程海生， 彭 湉， 周新麗

上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200093

植物乳桿菌是一種廣泛分布于發(fā)酵食品和健康人體腸道黏膜等生態(tài)位的桿狀益生菌[1]，是腸道微生物群中主要菌群之一，具備良好的腸胃粘附性能，能夠?qū)Σ≡纳L(zhǎng)進(jìn)行抑制，從而調(diào)節(jié)消化道菌群平衡[2]。傳統(tǒng)的生產(chǎn)加工中，植物乳桿菌主要以水溶液和粉末狀形式存在，其活力很難得到維持或受到一定的損失。其次，在運(yùn)輸、存儲(chǔ)過程中，隨著時(shí)間的推移，植物乳桿菌活菌數(shù)大量減少，達(dá)不到預(yù)計(jì)的益生作用。

益生菌微膠囊技術(shù)是一種保護(hù)益生菌免受不利環(huán)境因素影響、提高其在產(chǎn)品中存活率的有效方法，已廣泛地應(yīng)用于食品行業(yè)中[3]。益生菌微膠囊的大小和單分散性對(duì)益生菌的存活率至關(guān)重要，用于益生菌微囊化的傳統(tǒng)方法如擠壓法、噴霧干燥法和乳化法等大多存在微膠囊尺寸不均一、形狀不可控、生產(chǎn)效率低等缺點(diǎn)[4-6]。

液滴微流控技術(shù)是通過控制兩種互不相溶的液體(連續(xù)相和分散相)的流速來(lái)實(shí)現(xiàn)液滴的破碎，在兩相界面處的表面張力和剪切力共同作用下，將分散相以納升、甚至皮升的體積形式分散在連續(xù)相中，從而形成尺寸分布均勻的液滴[7-9]。該技術(shù)具有液滴生成速度快、大小均勻、單分散性良好、體系封閉等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于功能性微膠囊的制備[10，11]。VINNER等人[12-14]的研究證明了液滴微流控制備益生菌微膠囊可行性。

在利用液滴微流控芯片制備微液滴的過程中，芯片通道的各種幾何尺寸和兩相流速都是決定微液滴生成情況的關(guān)鍵因素，選取合適的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)方法，用于優(yōu)化微流控芯片的幾何參數(shù)和流動(dòng)參數(shù)以達(dá)到最佳性能要求很有意義。本文以流聚焦液滴微流控芯片制備植物乳桿菌微膠囊，采用田口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析微流控芯片的幾何參數(shù)(芯片孔口寬度、通道高度、進(jìn)油口寬度、進(jìn)水口寬度、通道出口寬度)及流動(dòng)參數(shù)(流速比)，對(duì)液滴直徑大小及變異系數(shù)的影響，確定植物乳桿菌微膠囊制備芯片的最佳工藝參數(shù)。根據(jù)最優(yōu)方案制作了流聚焦液滴微流控裝置，以海藻酸鈉、低酯果膠(多糖)和卵磷脂(脂質(zhì))為壁材原料制備植物乳桿菌微膠囊，驗(yàn)證其單分散性和良好的包埋率，并通過模擬胃腸道實(shí)驗(yàn)對(duì)所制備的微膠囊進(jìn)行體外評(píng)價(jià)，驗(yàn)證其耐酸性和腸溶性。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)備

菌株：植物乳桿菌CGMCC 1258(杜邦中國(guó)集團(tuán)有限公司上海分公司)。植物乳桿菌接種于MRS固體液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)傳代培養(yǎng)2～3次完全活化待用。

材料：海藻酸鈉、低酯果膠、卵磷脂、無(wú)水氯化鈣、檸檬酸鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；胃蛋白酶(酶活1∶10 000)、胰蛋白酶(酶活1∶250)(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO18AC，松下醫(yī)療器械有限公司，日本)、高壓滅菌鍋(HRLM-80，青島海爾特種電器有限公司)、低溫離心機(jī)(ST16r，北京賽默飛)、光學(xué)顯微鏡(CFI60，尼康，日本)、CO2激光雕刻機(jī)(UNIVERSAL，VLS2.30，美國(guó))、真空貼合機(jī)(TBK-508，深圳市旺達(dá)科技有限公司)。

