周 軍，鄧 姣，張 勝，李湘洲

（中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，長沙 410004）

0 引言

林產(chǎn)化工專業(yè)旨在培養(yǎng)利用植物資源開發(fā)綠色化工產(chǎn)品、生物醫(yī)藥材料和清潔能源的高級復(fù)合型科研與應(yīng)用人才［1］。因此，在系統(tǒng)學(xué)習(xí)天然藥物化學(xué)、生物制藥工藝學(xué)、天然產(chǎn)物化學(xué)檢測技術(shù)等基礎(chǔ)理論課程知識和開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目的同時(shí)，針對復(fù)雜的科研與生產(chǎn)實(shí)際問題，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)探索并開設(shè)綜合性、創(chuàng)新性的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，有利于推進(jìn)“新工科”背景下的實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革［2-3］，夯實(shí)學(xué)生的專業(yè)基礎(chǔ)知識，提高學(xué)生解決實(shí)際問題與自主創(chuàng)新的能力。

林源活性成分高效修飾與新型制劑開發(fā)是林產(chǎn)化工領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，已開發(fā)的諸如紫杉醇脂質(zhì)體、白藜蘆醇微膠囊、銀杏內(nèi)酯注射液等制劑已廣泛應(yīng)用于抗癌藥物、抗氧化食品等行業(yè)中［4-6］。白藜蘆醇（Resveratrol）是一種非黃酮類天然多酚化合物，廣泛存在于桑椹、葡萄、花生等植物組織中［7-8］。研究表明，白藜蘆醇具有抗氧化、保護(hù)心血管以及抗腫瘤等多種生理活性［9-10］。但白藜蘆醇是脂溶性物質(zhì)，難溶于水以及穩(wěn)定性差的天然缺陷使其難以被人體吸收利用，極大地限制了白藜蘆醇產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用。利用制劑制備技術(shù)可以有效改善白藜蘆醇的天然缺陷。目前已開發(fā)的劑型有乳液、微膠囊、脂質(zhì)體、固體分散體和脂質(zhì)納米液晶等。其中固體分散體是指將藥物高度分散于固體載體中形成的一種以固體形式存在的藥物-載體的固體分散系統(tǒng)［11］。固體分散體的釋藥性能與制備方法及載體材料密切相關(guān)。常用的制備方法有溶劑法、熔融法、噴霧干燥法、靜電紡絲法等［12-13］。靜電紡絲技術(shù)作為一種新興的制備技術(shù)，其制備的固體分散體具有比表面積大、結(jié)構(gòu)可控和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，已在藥物載體、組織工程支架等方面有較好的應(yīng)用［14］。紫膠作為藥物的天然載體材料，因其結(jié)構(gòu)中羧基基團(tuán)的存在而具有一定的腸溶特性［15］，在載體材料中加入L-組氨酸（L-Histidine），能促進(jìn)羧基在模擬腸液中的解離［16］，從而表現(xiàn)出優(yōu)良的腸溶特性。

設(shè)計(jì)的靜電紡絲技術(shù)制備白藜蘆醇固體分散體的綜合實(shí)驗(yàn)，比較了加入L-組氨酸前后制備的白藜蘆醇固體分散體的形貌結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性以及釋藥性能與機(jī)理。選取特色林源活性成分，利用新興制劑制備技術(shù)對其進(jìn)行劑型改造以克服其天然缺陷，有助于學(xué)生深入理解專業(yè)基礎(chǔ)知識，了解行業(yè)前沿動態(tài)，激發(fā)學(xué)生創(chuàng)新思維，提高實(shí)踐能力與科學(xué)素養(yǎng)，促進(jìn)學(xué)生對專業(yè)的認(rèn)同感和歸屬感。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

（1）主要試劑與材料。紫膠樹脂、氫氧化銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，98%白藜蘆醇，花垣恒遠(yuǎn)植物生化有限公司；99%L-組氨酸，上海麥克林生化科技有限公司，透析袋（MD34，3500D），Sigma Aldrich。

