馮旸子，孫 茜，張曉宇，白會(huì)會(huì)，何淵慧，杜夢(mèng)瑤，范琳媛，劉朝暉*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院婦科，北京 100026；2.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院婦科，北京 100730)

細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis,BV)是育齡期婦女常見(jiàn)的下生殖道感染性疾病，厭氧菌和BV相關(guān)微生物(BV-associated bacteria,BVAB)過(guò)度繁殖(如陰道加德納菌、陰道阿托波菌等)導(dǎo)致菌群失調(diào)而引起。由于該病的復(fù)雜多微生物特質(zhì)，BV的抗菌藥物常規(guī)治療有效率僅60%，復(fù)發(fā)率高達(dá)30%～40%[1]。近期研究認(rèn)為，BV復(fù)發(fā)與細(xì)菌生物膜(bacterial biofilm,BF)的形成密切相關(guān)。盡管BV的病因?qū)W尚存在爭(zhēng)議，但多項(xiàng)研究認(rèn)為陰道加德納菌(Gardnerella vaginalis,GV)是BV的早期定殖者，而陰道阿托波菌(Atopobium vagina,AV)是常見(jiàn)的與加德納菌相關(guān)的微生物之一。陰道內(nèi)益生菌乳桿菌對(duì)于BV的抑制作用已有很多研究，而陰道內(nèi)的另一種常見(jiàn)微生物糞腸球菌對(duì)于BV的研究很少。多項(xiàng)人體研究中,糞腸球菌都被作為益生菌抑制病原菌的生長(zhǎng)、生物膜形成和毒素產(chǎn)生。為了更好地模擬陰道內(nèi)BV復(fù)雜的多菌環(huán)境，通過(guò)用加德納菌與阿托波菌共培養(yǎng)來(lái)代替單菌，并研究了陰道內(nèi)糞腸球菌對(duì)BV相關(guān)微生物形成的生物膜的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來(lái)源及診斷標(biāo)準(zhǔn) 糞腸球菌采用標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC-29212)；陰道來(lái)源加德納菌、阿托波菌，采用Nugent革蘭染色評(píng)分法作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，在首都醫(yī)科大學(xué)婦產(chǎn)醫(yī)院從初次臨床診斷為BV患者的陰道分泌物標(biāo)本中分離純化，使用16sDNA PCR擴(kuò)增并鑒定證實(shí)。

1.1.2 試劑 牛腦心浸液基礎(chǔ)培養(yǎng)基、葡萄糖粉劑、可溶性淀粉、MRS培養(yǎng)基均購(gòu)自solarbio life science；PBS緩沖液購(gòu)自Beijing Four-Ring Sunny Bioscience Co.LTD；結(jié)晶紫購(gòu)自Beijing Solarbio Science & Technology Co.LTD；95%酒精購(gòu)自天津市華東試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 不同比例陰道加德納菌和陰道阿托波菌的共培養(yǎng)情況 將復(fù)蘇和傳代培養(yǎng)的加德納菌和阿托波菌挑取單菌落，接種到改良BHI液。將加德納菌用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)制為0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?.5×108(CFU)/mL，將阿托波菌調(diào)制為0.5麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙海?∶1000稀釋達(dá)到1.5×105(CFU)/mL。用倍比稀釋法將加德納菌與阿托波菌的比例分別調(diào)為1000∶1，500∶1，250∶1，125∶1，62.5∶1，31∶1，16∶1，8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，0.5∶1。37℃、5%CO2靜置培養(yǎng)。

1.2.2 不同比例陰道加德納菌和陰道阿托波菌共培養(yǎng)的生物膜形成測(cè)定 分別在24、48、72h時(shí)將菌液吸出，PBS漂洗2次，室溫干燥；加0.2%結(jié)晶紫染色30min，PBS漂洗3次，室溫干燥；加95%酒精200μL脫色5min，將液體移到原96孔板右半部分，使用酶標(biāo)儀580nm波長(zhǎng)檢測(cè)洗脫液的OD值。以空白對(duì)照組OD值的平均數(shù)加3倍標(biāo)準(zhǔn)差值為臨界值(ODc)，待檢測(cè)微孔內(nèi)OD580值4 ODc分別代表形成生物膜能力為無(wú)、弱、中和強(qiáng)。

