郭青青，許天馳，楊春雷，孫光偉，楊久紅，余 君，楊 勇*

(1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430062；2.湖北省煙草科學(xué)研究院，湖北武漢 430030)

煙堿又名尼古丁，分子式CHN，是煙草中的主要生物堿，是煙草和卷煙質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要因素。煙堿是吸煙成癮的關(guān)鍵成分，且對(duì)人體也有一定程度的損傷。如高淑芳等研究表明，煙堿可以輕易穿過血腦屏障和生物膜對(duì)人體造成影響，尤其是當(dāng)婦女處在妊娠期時(shí)，會(huì)導(dǎo)致新生兒易患病，神經(jīng)和智力發(fā)育也會(huì)受阻。同時(shí)，隨著煙草制品的大量生產(chǎn)和消費(fèi)，包括煙堿、氨基聯(lián)苯、萘胺、苯并(a)芘等有毒物質(zhì)在內(nèi)的煙草廢棄物進(jìn)入了環(huán)境，這些有害物質(zhì)無法回收利用，已經(jīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的環(huán)境問題。當(dāng)煙堿含量超過0.05%()時(shí)，這些廢物被歐盟規(guī)定為有毒有害物質(zhì)。如果處理不當(dāng)，這些廢物可能損害人類健康和環(huán)境。數(shù)據(jù)顯示，生產(chǎn)1 t卷煙需要排放60 t以上煙草廢水，且我國煙草制品中普遍存在煙堿含量過高的問題，因此對(duì)于環(huán)境和煙草制品中的煙堿降解是非常有必要的。

目前對(duì)于煙堿的降解主要集中在生物處理方面，與物理、化學(xué)處理方法相比，微生物降解菌在成本、效率和可持續(xù)性方面都具有優(yōu)勢(shì)。在生物降解煙堿的方法中，主要報(bào)道的煙堿降解菌多屬于假單胞菌屬()、節(jié)桿菌屬()、蒼白桿菌屬()、農(nóng)桿菌屬()。Wang等從煙草根際土壤中分離出一種高效降解的菌株sp.strain S33，它能在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下將1 g/L煙堿在6 h內(nèi)完全降解；張娟從湖南省的煙草土壤中篩得菌株ND，可在2 d內(nèi)將1 g/L液體培養(yǎng)基中的煙堿降解70.40%。截至目前，有關(guān)煙堿降解菌的研究工作尚處于篩選過程，較少地應(yīng)用到煙草制品及廢棄物的降解上。該研究從湖北恩施多年連作的煙田中分離得到一株能夠高效降解煙堿的菌株，并對(duì)菌株的降解能力進(jìn)行測(cè)定，優(yōu)化其培養(yǎng)環(huán)境，并嘗試應(yīng)用于煙草烘烤過程中，其研究成果不僅可以豐富降解菌株資源，并為降解菌應(yīng)用于煙草實(shí)際生產(chǎn)中提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

土壤來源。篩選高效煙堿降解菌的土壤樣本來自湖北恩施的煙草種植區(qū)。

培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：每1 000 mL蒸餾水加NaCl 10 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g，pH為7.0，于115 ℃滅菌20 min?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MSM)：每1 000 mL蒸餾水加(NH)SO2 g、MgSO0.2 g、CaCl·HO 0.01 g、FeSO0.001 g、NaHPO·12HO 1.5 g、KHPO1.5 g，pH為7.0，于115 ℃滅菌20 min。

試劑。煙堿標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC>99%)，購自安徽酷爾生物工程有限公司；甲醇色譜級(jí)(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%)，購自阿拉丁公司；其他試劑均為AR級(jí)試劑。

降解菌的篩選。將收集的土壤分別取10 g，放于90 mL滅菌去離子水中，180 r/min振蕩過夜獲得菌懸液。吸取10 mL的菌懸液接種到煙堿濃度為1 g/L的LB液體培養(yǎng)基中，溫度37 ℃，230 r/min培養(yǎng)3 d后再吸取菌懸液100 μL進(jìn)行第二次馴化，如此循環(huán)3次，參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行馴化。從終濃度的培養(yǎng)基中吸取菌懸液100 μL接種到煙堿濃度為1 g/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，溫度37 ℃，230 r/min培養(yǎng)2 d后，隨后吸取菌懸液100 μL接種到煙堿濃度為2 g/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，溫度37 ℃，230 r/min培養(yǎng)2 d，依次傳代接種至煙堿濃度為5 g/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，取最后一次的菌懸液100 μL 涂布LB固體培養(yǎng)基中，反復(fù)純化多次分離，挑選形態(tài)鮮明、菌落清晰的不同單菌落。將不同形態(tài)特征的單菌落采用甘油保存方式，保存于-80 ℃的超低溫冰箱中，備后續(xù)試驗(yàn)所用。