1.2 液滴微流控裝置

液滴微流控微囊化裝置如圖1所示，包括兩相流輸送裝置、微液滴生成裝置、可視化裝置以及收集裝置等部分。兩相流輸送裝置由兩臺(tái)微量注射泵和微注射器組成，通過設(shè)置注射器的注射速度調(diào)節(jié)兩相流速。微液滴生成裝置即微流控芯片，芯片的兩入口通過聚四氟乙烯管連接至輸送裝置的注射器，芯片的出口端連接合適規(guī)格的聚四氟乙烯管，輸送微液滴至收集裝置中。收集裝置采用的是50 mL的無(wú)菌離心管，且收集裝置中盛交聯(lián)劑CaCl2?？梢暬b置由一臺(tái)光學(xué)顯微鏡、工業(yè)相機(jī)以及一臺(tái)計(jì)算機(jī)組成，用于實(shí)時(shí)觀測(cè)微液滴的生成情況，便于調(diào)控兩相流速?gòu)亩{(diào)控液滴的生成。

圖1 液滴微流控微囊化裝置

利用Auto CAD 2020分層繪制芯片的幾何圖形，如圖2所示，芯片整理結(jié)構(gòu)分為蓋板層、液滴生成層以及底板層三部分，其中通道層包括兩相入口，流聚焦通道以及液滴出口，為方便芯片對(duì)準(zhǔn)貼合，在每一層基片四角都設(shè)有直徑為2 mm的對(duì)準(zhǔn)口。圖2(b)所示為通道的流聚焦結(jié)構(gòu)，其中包括孔口寬度Wor、通道高度H、進(jìn)油口(連續(xù)相)寬度Wc、進(jìn)水口(分散相)寬度Wd以及出口寬度Wo等幾何參數(shù)。

(a) 芯片各層結(jié)構(gòu)矢量圖

(b) 流聚焦細(xì)節(jié)圖

(c) 芯片結(jié)構(gòu)圖圖2 芯片結(jié)構(gòu)圖

芯片采用聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate，PMMA)材料加工，整體尺寸為80 mm×30 mm(長(zhǎng)×寬)，蓋板層和底板層厚0.2 mm，將繪制好的各層芯片結(jié)構(gòu)圖案?jìng)鬏斨良す獾窨虣C(jī)進(jìn)行切割，得到各層結(jié)構(gòu)基片。超聲波清洗20 min后，利用真空貼合機(jī)對(duì)芯片進(jìn)行鍵合。最后選取合適規(guī)格的針頭、聚四氟乙烯管對(duì)芯片出口、入口進(jìn)行插針、接管等操作，用UV紫外固化膠進(jìn)行粘連密封。為了更好地形成W/O液滴，使用聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)注射涂覆的方法對(duì)親水性PMMA通道進(jìn)行疏水性改性。每個(gè)參數(shù)分配了五個(gè)不同水平，最小的孔口寬度設(shè)置為75 μm，其后每個(gè)水平以25 μm的步長(zhǎng)增加，最大增加至175 μm。按不同型號(hào)的板材將通道高度的五個(gè)水平分別設(shè)置為200 μm、300 μm、400 μm、500 μm和600 μm。為更直觀的描述進(jìn)油口、進(jìn)水口以及出口寬度等參數(shù)與孔口寬度的變化關(guān)系，將進(jìn)油口寬度、進(jìn)水口寬度以及出口寬度按公式(1)—(3)歸一化到孔口寬度。歸一化的進(jìn)油口和歸一化的進(jìn)水口均以0.5的步長(zhǎng)2增加到4，歸一化的出口以1的步長(zhǎng)從2增加到6。對(duì)于給定的5個(gè)幾何參數(shù)，每個(gè)參數(shù)采用5個(gè)不同的水平值，按照田口正交方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)陣列，L25田口正交設(shè)計(jì)表如表1所示。