1.2.3 同等菌量的陰道加德納菌單獨(dú)培養(yǎng)、陰道阿托波菌單獨(dú)培養(yǎng)、加德納菌和阿托波菌1∶1共培養(yǎng) 將傳代培養(yǎng)的加德納菌和阿托波菌挑取單菌落，接種到改良BHI液，將菌濃度用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，再?.5麥?zhǔn)蠞舛鹊膶?duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌懸液(1.5×108CFU/mL)進(jìn)行1∶15稀釋達(dá)到1×107CFU/mL。將調(diào)整好的加德納菌懸液100μL/孔、阿托波菌懸液100μL/孔、50μL加德納菌與50μL阿托波菌/孔置于96孔板，同時(shí)加無(wú)菌鹽水100μL/孔、sBHI 100μL/孔作為實(shí)驗(yàn)組，用sBHI 100μL/孔加無(wú)菌鹽水100μL/孔、sBHI 100μL/孔作為對(duì)照組，37℃、5%CO2靜置培養(yǎng)。50μL加德納菌與50μL阿托波菌1∶1共培養(yǎng)時(shí)與單獨(dú)100μL加德納菌或100μL阿托波菌菌量相同，因此形成的生物膜量有可比性。生物膜形成測(cè)定方法同上。

1.2.4 制備含有糞腸球菌代謝產(chǎn)物的上清 將糞腸球菌傳代培養(yǎng)后3000r/min離心10min，取上清，經(jīng)0.45μm孔徑的濾器過(guò)濾，收集濾液即為含有糞腸球菌代謝產(chǎn)物的上清液。

1.2.5 加含糞腸球菌代謝產(chǎn)物的上清液后同等菌量的陰道加德納菌單獨(dú)培養(yǎng)、加德納菌和阿托波菌1∶1共培養(yǎng) 將調(diào)整好的加德納菌懸液100μL/孔、阿托波菌懸液100μL/孔、50μL加德納菌與50μL阿托波菌/孔置于96孔板中，同時(shí)加含糞腸球菌代謝產(chǎn)物的上清液作為實(shí)驗(yàn)組，用sBHI 100μL/孔加含糞腸球菌代謝產(chǎn)物的上清液作為對(duì)照組，37℃、5% CO2靜置培養(yǎng)。生物膜形成測(cè)定方法同上。

2 結(jié) 果

2.1 不同比例陰道加德納菌和陰道阿托波菌共培養(yǎng)的生物膜形成情況 加德納菌與阿托波菌的比例為1000∶1，500∶1，250∶1，125∶1，62.5∶1，31∶1，16∶1，8∶1，4∶1，2∶1，1∶1，0.5∶1時(shí)，未得出較為明顯的兩菌比例與生物膜形成量的線性關(guān)系。因此借鑒其他文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)方法，用加德納菌：阿托波菌為1∶1共培養(yǎng)初步探索。

2.2 同等菌量的陰道加德納菌單獨(dú)培養(yǎng)、陰道阿托波菌單獨(dú)培養(yǎng)及加德納菌和阿托波菌1∶1共培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況及生物膜成膜情況 同等菌量的加德納菌單獨(dú)培養(yǎng)、阿托波菌單獨(dú)培養(yǎng)及加德納菌和阿托波菌共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 相同菌量的加德納菌、阿托波菌單獨(dú)培養(yǎng)及加德納菌和阿托波菌1∶1共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線

阿托波菌幾乎不形成生物膜，50μL加德納菌和50μL阿托波菌共培養(yǎng)時(shí)形成的生物膜與同等菌量的100μL加德納菌單獨(dú)培養(yǎng)形成的生物膜無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間生物膜形成情況

2.3 含糞腸球菌代謝產(chǎn)物的上清液對(duì)加德納菌和阿托波菌1∶1共培養(yǎng)的成膜情況影響 含糞腸球菌代謝產(chǎn)物的上清對(duì)陰道加德納菌單獨(dú)培養(yǎng)和加德納菌與阿托波菌共培養(yǎng)的生物膜形成均有顯著抑制(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同組別生物膜形成情況(OD580nm)