（2）主要儀器。NANON-01A 靜電紡絲機(jī)，MECC；UV2310II紫外分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；Sigma HD 場發(fā)射掃描電子顯微鏡，Zeiss；ALPHA傅里葉變換紅外光譜儀；Q2000 差示掃描量熱儀，TA Instruments；RC-3 溶出度測定儀，天津新天光分析儀器技術(shù)有限公司；SCIENTZ-18N 冷凍干燥儀，寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫膠銨鹽的制備

稱取粉碎并過40 目篩的紫膠10.00 g，加入200 mL的0.1 mol／L 氨水中，于40 ℃下恒溫磁力攪拌1 h，所得反應(yīng)溶液靜置，取上層清液裝入表面皿中，于-18 ℃預(yù)凍8 h，經(jīng)冷凍干燥48 h 得到褐色的紫膠銨鹽。

1.2.2 靜電紡絲制備白藜蘆醇固體分散體

稱取0.222 g純白藜蘆醇分散于含1.998 g 紫膠銨鹽的無水乙醇溶液中，45 ℃下攪拌1 h 使其完全溶解，加入0.75 mg L-組氨酸后繼續(xù)攪拌5～6 h，冷卻至室溫，得到紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇溶液。不加組氨酸的溶液為紫膠銨鹽／白藜蘆醇溶液。樣品溶液經(jīng)超聲處理60 s，排除氣泡后進(jìn)行靜電紡絲。設(shè)置儀器參數(shù)為電壓29 kV，流速0.2 mL／h，針頭清洗頻率50 s／次，溫度（25±5）℃，濕度42% ±5%，紡絲樣品通過鋁箔錫紙收集，接收距離15.0 cm，即得到粉末狀的紫膠銨鹽／白藜蘆醇和紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇樣品，備用。

1.2.3 固體分散體中白藜蘆醇載藥率的測定

分別稱取一定量的紫膠銨鹽／白藜蘆醇和紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇樣品，用乙酸乙酯反復(fù)淋洗3 遍，過濾，濾液定容，用紫外-可見分光光度計(jì)在305 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝141.5x+0.004 7，R2＝0.999 6，在1.2～6.0 mg／L 范圍內(nèi)擬合效果較好）計(jì)算表面未包埋的白藜蘆醇的質(zhì)量，并分別計(jì)算白藜蘆醇的載藥率：

式中：LC為白藜蘆醇的載藥率，%；m為固體分散體的質(zhì)量；m0為白藜蘆醇的加入量；m1為未包裹的白藜蘆醇的質(zhì)量。

1.2.4 掃描電鏡分析

分別取適量的樣品粘在有導(dǎo)電膠的樣品臺上，利用真空鍍膜機(jī)噴金后，再用掃描電鏡觀察樣品的表觀形貌，并利用Nano measure 軟件對粒徑分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 傅里葉紅外光譜分析

分別取適量的樣品與干燥的溴化鉀混合，研磨均勻后壓片，樣品在紅外光譜下進(jìn)行分析，掃描頻率64 Hz，掃描32 次，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.2.6 差示掃描量熱法分析

分別取適量樣品置于鋁制小坩堝中，封壓后放入差示掃描量熱儀中進(jìn)行分析，測量溫度范圍25～350℃，升溫速率10 ℃／min。以液氮為降溫介質(zhì)，加熱過程中均以高純氮?dú)鉃榇祾邭夂捅Ｗo(hù)氣。

1.2.7 體外釋放效果及其動力學(xué)