表1 芯片結(jié)構(gòu)田口正交設(shè)計(jì)表及不同流速下各芯片制備微膠囊的粒徑大小、變異系數(shù)

(1)

(2)

(3)

流速比是指連續(xù)相流速與分散相流速之比，如式(4)所示。將25個(gè)正交芯片分別在流速比為12、15、18、21、24的條件下制備液滴，總共進(jìn)行125次實(shí)驗(yàn)，并統(tǒng)計(jì)分析液滴直徑和多分散度，其中分散相流速固定為20 μL/min，對(duì)應(yīng)的連續(xù)相流速為240 μL/min、300 μL/min、360 μL/min、420 μL/min、480 μL/min。

(4)

式中：Φ為流速比，Qc為連續(xù)相流速，μL/min；Qd為分散相流速，μL/min。

隨機(jī)抽取微滴噴射制備等植物乳桿菌微膠囊若干，置于顯微鏡下拍照獲取放大40倍的微膠囊照片，每組樣本選取三個(gè)視野，設(shè)置三次平行實(shí)驗(yàn)。拍攝的照片用 Image-Pro Plus 處理軟件對(duì)微膠囊粒徑大小進(jìn)行測(cè)量統(tǒng)計(jì)。

1.4 微流控制備植物乳桿菌微膠囊

根據(jù)張宇琪等的方法[15]，配制海藻酸鈉-卵磷脂-低酯果膠復(fù)合壁材溶液，具體組成為海藻酸鈉1%(w/v)，卵磷脂1%(w/v)，低酯果膠0.75%(w/v)。將完全活化的菌體和復(fù)合壁材溶液按1∶4的比例混合均勻。以硅油(黏度1×10-4m2/s)為連續(xù)相，復(fù)合壁材溶液為分散相，分別用一支1 mL無(wú)菌注射器吸取菌-壁材混合液(水相)，10 mL無(wú)菌注射器吸取硅油(油相)，固定在泵送裝置上，并通過聚四氟乙烯管連接注射器針頭和芯片。之后按一定流速比例分別設(shè)置好水相速度和油相速度，通過兩相剪切形成W/O液滴，出口處收集液滴至裝有濃度為0.4 mol/L氯化鈣溶液的無(wú)菌離心管中進(jìn)行凝膠反應(yīng)，靜置30 min，4 000 r/min離心5 min后去油和氯化鈣后收集微膠囊，用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次，再次離心收集即可得到植物乳桿菌微膠囊。

1.5 連續(xù)模擬胃腸道處理

模擬胃液(Simulated gastric juice, SGJ)：配制0.2%(w/v)的NaCl溶液，用濃鹽酸調(diào)整pH 1.5，加入一定量的胃蛋白酶 (1 g/100 mL，酶活力1∶10 000),過0.22 μm無(wú)菌濾膜備用。

模擬腸液(Simulated intestinal juice, SIJ)：配制0.1 mol/L KH2PO4溶液，0.1 mol/L的 NaOH 溶液調(diào)整pH至7.4，加入10 g胰蛋白酶(酶活力 1∶250)，完全溶解后將溶液定容至1 000 mL，過0.22 μm無(wú)菌濾膜備用。

解囊液：配制0.06 mol/L檸檬酸鈉溶液，121 ℃滅菌20 min備用。

將洗凈后離心收集得到的微膠囊置于預(yù)熱的模擬胃液(37 ℃, pH 1.5)中，混合均勻后放置在37 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床溫育，2 h后離心收集再轉(zhuǎn)入模擬腸液(37 ℃, pH 7.4)中，同樣放置在37 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床溫育2 h，分別在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h時(shí)取樣，無(wú)菌生理鹽水洗凈后用解囊液溶解膠囊。采用梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法，將解囊后的菌液10倍遞增梯度稀釋，取3個(gè)適宜稀釋梯度均勻接種在MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落在30～300范圍內(nèi)的計(jì)數(shù)平板，計(jì)算菌落總數(shù)。另外，取1 mL植物乳桿菌裸菌置于相同條件作對(duì)照組進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。每組樣品重復(fù)三次平行實(shí)驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