3 討 論

3.1 BV的發(fā)生可能與陰道加德納菌、陰道阿托波菌等多菌種相互協(xié)作有關(guān) 在正常健康女性的陰道環(huán)境中有多種細(xì)菌存在，但這種菌群之間存在一種相互依賴和相互制約的生態(tài)平衡，一般不會(huì)致病。而B(niǎo)V時(shí)陰道內(nèi)的微生態(tài)平衡紊亂，乳桿菌數(shù)量減少，厭氧菌和BV相關(guān)微生物過(guò)盛繁殖(如陰道加德納菌、陰道阿托波菌、羞怯動(dòng)彎桿菌、普雷沃菌、具核梭桿菌、解脲支原體等)導(dǎo)致菌群失調(diào)。眾多厭氧菌相互扶持，繼而造成復(fù)雜混亂、難以修復(fù)、易反復(fù)的BV結(jié)局。多項(xiàng)研究認(rèn)為,BV中加德納菌和阿托波菌之間可能存在協(xié)同作用[2]。因此，本研究選擇加德納菌和阿托波菌模擬BV的真實(shí)狀態(tài)。

BV復(fù)發(fā)與細(xì)菌生物膜的形成密切相關(guān)。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中為適應(yīng)生存環(huán)境的變化而附著于無(wú)機(jī)材料或有機(jī)體的表面，由多糖、纖維蛋白等胞間基質(zhì)將微生物自身包繞其中而形成的膜狀結(jié)構(gòu)。細(xì)菌在形成生物膜后，由于致密的胞間基質(zhì)將細(xì)菌包被其中，人體宿主免疫系統(tǒng)不能有效清除病原，抗菌藥物也很難將其完全滅活，細(xì)菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性，易形成持續(xù)性的感染[3]。BV的生物膜是由加德納菌作為最初定植者，通過(guò)“搶先占領(lǐng)”的方式先黏附于陰道黏膜細(xì)胞表面，黏附性能差的細(xì)菌隨后黏附，最終在宿主細(xì)胞表面形成牢固的多菌生物膜，成為誘發(fā)BV的持續(xù)感染源[4-6]。因此，陰道加德納菌對(duì)BV的發(fā)生發(fā)展有重要作用。在BV患者的陰道標(biāo)本中，超過(guò)90%的上皮表面存在生物膜，加德納菌是其重要組成部分。生物膜底部主要由加德納菌組成，次要的BV相關(guān)菌種較少見(jiàn)。從生物膜的底部到頂部，加德納菌的數(shù)量逐漸下降，在33%的生物膜頂部無(wú)加德納菌的存在[4]。加德納菌有顯著高于其他BV相關(guān)厭氧菌的初始黏附力、毒力潛能和細(xì)胞毒性效應(yīng)[4]。加德納菌還可通過(guò)釋放細(xì)胞溶解素(vaginolysin，VLY)誘導(dǎo)陰道生物膜裂解，釋放唾液酸酶(sialidase,SLD)破壞陰道上皮細(xì)胞的保護(hù)性黏液層[4]。唾液酸酶被認(rèn)為是BV免疫抑制、免疫逃逸和復(fù)發(fā)的核心[7]。此外，加德納菌生物膜與浮游細(xì)胞相比，對(duì)過(guò)氧化氫和乳酸表現(xiàn)出更高的耐受性。生物膜增加了對(duì)乳酸菌的抵抗力，為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供了有利條件[8]。

阿托波菌是常見(jiàn)的與加德納菌相關(guān)的微生物之一，與BV患者的陰道分泌物增多、陰道pH升高和線索細(xì)胞的存在呈正相關(guān)，與晚期流產(chǎn)和早產(chǎn)也有一定的關(guān)系[2]。在BV的生物膜組成中，加德納菌占60%以上，阿托波菌占近40%[2]。但與加德納菌不同的是，阿托波菌很少作為健康女性的陰道菌群的一部分，被認(rèn)為是更有特異性的BV標(biāo)志物。在健康女性的陰道菌群中，60%可檢測(cè)到加德納菌，僅12%可檢測(cè)到阿托波菌；而在BV患者的陰道菌群中，99%可檢測(cè)到加德納菌，96%可檢測(cè)到阿托波菌?？梢?jiàn)阿托波菌對(duì)BV的特異性較加德納菌更高。此外，81%存在阿托波菌的女性可出現(xiàn)復(fù)發(fā)性BV，89%可出現(xiàn)復(fù)發(fā)性菌群異常；64%存在加德納菌的女性可出現(xiàn)復(fù)發(fā)性BV，73%可出現(xiàn)復(fù)發(fā)性菌群異常。當(dāng)加德納菌和阿托波菌同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，患者的Nugent評(píng)分較高，且BV復(fù)發(fā)率(83%)顯著高于僅存在加德納菌的患者(38%)[9]。