菌種鑒定。形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察及生理生化試驗(yàn)參照文獻(xiàn)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行。

分子生物學(xué)鑒定：通過DNA提取試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)得到目標(biāo)菌株的基因組，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：DNA模板5 μL，正反向引物各1 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，10×Extaq buffer 5 μL，Extaq 1 μL，加ddHO補(bǔ)足體系至50 μL。引物序列：27F(5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變形3 min；94 ℃變形1 min，61 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存30 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的大小為1 450 bp左右，并與GenBank中的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)。

培養(yǎng)條件對(duì)菌株降解能力的影響。在LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行降解菌株的活化，并轉(zhuǎn)移到LB液體培養(yǎng)基中作為種子液，檢測(cè)單因子條件下降解菌株降解能力。①溫度的影響。將降解菌種子液以2%的接種量接種到以煙堿為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中，煙堿的濃度為2 g/L，pH為7.0，不同溫度(28、37、45 ℃)，230 r/min培養(yǎng)36 h，每12 h取樣一次，利用HPLC檢測(cè)其降解情況。②初始pH的影響。將降解菌種子液以2%的接種量接種到以煙堿為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中，煙堿的濃度為2 g/L，不同pH(5.5、6.0、6.5、7.0、8.0)下，溫度37 ℃，230 r/min培養(yǎng)36 h，每12 h取樣一次，利用HPLC檢測(cè)其降解情況。③接種量的影響。將降解菌種子液以不同接種量(1%、2%、3%、4%)接種到以煙堿為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中，煙堿的濃度為2 g/L，pH為7.0，溫度37 ℃，230 r/min培養(yǎng)36 h，每12 h取樣一次，利用HPLC檢測(cè)其降解情況,降解率=(CK組峰面積-降解菌組峰面積)/CK組峰面積×100%。

培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長的影響。探究影響菌株生長的碳源(葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、乳糖、可溶性淀粉和麥芽糖)、氮源(蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、牛肉膏和玉米漿干粉)和無機(jī)氮源(醋酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨和硝酸鈉)對(duì)降解菌株的生長影響；將降解菌種子液以2%的接種量接種到以煙堿為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中，煙堿的初始濃度為2 g/L，pH為7.0，溫度37 ℃，230 r/min培養(yǎng)12 h，每2 h取樣一次，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的OD值，共6次。在MSM培養(yǎng)基中分別加入1、2、3、4、5、6 g/L煙堿，菌株P(guān)3a接種量為2%，每12 h采集一次，共5次，同樣用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處的OD值。

煙葉烘烤過程中降解菌的降解能力。在煙葉固化前，利用降解菌株降低煙堿含量。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株24 h，將發(fā)酵液離心濃縮蒸餾至濃度為5×10CFU/mL。最后，對(duì)每1 kg新鮮煙葉噴灑100 mL的細(xì)菌溶液，而對(duì)照組的蒸餾水用量相同。采用GB/T 23225—2008分光光度法測(cè)定煙葉煙氣固化后的煙堿含量。

菌株生物量的測(cè)定。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處OD值，則為菌株的生物量。有效檢測(cè)范圍為0～0.8，如果數(shù)值超過該范圍，則需要進(jìn)行樣品稀釋。

菌株降解率的檢測(cè)。所有樣品的煙堿濃度均采用C(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱檢測(cè)(HPLC)。流動(dòng)相為甲醇∶ 1 mmol/L硫酸=25∶75；流速0.6 mL/min；注入量20 μL；波長259 nm；溫度30 ℃。發(fā)酵液每6 h取樣一次，12 000 r/min離心10 min。然后在4 ℃處沉積取上清液。發(fā)酵過程完成后，用0.05 mol/L鹽酸稀釋20倍，最后用0.22 μm的濾膜過濾，用HPLC測(cè)定。

煙堿脫氫酶活性的檢測(cè)。將降解菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)。搖瓶發(fā)酵12 h后收集細(xì)菌，細(xì)菌緩沖懸液超聲破裂，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定576 nm處OD值。

采用SPSS 19.0軟件和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的描述統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

分離出1株以煙堿為碳源和氮源的菌株，命名為P3a。采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)了P3a和原有降解菌EA-17對(duì)初始濃度為2 g/L 煙堿的降解情況。結(jié)果表明(表1)，P3a在24 h對(duì)煙堿的降解率為70.03%，36 h為99.06%；EA-17在24 h對(duì)煙堿的降解率為54.14%，36 h為97.87%，P3a的降解能力較高于EA-17。