根據(jù)2015 版中國藥典溶出度和釋放度測定法選用第2 法槳法測定樣品的體外釋放效果［17］。分別精密稱取含白藜蘆醇同等質(zhì)量的紫膠銨鹽／白藜蘆醇、紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇樣品和純白藜蘆醇置于已預(yù)處理的透析袋中，加入少量緩沖介質(zhì)后封閉，置于含400 mL pH ＝6.8 的模擬腸液的溶出儀中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，釋放10 h，轉(zhuǎn)速為（50 ±2）r／min，溫度為（37±0.5）℃。其中，在預(yù)定的時(shí)間間隔內(nèi)取樣5 mL，并立即補(bǔ)充等量新鮮釋放介質(zhì)。用紫外分光光度計(jì)在305 nm處測定所取樣液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（y＝103.01x+0.018 9，R2＝0.999 1，在0.085～17 mg／L范圍內(nèi)擬合效果較好）計(jì)算白藜蘆醇的濃度，并分別計(jì)算樣品中白藜蘆醇的累積釋放百分率。

式中：Xt為第t次累積釋放率；V0為每次取樣體積；Ve為釋放介質(zhì)總體積；Ct為第t次取出的緩釋介質(zhì)中白藜蘆醇的濃度，g／L；m為樣品中白藜蘆醇的含量。

藥物從載體材料中的釋放過程主要是由擴(kuò)散控制和降解溶蝕控制兩種機(jī)制單獨(dú)作用或共同作用的［18］。經(jīng)典釋藥動力學(xué)模型包括零級釋放動力學(xué)、一級釋放動力學(xué)、Higuchi平面擴(kuò)散動力學(xué)和Ketger-Peppas（KP）［112］釋放動力學(xué)模型分別為：

式中：t為釋放時(shí)間；Xt為在t時(shí)藥物累積釋放率；A、k為釋放常數(shù)；X0為藥物的初始濃度；X∞為最大累積釋放百分?jǐn)?shù)；n為釋放指數(shù)，無量綱。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品載藥率的測定與形貌表征

通過測定得到紫膠銨鹽／白藜蘆醇和紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇的載藥率分別為7.91%和8.37%，表明紫膠銨鹽對白藜蘆醇具有良好的包覆能力，且加入His之后白藜蘆醇的負(fù)載率略有提高。圖1（a）所示為純白藜蘆醇的掃描電鏡分析，白藜蘆醇大多為細(xì)長的無規(guī)則晶體結(jié)構(gòu)，粒徑為（3 034.06 ±584.71）nm，粒徑較大且不均勻。圖1（b）中紫膠銨鹽／白藜蘆醇的形貌較規(guī)整，大多為表面光滑的球體結(jié)構(gòu)，粒徑為（838.83 ±154.24）nm，分布較為均勻。圖1（c）中紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇形貌也呈表面較為光滑的球體結(jié)構(gòu)，粒徑為（898.08 ±173.62）nm，略大于紫膠銨鹽／白藜蘆醇的粒徑。利用靜電紡絲技術(shù)可以制備出白藜蘆醇負(fù)載率高、形貌可控的固體分散體，且加入組氨酸材料后制備的紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇固體分散體的粒徑呈現(xiàn)出略微增大的趨勢。

圖1 樣品掃描電鏡分析

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

利用傅里葉變換紅外光譜對樣品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。由圖2 可知，白藜蘆醇紅外光譜圖中3 217 cm-1處為苯環(huán)—OH的伸縮振動吸收峰，1 585、1 515 cm-1處為芳環(huán)上的C ＝C伸縮振動吸收峰，1 153 cm-1處為C—O伸縮振動吸收峰，962 cm-1處為RCH ＝RCH 特征吸收峰。組氨酸紅外光譜圖中3 300～2 500、920 cm-1處為—COOH特征吸收峰，1 635 cm-1處為C ＝N伸縮振動吸收峰，835、683 cm-1處為C ＝C 鍵特征吸收峰［19-20］。紫膠銨鹽／白藜蘆醇紅外光譜圖中，1 515 cm-1處保留了白藜蘆醇的C ＝C 特征吸收峰，且在2 931 cm-1處C—H特征吸收峰略有加強(qiáng)，表明白藜蘆醇被成功包埋于紫膠銨鹽中。紫膠銨鹽-聚組氨酸／白藜蘆醇的紅外光譜圖與紫膠銨鹽／白藜蘆醇基本一致，表明少量聚組氨酸的加入對固體分散體的結(jié)構(gòu)沒有明顯的影響。同時(shí)，靜電紡絲制備的紫膠銨鹽／白藜蘆醇和紫膠銨鹽-聚組氨酸／白藜蘆醇固體分散體的紅外光譜圖中未出現(xiàn)新的特征吸收峰，表明其制備過程不涉及化學(xué)反應(yīng)。