陰道微生物群有動(dòng)態(tài)性和復(fù)雜性的特點(diǎn)，多種微生物都可能對(duì)BV的發(fā)生發(fā)展有影響，這對(duì)我們構(gòu)建真實(shí)的多微生物體外生物膜模型有很大的挑戰(zhàn)。目前，大多數(shù)體外研究?jī)H涉及單種生物膜，且主要為加德納菌。本研究構(gòu)建了一個(gè)由加德納菌和阿托波菌兩種高度相關(guān)的BV相關(guān)微生物組成的體外生物膜，以更好地模擬BV的真實(shí)狀態(tài)。

本研究發(fā)現(xiàn)，加德納菌單獨(dú)培養(yǎng)24、48、72h時(shí)生物膜形成較好，而阿托波菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)幾乎不形成生物膜。但用同等菌量的加德納菌和阿托波菌共培養(yǎng)時(shí)，形成的生物膜與加德納菌單獨(dú)培養(yǎng)沒(méi)有顯著差異。表明兩種菌可能存在協(xié)同作用，但作用機(jī)制尚未清楚。研究表明，加德納菌與阿托波菌的協(xié)同作用機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)：(1)加德納菌和阿托波菌共培養(yǎng)時(shí)增強(qiáng)了其與陰道上皮細(xì)胞共聚集的能力。(2)在浮游生物單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，92%的阿托波菌在生長(zhǎng)48h后失去了其活性，但與加德納菌共培養(yǎng)時(shí)可一直保持其活性。(3)共培養(yǎng)時(shí)有更高的促炎因子水平，有更強(qiáng)的耐藥性，與加德納菌毒力相關(guān)的基因表達(dá)也顯著上調(diào)。如HMPREF0424-0821基因，可編碼一個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶，是生物膜維持所需的關(guān)鍵酶，在加德納菌、阿托波菌和普雷沃菌共培養(yǎng)時(shí)顯著上調(diào)[4,10]。(4)高濃度的加德納菌與阿托波菌共培養(yǎng)可消耗更多的氧氣，從而創(chuàng)造一個(gè)對(duì)革蘭氏陰性厭氧菌更有利的環(huán)境[11]。

