謝 輝，李少璁，趙衛(wèi)國，朱緒偉，崔自學(xué)，張 軍，侯啟瑞*

(1.河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院，河南鄭州 450007；2.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212100)

家兔擁有獨(dú)特的消化系統(tǒng)，它們的食物為各種高纖維植物。桑()是多年生木本植物，桑科，桑屬，薔薇目。桑葉含有豐富的有機(jī)物、維生素和礦物質(zhì)，粗蛋白和碳水化合物含量顯著高于其他綠色牧草，與苜蓿等優(yōu)質(zhì)豆科牧草相當(dāng)，且消化率高，有很好的適口性，可作為家兔優(yōu)質(zhì)的木本飼料資源。研究發(fā)現(xiàn)，桑葉在家兔飼料中的添加量不能過高(10% ～ 15%)，否則會(huì)影響家兔的生長。為什么營養(yǎng)豐富的桑葉在家兔飼料中不能大量使用，目前還不清楚。有研究認(rèn)為，桑葉中較高的植物次生代謝物可能影響動(dòng)物機(jī)體物質(zhì)代謝，進(jìn)而影響桑葉的飼用量。

桑葉是一味含有多種植物次生代謝物的傳統(tǒng)中藥材，如黃酮、生物堿、多糖、甾醇、揮發(fā)油等，具有抗氧化、抗菌、抑制葡萄糖苷酶、抗高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)功能。這些植物次生代謝物在發(fā)揮治療效果的同時(shí)也影響動(dòng)物胃腸道的消化功能和對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)是桑葉中高度富集的一種強(qiáng)糖苷酶抑制劑，能抑制淀粉酶、蔗糖酶等糖苷酶的活性，減少動(dòng)物對(duì)二糖和葡萄糖的消化吸收。碳水化合物/糖是重要的可以轉(zhuǎn)化為能量的物質(zhì)，能量供應(yīng)不足會(huì)引發(fā)一系列生理反應(yīng)，并導(dǎo)致動(dòng)物體重下降，生產(chǎn)性能降低。研究發(fā)現(xiàn)，DNJ可以改善糖尿病大鼠的葡萄糖、脂類和氨基酸代謝，說明它可以影響動(dòng)物各種營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程，可能是限制桑葉在家兔飼料中使用量的因素之一。然而，大多數(shù)關(guān)于DNJ的研究集中在治療和預(yù)防肥胖和糖尿病方面，而很少關(guān)注其對(duì)動(dòng)物膳食營養(yǎng)物質(zhì)消化和胃腸功能的影響。為此，該試驗(yàn)以生長肉兔為研究對(duì)象，在其他各種營養(yǎng)素滿足需要的情況下，探討日糧添加不同水平桑葉DNJ對(duì)其營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率、消化酶活性和盲腸發(fā)酵的影響，從而判斷DNJ是否通過影響家兔腸道消化功能進(jìn)而影響桑葉的使用量，為合理利用桑葉飼料提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

桑葉DNJ購自西安普瑞斯公司，HPLC檢測(cè)DNJ含量≥98%；新西蘭白兔來自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)兔場(chǎng)。

75日齡體重相近的健康新西蘭白兔36只隨機(jī)分為 3組，每組12個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，處理組在基礎(chǔ)日糧中分別添加DNJ 0.4 mg/g(L-DNJ組)和2.0 mg/g(H-DNJ組)。基礎(chǔ)日糧參照NRC(1977)家兔飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制(表1)。各組日糧混合均勻后制成直徑4～6 mm顆粒。預(yù)試期7 d，正試期 42 d。試驗(yàn)兔單籠飼養(yǎng)，每天早晚各飼喂一次，自由采食和飲水，自然光照。試驗(yàn)期間每日觀察兔精神狀態(tài)、健康情況，統(tǒng)計(jì)腹瀉數(shù)和死亡數(shù)。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis)

養(yǎng)分表觀消化率。試驗(yàn)最后 7 d，每組選取體重相近的試驗(yàn)兔8只放入代謝籠，連續(xù)3 d收集糞樣。飼料和糞樣處理根據(jù)文獻(xiàn)[13]，檢測(cè)糞樣和飼料樣中干物質(zhì)、粗蛋白、粗纖維的含量，并計(jì)算養(yǎng)分表觀消化率，計(jì)算公式為：某養(yǎng)分表觀消化率= (食入的該養(yǎng)分的量-對(duì)應(yīng)糞中該養(yǎng)分的量)/食入的該養(yǎng)分的量×100%。