菌株P(guān)3a在LB固體培養(yǎng)基上的形態(tài)：菌落呈圓形，檸檬黃不透明，表面光滑，無暈環(huán)，無凸起(圖1a)。通過PCR的16S rRNA序列測(cè)定，并經(jīng)Blast程序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)3a與節(jié)桿菌sp.AD7(JF775581.1)的相似度為99%，表明菌株P(guān)3a為節(jié)桿菌屬，故命名為節(jié)桿菌P3a(sp.P3a)，并且在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株P(guān)3a也與sp.處于同一分支(圖1b)。同時(shí)，菌株P(guān)3a的16S rDNA的測(cè)序結(jié)果已上傳到GenBank數(shù)據(jù)庫，注冊(cè)登錄號(hào)為MK342527.1。

表1 不同菌株對(duì)煙堿降解峰的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果Table 1 Statistical results of nicotine degradation peaks of different strains

煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線和sp.P3a的生物量。通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD獲得了菌株P(guān)3a生長狀態(tài)，P3a的指數(shù)期為6～10 h，16 h后生物量沒有明顯變化，菌株P(guān)3a的最大生物量出現(xiàn)在12 h時(shí)，此時(shí)降解速率最為明顯(圖2)。

在煙堿的初始濃度為2 g/L，加入菌株P(guān)3a種子液的降解發(fā)酵液隨著發(fā)酵過程的變化而出現(xiàn)顏色變化，發(fā)酵溶液的顏色在12 h時(shí)為藍(lán)色，36 h為深藍(lán)色，48 h接近黑色，后轉(zhuǎn)為褐色，最后是淺褐色；推測(cè)是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了幾種代謝物(圖3)。

圖1 Arthrobacter sp.P3a的平板菌落(a)和系統(tǒng)發(fā)育樹(b)Fig.1 Plate colony (a) and phylogenetic tree (b) of Arthrobacter sp.P3a

圖2 降解菌株P(guān)3a 22 h內(nèi)的生物量變化Fig.2 Biomass changes of degraded strain P3a in 22 hours

不同條件下sp.P3a的煙堿降解率。通過HPLC檢測(cè)得到，在煙堿的濃度為2 g/L、pH為7.0、溫度37 ℃、230 r/min的條件下，菌株P(guān)3a在12 h的降解率達(dá)到36.45%，24 h的降解率達(dá)到70.03%，36 h的降解率高達(dá)99.06%(圖4)。通過HPLC檢測(cè)得到，當(dāng)pH為7.0時(shí)，煙堿的降解效果最好，在pH為5.5和8.0時(shí)，煙堿的降解率較低，因此，菌株P(guān)3a對(duì)煙堿降解的適應(yīng)性pH為6.5～7.0(圖5a)。圖5b顯示，菌株P(guān)3a在45 ℃時(shí)不能生長，在28和37 ℃降解36 h時(shí)，降解率基本相同，但在12～24 h 28 ℃比37 ℃條件下降解率高。因此，P3a降解煙堿的最佳溫度為28 ℃。圖5c顯示，當(dāng)接種量為1%時(shí)，其接種速度明顯慢于其他3種接種量；其余3種接種量的降解率相似，其中4%略高于3%和2%。因此，當(dāng)接種量為2%時(shí)，就足以降解2 g/L的煙堿。

圖3 煙堿降解發(fā)酵液的顏色變化情況Fig.3 Color change of the fermentation liquid of the nicotinic acid

圖4 36 h菌株P(guān)3a的降解率情況Fig.4 Degradation rate of strain P3a at 36 h

不同培養(yǎng)條件下sp.P3a的生物量。以葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、乳糖、可溶性淀粉和麥芽糖作為碳源(1%)，與無碳源的空白對(duì)照(CK)相比，所有碳源都能促進(jìn)菌株P(guān)3a的生長；當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，該菌株的生長條件最好，因此選擇其作為發(fā)酵培養(yǎng)的碳源(圖6a)。進(jìn)一步的試驗(yàn)分析表明，8.5 g/L葡萄糖是最佳含量。以蛋白胨、酵母浸粉、酵母膏、牛肉膏和玉米漿干粉作為有機(jī)氮源(0.5%)，當(dāng)添加玉米漿干粉時(shí)，P3a的生物量最大，因此在發(fā)酵培養(yǎng)中采用玉米漿干粉作為有機(jī)氮源(圖6b)。進(jìn)一步分析表明，采用2.5%玉米漿干粉可達(dá)到有機(jī)氮的最佳濃度。在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入醋酸銨、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨和硝酸鈉作為無機(jī)氮源(0.05 mol/L)，與CK組相比，無機(jī)氮源對(duì)菌株P(guān)3a的生長沒有顯著影響；在這幾種無機(jī)氮源中，硝酸銨的添加使得菌株P(guān)3a的生物量相對(duì)最大，因此，選擇硝酸銨作為無機(jī)氮源(圖6c)。