圖2 樣品紅外光譜分析結(jié)果

2.3 差示掃描量熱分析

利用差示掃描量熱儀對樣品中白藜蘆醇的分散狀態(tài)以及載體的熱穩(wěn)定性進(jìn)行表征。由圖3 可知，純白藜蘆醇在269.8 ℃附近呈現(xiàn)出較強(qiáng)的吸熱峰，而L-組氨酸在287.5 ℃處有尖銳吸熱峰，這與它們本身的熱分解溫度相對應(yīng)。靜電紡絲制備的固體分散體紫膠銨鹽／白藜蘆醇與紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇沒有出現(xiàn)明顯的吸熱峰，表明固體分散體的熱力學(xué)性質(zhì)更趨穩(wěn)定，且白藜蘆醇在固體分散體中以非晶體的形式存在，非晶態(tài)形式的藥物其溶解度較高，易于吸收［21］。

圖3 樣品差示掃描量熱分析結(jié)果

2.4 體外釋放效果及其動力學(xué)

人體對藥物、食物等的消化和吸收主要集中在小腸［22］。通過測定藥物在體外胃腸消化模型中的釋放效果，可以初步判斷藥物的釋放規(guī)律。由圖4 可知，在pH為6.8 的模擬腸液條件下，紫膠銨鹽／白藜蘆醇和紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇固體分散體中白藜蘆醇釋放過程可以大致分為3 個(gè)階段，0～4 h 內(nèi)為快速釋放階段，4～8 h內(nèi)為持續(xù)緩釋階段，8 h 后為平穩(wěn)釋放階段。10 h內(nèi)紫膠銨鹽／白藜蘆醇和紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇中白藜蘆醇的累積釋放率分別為65.79%和81.54%，而純白藜蘆醇在10 h 內(nèi)的累積釋放率僅為52.24%。紫膠及其衍生物常作為腸溶藥物的包衣材料，因此利用紫膠銨鹽包覆白藜蘆醇制備的紫膠銨鹽／白藜蘆醇固體分散體在pH ＝6.8 的模擬腸液中的累積釋放率較高，表現(xiàn)出一定的腸溶特性。而加入L-組氨酸后制備的紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇中由于L-組氨酸的存在，其既可作為質(zhì)子供體，又可作為質(zhì)子受體［16］，使紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇在模擬腸液中能快速穩(wěn)定釋放出白藜蘆醇，表現(xiàn)出優(yōu)良的腸溶特性，有利于白藜蘆醇在腸道中的釋放與被吸收。

圖4 pH ＝6.8條件下的體外釋放效果

對白藜蘆醇、紫膠銨鹽／白藜蘆醇和紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇在pH ＝6.8 的模擬腸液中的釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖5 和表1。純白藜蘆醇的釋放過程符合Higuchi釋放動力學(xué)模型，屬于簡單的Fick 擴(kuò)散釋放。紫膠銨鹽／白藜蘆醇與紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇的釋放過程均符合一級釋放動力學(xué)模型，屬于藥物擴(kuò)散和骨架溶蝕共同協(xié)助釋放機(jī)制［18］。加入L-組氨酸之后，紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇的擬合方程中釋放常數(shù)k值明顯大于紫膠銨鹽／白藜蘆醇的釋放常數(shù)k值，表明紫膠銨鹽-組氨酸／白藜蘆醇中白藜蘆醇在模擬腸液中的釋放速率更快。