消化酶活性指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)束前12 h停料，不停水。電擊休克試驗(yàn)兔，切斷頸動(dòng)脈處死后立即打開腹腔，將十二指腸、空腸和盲腸分別結(jié)扎，按照解剖學(xué)特征小心剝離后取出腸段內(nèi)容物，液氮速凍后-20 ℃保存，用以測(cè)定消化酶活性。用比色法測(cè)定十二指腸和空腸的胰蛋白酶和淀粉酶活性，以及盲腸的纖維素酶活性。試劑盒購自南京建成生物工程研究所，按照說明書要求進(jìn)行檢測(cè)操作。

盲腸發(fā)酵參數(shù)。屠宰后迅速取出盲腸，用酸堿度計(jì)測(cè)定內(nèi)容物pH。將盲腸內(nèi)容物置于-20 ℃冰箱保存，按照黃鼎瑞等的方法測(cè)定氨態(tài)氮(NH-N)的濃度，按照魏宇超等的方法測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸。

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013處理后，用SPSS 20.0中ANOVA方法分析，采用Duncan進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

從圖1可以看出，日糧中含0.4和2.0 mg/g桑葉DNJ能夠顯著降低新西蘭白兔對(duì)干物質(zhì)和粗脂肪的消化率(<0.05)，對(duì)粗纖維的消化率無顯著影響(>0.05)；高劑量桑葉DNJ(2.0 mg/g)可顯著提高新西蘭白兔對(duì)粗蛋白的消化率。

由表2可知，日糧中含0.4和2.0 mg/g桑葉DNJ可顯著降低新西蘭白兔十二指腸淀粉酶活性(<0.05)，2.0 mg/g可顯著降低新西蘭白兔空腸淀粉酶活性(<0.05)。桑葉DNJ對(duì)新西蘭白兔十二指腸胰蛋白酶、空腸胰蛋白酶活性和盲腸纖維素酶活性均無顯著影響(>0.05)。

由圖2可知，日糧中含0.4和2.0 mg/g桑葉DNJ能顯著降低新西蘭白兔盲腸pH和氨態(tài)氮濃度，提高丁酸濃度(<0.05)，而含量達(dá)到2.0 mg/g可顯著提高盲腸乙酸濃度和總揮發(fā)性脂肪酸濃度(<0.05)。桑葉DNJ對(duì)新西蘭白兔盲腸丙酸濃度無顯著影響(>0.05)。

3 討論

營養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝有多種酶參與，酶的活性決定營養(yǎng)物質(zhì)的代謝速率。桑葉DNJ是一種天然葡萄糖類似物，能夠與活性糖基中間體形成競(jìng)爭，從而表現(xiàn)出對(duì)糖苷酶非常強(qiáng)的抑制活性，延緩腸道中碳水化合物降解速率，造成腸道葡萄糖吸收緩慢，進(jìn)而降低餐后血糖峰值。DNJ及其衍生物能強(qiáng)烈抑制包括糖化酶、α-淀粉酶和蔗糖酶的活性。DNJ還能夠通過激活JAK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和STAT3信號(hào)通路降低食欲，抑制動(dòng)物利用食物中的糖分和脂肪。因此，DNJ及其衍生物成為醫(yī)學(xué)上預(yù)防和治療2型糖尿病和肥胖癥的有效成分，在多種動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證。目前從動(dòng)物營養(yǎng)角度研究桑葉DNJ作用的文獻(xiàn)較少。該研究表觀消化率和消化酶活性數(shù)據(jù)顯示，桑葉DNJ能夠降低新西蘭白兔十二指腸淀粉酶活性和對(duì)干物質(zhì)和粗脂肪的消化率，減少動(dòng)物對(duì)能量物質(zhì)的攝入，研究結(jié)果與Hou等在皖西白鵝中的研究結(jié)果一致，也與DNJ在醫(yī)學(xué)上的研究結(jié)果一致。