由圖6d可知，低濃度的煙堿(1～2 g/L)菌株P(guān)3a的長勢(shì)很好，在煙堿濃度較高的情況下，長勢(shì)較為緩慢，在5 g/L煙堿作用下仍能良好生長，6 g/L煙堿會(huì)抑制P3a的生長。由此可見，菌株P(guān)3a對(duì)煙堿的耐受性很高，能承受較高濃度煙堿的環(huán)境，在煙堿降解的實(shí)際應(yīng)用中能很好發(fā)揮生物性能。

圖5 pH(a)、溫度(b)和接種量(c)對(duì)菌株P(guān)3a煙堿降解的影響Fig.5 Effects of pH (a),temperature (b) and inoculum size (c) on nicotine degradation of strain P3a

注：a.不同碳源；b.不同有機(jī)氮源；c.不同無機(jī)氮源；d.不同濃度煙堿 Note:a.Different carbon sources;b.Different organic nitrogen sources;c.Different inorganic nitrogen sources;d.Different concentrations of nicotine圖6 不同培養(yǎng)條件下菌株P(guān)3a生物量變化Fig.6 Biomass changes of strain P3a under different culture conditions

將P3a和EA-17分別接種于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基和最優(yōu)培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果表明(圖7)，LB培養(yǎng)基中尼古丁脫氫酶的平均活性為3.12±0.41，最優(yōu)培養(yǎng)基的平均活性為9.01±0.63，其中菌株P(guān)3a的尼古丁脫氫酶活性高于菌株EA-17。

采用GB/T 23225—2008分光光度法測(cè)定煙葉煙氣固化后的煙堿含量，結(jié)果表明(表2)，菌株P(guān)3a對(duì)煙堿的降解率明顯高于空白對(duì)照，降解率達(dá)到55.11%。

3 討論與結(jié)論

從煙田土壤中分離到1株能夠利用煙堿作為唯一碳源和氮源的菌株sp.P3a，經(jīng)菌種鑒定為節(jié)桿菌屬。近年來，煙堿降解菌的報(bào)道很多，有些菌屬的降解途徑已比較明確，特別是節(jié)桿菌屬。節(jié)桿菌屬的降解途徑是吡啶途徑，即先從吡啶環(huán)的羥基化開始，經(jīng)一系列的酶促反應(yīng)最終生成2,3,6-三羥基吡啶進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán)，同時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色素，該途徑的第一步是煙堿在尼古丁脫氫酶的催化下開始的。在整個(gè)途徑中產(chǎn)生了幾種酶，如尼古丁脫氫酶、6-羥基-1-尼古丁氧化酶和酮脫氫酶。因此，也不難理解培養(yǎng)液的顏色變化，以及P3a的尼古丁脫氫酶的活性高于EA-17，高達(dá)9.01。

圖7 不同培養(yǎng)基下菌株P(guān)3a和EA-17的尼古丁脫氫酶活性Fig.7 Nicotine dehydrogenase activities of strains P3a and EA-17 in different media

表2 菌株P(guān)3a對(duì)煙葉烘烤過程中煙堿降解的影響Table 2 Effects of strain P3a on nicotine degradation during tobacco baking %

sp.P3a能在37 ℃、pH 7.0的條件下，將初始濃度為2 g/L煙堿作為唯一碳源和氮源，在培養(yǎng)36 h內(nèi)可降解99.06%的煙堿。且探究了該菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件，即在以葡萄糖作為碳源，以玉米漿干粉為有機(jī)碳源，以硫酸銨為無機(jī)氮源時(shí)，菌株P(guān)3a最佳pH為6.5～7.0，與假單胞菌屬HF-1和節(jié)桿菌aRF-1相似；最適生長溫度為28 ℃，與米曲霉112822相似。P3a能在煙堿濃度為5 g/L的情況下良好生長，相比蒼白桿菌SJY1(3.0 g/L)和假單胞菌HF-1(2.0 g/L)的煙堿耐受性，P3a有很強(qiáng)的耐受性。并將它應(yīng)用到新鮮的煙葉中，發(fā)現(xiàn)它可以減少1 kg新鮮煙葉中55.11%的煙堿;鑒于其對(duì)煙堿的降解能力很強(qiáng)，可高效地應(yīng)用于環(huán)境和煙草廢棄物中的煙堿降解。