表1 體外釋放動力學(xué)擬合結(jié)果

圖5 體外釋放動力學(xué)模型擬合

3 教學(xué)特色與效果

本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)學(xué)生綜合運(yùn)用專業(yè)基礎(chǔ)理論知識創(chuàng)新性的解決實(shí)際問題的能力為目的，結(jié)合教師自身科研課題，以特色林源活性成分白藜蘆醇為研究對象，從藥物制劑學(xué)的角度設(shè)計(jì)了靜電紡絲制備白藜蘆醇固體分散體及其釋藥機(jī)制綜合實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及林產(chǎn)化學(xué)、天然藥物化學(xué)、藥物制劑學(xué)、材料科學(xué)、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)處理等多門學(xué)科，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過程中不僅可以在教師指導(dǎo)下完成大型儀器設(shè)備的操作，還能學(xué)會使用Origin、SPSS等數(shù)據(jù)處理軟件，有助于提高學(xué)生的科研能力，也促進(jìn)學(xué)生對多學(xué)科交叉融合解決科研與生產(chǎn)實(shí)踐問題的理解。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)操作簡便易行，具有一定的綜合性與創(chuàng)新性，可在化學(xué)工程與工藝、制藥工程等專業(yè)推廣運(yùn)用。針對專業(yè)和課程學(xué)時(shí)設(shè)置的不同，還可以對藥物模型、制備技術(shù)等進(jìn)行調(diào)整，例如，針對制備技術(shù)，可以將靜電紡絲技術(shù)改為更易于實(shí)現(xiàn)的噴霧干燥、冷凍干燥等技術(shù)。

另外，根據(jù)課程思政建設(shè)的需要，可以充分挖掘并針對性地設(shè)置一些課程思政元素，培育本專業(yè)大學(xué)生正確的哲學(xué)觀、世界觀和科學(xué)觀等。例如，介紹林產(chǎn)化學(xué)的發(fā)展史及我國重要林業(yè)科學(xué)家梁希等的科學(xué)貢獻(xiàn)；闡述“綠水青山就是金山銀山”理論及林產(chǎn)化學(xué)發(fā)揮的重要作用；林源活性成分大多作為初級產(chǎn)品供出口，而國外通過精深加工后制成的高附加值產(chǎn)品返銷國內(nèi)，我國實(shí)現(xiàn)資源優(yōu)勢與技術(shù)優(yōu)勢、產(chǎn)品優(yōu)勢的有機(jī)結(jié)合的重要性；分析檢測技術(shù)的發(fā)展及當(dāng)前我國在分析科學(xué)領(lǐng)域中面臨的“卡脖子”的嚴(yán)峻形勢與自主創(chuàng)新發(fā)展的重要性等，通過引入上述思政元素，有利于提高學(xué)生的思辨能力，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維，提高學(xué)生對本專業(yè)的認(rèn)同感和歸屬感。

4 結(jié)語

基于天然藥物化學(xué)和藥物制劑學(xué)等專業(yè)基礎(chǔ)知識，設(shè)計(jì)了靜電紡絲法制備白藜蘆醇固體分散體及釋藥機(jī)制的綜合實(shí)驗(yàn)。借助掃描電鏡、傅里葉紅外光譜和差示掃描量熱等材料學(xué)表征技術(shù)，學(xué)生們對加入L-組氨酸前后制備的白藜蘆醇固體分散體的理化性質(zhì)進(jìn)行了比較分析，并深入探究了固體分散體的釋藥效果與機(jī)理，通過實(shí)驗(yàn)教學(xué)的開展加深了學(xué)生對林產(chǎn)化學(xué)、天然藥物化學(xué)、藥物制劑學(xué)和儀器分析科學(xué)等相關(guān)專業(yè)基礎(chǔ)知識的理解，知行合一，提高了學(xué)生利用專業(yè)知識與技能解決科學(xué)研究與生產(chǎn)實(shí)踐問題的能力，有利于培養(yǎng)符合“新工科”要求的卓越創(chuàng)新人才。