高Tinf)組和低T細胞浸潤(低Tinf)組，發(fā)現(xiàn)在高Tinf組中巨噬細胞和B細胞簇具有獨特的轉(zhuǎn)錄亞簇，提示可能產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。Velletri等[23]提出從患者的卵巢癌轉(zhuǎn)移性腹水中分離單個細胞并將其作為3D培養(yǎng)物進行繁殖，通過scRNA-seq技術(shù)分析轉(zhuǎn)移性腹水細胞的組成，這種3D培養(yǎng)產(chǎn)物被稱為單細胞源性轉(zhuǎn)移性卵巢癌球體(single cell-derived metastatic ovarian cancer spheroids，sMOCS)。研究發(fā)現(xiàn),sMOCS能保留并擴增原始患者樣本中的關(guān)鍵亞群，并囊括了經(jīng)典2D培養(yǎng)中未出現(xiàn)的原始轉(zhuǎn)移特征，為卵巢癌的精確腫瘤學提供了強有力的工具。劉東滿等[24]通過石蠟切片提取單細胞懸濁液，分別檢測子宮系列病變組織中p15、MDM2表達情況。結(jié)果表明p15基因表達與EC的惡性程度呈正相關(guān)。因此，p15、MDM2蛋白的表達可作為EC的危險性評估、早期診斷及預(yù)后和復(fù)發(fā)判定的新途徑。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是子宮內(nèi)膜癌[25]、宮頸癌[26]和卵巢癌[27]發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移侵襲過程中重要的組成部分，也有望成為腫瘤治療的新靶點。Smit等[28]利用功能性單細胞測序(functional single cell sequencing，F(xiàn)UNseq)技術(shù)分析了位于2D上皮細胞團中心不同距離的細胞，發(fā)現(xiàn)位于最外緣的細胞富含能刺激EMT的配體和受體，如Ephrin、EGF和VEGF信號通路的組分，進而激活EMT過程。但婦科腫瘤EMT進程中的微環(huán)境和細胞異質(zhì)性尚有待研究。

2.4 腫瘤治療反應(yīng) 單細胞測序技術(shù)可提供腫瘤從化療敏感到耐藥進展的過程中腫瘤微環(huán)境發(fā)生的變化。Schefter等[29]通過比較化療前和化療后卵巢癌的scRNA-seq數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，與化療前樣本相比，化療后樣本中檢測到的癌癥上皮細胞類型、免疫和基質(zhì)成分存在差異?；谶@些細胞簇中的基因表達模式，可確定特定的信號通路和細胞類型，這些信號通路和細胞類型表明了在腫瘤微環(huán)境中用于產(chǎn)生對化療耐藥性的可能機制。

此外，單細胞技術(shù)可檢測復(fù)雜腫瘤中微小的耐藥細胞群，用于選擇合適的治療方案[30]。Zhao等[31]對卵巢癌(OC)、正常卵巢組織和胚胎組織采用10倍單細胞測序，發(fā)現(xiàn)PEG10在順鉑耐藥和復(fù)發(fā)組中較高，并證實了PEG10缺乏通過抑制腫瘤干細胞的自我更新信號傳導來抑制OC細胞增殖并影響OC細胞對順鉑的敏感性。Yu等[32]發(fā)現(xiàn)，EC中惡性細胞可能通過與耗盡的T細胞相互作用，誘導免疫抑制微環(huán)境，從而潛在地驅(qū)動對PD-L/PD-L1免疫治療的抵抗，且vCAF(vascular CAF)可抑制免疫細胞浸潤，是EC的獨立危險因素。

3 總結(jié)及展望

單細胞測序技術(shù)仍有較多不足之處。scRNA-seq的一個主要問題是由于測序樣本中雜質(zhì)含量過高和轉(zhuǎn)錄樣本的丟失過多會造成數(shù)據(jù)量較大、變異度較高和表達較復(fù)雜的樣本未被檢出[33]。此外，由于每個細胞中所含的DNA或mRNA量非常少，因此需先進行全基因組或全轉(zhuǎn)錄組擴增步驟，但完全的全基因組擴增難以實現(xiàn)，而未經(jīng)擴增的區(qū)域不能被測序；同時，兩個樣本中基因表達水平相同，但擴增效率可能不一致，從而導致擴增后表達譜產(chǎn)生偏倚[34]。

單細胞測序技術(shù)的不斷發(fā)展以及其與多領(lǐng)域技術(shù)和算法的結(jié)合將會為下一代基因組測序帶來一場新的革命，其在婦科惡性腫瘤中的廣泛運用極大地推動了該領(lǐng)域的研究和發(fā)展。通過對單個細胞基因組的測量，可較精準地探究腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展機制，評估腫瘤微環(huán)境中各種細胞的分布和活性，并從中發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，同時提供更有效的觀察腫瘤進展、治療反應(yīng)及預(yù)后的指標。