研究數(shù)據(jù)還顯示，桑葉DNJ對(duì)家兔粗纖維消化率無顯著影響。在醫(yī)學(xué)上，DNJ能夠降低模型動(dòng)物的血糖異常升高，有效治療高脂血癥。因此推測(cè)DNJ可能對(duì)健康動(dòng)物碳水化合物消化影響有限。另外，家兔的粗纖維消化主要在盲腸進(jìn)行，而DNJ抑制糖苷酶活性的部位在小腸，這也可能是粗纖維消化率沒受到太大影響的原因。而該研究中粗蛋白消化率的提高可能是動(dòng)物機(jī)體因無法得到充足的糖分和脂肪，為了獲得更多能量而采用的補(bǔ)救措施，這與之前在小鼠上的研究結(jié)果一致。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note：Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)圖1 桑葉DNJ對(duì)新西蘭白兔主要養(yǎng)分表觀消化率的影響Fig.1 Effect of mulberry leaf DNJ on apparent digestibility of major nutrients of New Zealand white rabbits

表2 桑葉DNJ對(duì)新西蘭白兔消化酶活性的影響Table 2 Effect of mulberry leaf DNJ on digestive enzyme activity of New Zealand white rabbits U/g

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note：Different lowercase letters indicate significant difference(P<0.05)圖2 桑葉DNJ對(duì)新西蘭白兔盲腸發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of mulberry leaf DNJ on cecal fermentation of New Zealand white rabbits

盲腸發(fā)酵對(duì)家兔的腸道健康影響很大。盲腸發(fā)酵程度主要通過pH、氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等來衡量。Vasallo等體外模擬家兔盲腸發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)桑葉比紫花苜蓿產(chǎn)生更多短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸的增加能夠降低發(fā)酵液的pH。該研究中桑葉DNJ提高了盲腸總VFA產(chǎn)量，說明微生物活性較好，發(fā)酵過程劇烈；同時(shí)也說明有大量的碳水化合物聚集在盲腸部位，沒有在小腸中消化，這種情況與DNJ阻礙糖類物質(zhì)的降解有關(guān)。盲腸總VFA升高、pH降低，也說明DNJ能增加盲腸短鏈脂肪酸的產(chǎn)生量，是桑葉中有利于家兔盲腸菌發(fā)酵的一種成分。桑葉DNJ還降低了新西蘭白兔盲腸氨態(tài)氮的濃度，說明大部分含氮物在小腸被利用，DNJ能夠提高家兔氮的代謝量，減少氮排放，也與蛋白質(zhì)消化率提高的結(jié)果相一致。目前還鮮見有關(guān)桑葉DNJ對(duì)家兔盲腸發(fā)酵影響的報(bào)道。在桑葉粉飼喂家兔試驗(yàn)中，添飼桑葉粉15%～20%對(duì)家兔盲腸發(fā)育和發(fā)酵無顯著影響。

腸道微生物的代謝產(chǎn)物(如VFA)與微生物的功能、腸道健康狀態(tài)和宿主營養(yǎng)物質(zhì)代謝密切相關(guān)。乙酸有助于滋養(yǎng)腸道中產(chǎn)丁酸的細(xì)菌，促進(jìn)腸道有益菌群的多樣性，而丁酸是腸道細(xì)胞的重要能量來源。乙酸還可激活腸道某些受體，如肽YY和GLP-1，釋放某些抑制食欲的激素，減少能量攝入，調(diào)節(jié)脂肪吸收，在一定程度上達(dá)到控制體重的目的。該試驗(yàn)中，桑葉DNJ提高了家兔盲腸乙酸、丁酸的產(chǎn)量，與DNJ降糖減脂的藥用效果一致，同時(shí)也再次證明DNJ可通過調(diào)節(jié)腸道菌群發(fā)揮治療作用。

4 小結(jié)

營養(yǎng)豐富的桑葉在家兔飼料中不能大量使用，可能與桑葉中含量較高的植物次生代謝物DNJ有關(guān)。通過對(duì)食入不同水平桑葉DNJ的新西蘭白兔腸道消化功能分析，發(fā)現(xiàn)大劑量桑葉DNJ能夠降低家兔對(duì)脂肪和淀粉的利用，減少能量攝入，調(diào)節(jié)脂肪吸收，不利于動(dòng)物育肥，不可在飼料中大量使用；但桑葉DNJ能夠提高家兔對(duì)蛋白質(zhì)的利用率，減少含氮物排泄，且能增強(qiáng)盲腸微生物的發(fā)酵作用，保持腸道健康，因此建議可將桑葉作為調(diào)節(jié)家兔腸道健康和減少氮排放的功能飼料利用。