3.2 陰道來(lái)源的糞腸球菌可能通過(guò)產(chǎn)生乳酸協(xié)助乳桿菌輔助BV治療 糞腸球菌作為乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)中的一員，被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵中。以往研究中，人們往往對(duì)產(chǎn)乳酸的桿菌較重視，而忽視了產(chǎn)乳酸的球菌的作用。球菌也可產(chǎn)生乳酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫等代謝產(chǎn)物，并有選擇性的抑菌作用。腸球菌是一種機(jī)會(huì)性病原體，能在免疫力低下的人群中引起感染。且腸球菌有多種毒力因子，對(duì)多種抗生素有耐藥性。因此腸球菌作為益生菌用來(lái)開(kāi)發(fā)新的藥品仍存在爭(zhēng)議。但研究表明，糞腸球菌雖然不是健康女性常見(jiàn)的陰道優(yōu)勢(shì)菌，但可在健康女性陰道中存在且不致病。84例通過(guò)革蘭染色、分泌物濕片鏡檢、Nugent評(píng)分和細(xì)菌真菌培養(yǎng)診斷為健康女性的陰道后穹窿和子宮頸外口拭子中，16例(11.1%)的優(yōu)勢(shì)菌為腸球菌[12]。一項(xiàng)對(duì)97例BV患者的研究表明,多種細(xì)菌與BV復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，包括斯尼斯菌、巨球形菌、普雷沃菌、阿托波菌、加德納菌等，表明各種陰道細(xì)菌間有相當(dāng)復(fù)雜的協(xié)同作用，可能有助于其持續(xù)存在。而乳桿菌和腸球菌與BV復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)。乳桿菌已在多項(xiàng)研究中證明與BV的治療結(jié)果顯著相關(guān)，并對(duì)多種BV相關(guān)微生物有抑制作用，是維持陰道健康的關(guān)鍵菌。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在豐度、復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)和細(xì)菌間相互作用等方面，腸球菌的表現(xiàn)都與乳桿菌極其相似。甲硝唑治愈組中，治療前和第7d腸球菌的比例與復(fù)發(fā)組相似，但在第30d腸球菌的比例在10%左右，復(fù)發(fā)組則幾乎無(wú)腸球菌?？梢?jiàn)良好的預(yù)后與腸球菌的增加有關(guān)。治愈組中，第7d和第30d時(shí)，40例患者的陰道菌群中大部分為乳桿菌(>50%)，腸球菌占小部分(<5%)。15例患者的陰道菌群中有大量腸球菌(>30%)，乳桿菌很少(<5%)?？梢?jiàn)腸球菌可抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，可能與產(chǎn)生乳酸有關(guān)，這對(duì)于體內(nèi)無(wú)足夠水平的乳桿菌而無(wú)法產(chǎn)生高水平乳酸的患者至關(guān)重要[13]。此外，糞腸球菌的代謝產(chǎn)物包括有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等物質(zhì)，在多項(xiàng)研究中都可抑制病原菌的生長(zhǎng)、生物膜形成和毒素產(chǎn)生。研究表明，糞腸球菌產(chǎn)生的腸球菌素對(duì)肺炎克雷伯菌分離株有顯著的抗菌活性，且腸球菌素的抗生物膜活性強(qiáng)于對(duì)克雷伯菌最有效的抗菌藥物——阿米卡星。糞腸球菌還可抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，可改變其產(chǎn)腸毒素的能力及其特定基因表達(dá)[14]。此外，糞腸球菌發(fā)酵上清可有效抑制多種致病菌，如單核增生李斯特菌、大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌、普通變形桿菌、霍亂弧菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌等的生長(zhǎng)，抑菌效果較好。其機(jī)制可能是腸球菌素作用于細(xì)胞膜并在膜上形成孔隙，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)成分泄露，破壞跨膜電位和pH梯度[15]。糞腸球菌已在多項(xiàng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)中被用于改善人類健康，包括可減少抗生素相關(guān)腹瀉的發(fā)生率、緩解腸易激綜合征、治療上呼吸道的復(fù)發(fā)性疾病、緩解鼻咽癌放化療后口腔黏膜炎、降低膽固醇水平、提高重癥顱腦損傷患者的免疫功能等。腸球菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的生物活性肽已被證明可通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)的活性發(fā)揮抗高血壓作用，可減少高血壓的風(fēng)險(xiǎn)因素并緩解癥狀。雖然與卡托普利等血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)藥物相比，腸球菌衍生的ACE抑制劑在體外的活性較低，但無(wú)干咳和血管性水腫等藥物副作用。腸球菌的發(fā)酵液還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化等活性，對(duì)α-葡萄糖苷有抑制作用，發(fā)揮其抗高血糖活性[16]。糞腸球菌含多種毒力因子，但毒力因子的存在并不能明確推斷出這些菌株會(huì)導(dǎo)致疾病。且糞腸球菌對(duì)多種常見(jiàn)抗生素表現(xiàn)敏感。本研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)株傳代培養(yǎng)后離心的上清液對(duì)加德納菌和加德納菌與阿托波菌共培養(yǎng)的生物膜形成有顯著抑制作用。這可能與糞腸球菌的代謝產(chǎn)物中存在乳酸、腸球菌素、過(guò)氧化氫、生物活性肽等物質(zhì)可以協(xié)助乳桿菌抑制其他厭氧菌的生長(zhǎng)和成膜有關(guān)，具體發(fā)揮抑制作用的成分還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

本研究在體外用加德納菌與阿托波菌共培養(yǎng)來(lái)代替單菌，更好地模擬了陰道內(nèi)真實(shí)的BV環(huán)境，結(jié)果顯示陰道內(nèi)糞腸球菌對(duì)BV相關(guān)微生物形成的生物膜有抑制作用，今后需體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究等來(lái)進(jìn)一步深入研究BV相關(guān)問(wèn)題。