使用方差分析(ANOVA)方法確定每個(gè)性能指標(biāo)對(duì)幾何參數(shù)和流動(dòng)參數(shù)的敏感性，通過計(jì)算比較組間方差和組內(nèi)方法，較高F值(F>1)的參數(shù)反映了更重要的主導(dǎo)參數(shù)。為比較25個(gè)芯片在相同流速比條件下的性能，采用ANOVA方法得到每個(gè)參數(shù)在給定流速比條件下的F值，并在5中不同流速比條件下重復(fù)這一分析。以液滴直徑D和變異系數(shù)CV為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)進(jìn)行5次方法分析。

田口設(shè)計(jì)中信噪比(Singal-Noise，S/N)是重要的分析指標(biāo)，S/N表示信號(hào)功率與噪聲功率的比值，S/N越大，說(shuō)明產(chǎn)品的品質(zhì)特性越高。本研究的液滴直徑變異系數(shù)越小表示液滴的單分散性越好，據(jù)此選擇田中設(shè)計(jì)中期望小的特性指標(biāo)的S/N分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如式(5)所示：

(5)

式中：yi為實(shí)驗(yàn)中的因變量，對(duì)應(yīng)液滴的變異系數(shù)CV；n代表實(shí)驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)，本實(shí)驗(yàn)取1；S/N的變化趨勢(shì)代表著變異系數(shù)CV的變化趨勢(shì)，小的S/N比對(duì)應(yīng)小的變異系數(shù)CV，反之亦然。

通過Minitab軟件計(jì)算分析得到變異系數(shù)CV信噪比響應(yīng)表。信噪比響應(yīng)表中的Delta是每個(gè)因子(幾何參數(shù))的最大平均響應(yīng)值和最小平均響應(yīng)值之差。Minitab軟件按Delta數(shù)值分大小分配秩，將秩1分配給最大的Delta值，將秩2分配給第二大的Delta值，以此類推，用于表示每個(gè)因子(幾何參數(shù))對(duì)響應(yīng)(變異系數(shù)CV)的相對(duì)效應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 流聚焦微流控芯片的參數(shù)優(yōu)化

使用25組芯片在5種不同流速比條件下制備微膠囊，微膠囊的粒徑大小、變異系數(shù)如表1所示。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，不同流速比下微囊直徑和變異系數(shù)對(duì)幾何參數(shù)的敏感性如圖3所示?？卓趯挾群屯ǖ栏叨仁菦Q定液滴大小的關(guān)鍵參數(shù)。當(dāng)流速比小于18時(shí)，隨著流速比的增大，液滴直徑對(duì)孔口寬度的敏感性更加明顯，孔口寬度的F值由25.32增加至30.05；當(dāng)流速比繼續(xù)增大時(shí)，其敏感性逐漸減弱，F(xiàn)值最低為19.98。液滴直徑對(duì)通道高度的敏感性變化趨勢(shì)與孔口寬度類似，不過在流速比為15時(shí)，F(xiàn)值取到峰值18.55。其余三個(gè)參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析得到的F值非常小，表明對(duì)液滴直徑的影響不顯著。圖3(b)所示為不同流速比對(duì)液滴變異系數(shù)的幾何參數(shù)敏感性?？芍卓趯挾群屯ǖ栏叨葘?duì)液滴的變異系數(shù)的影響具有顯著性，而其他三個(gè)幾何參數(shù)液滴變異系數(shù)的影響不顯著。

(a) 直徑D

(b) 變異系數(shù)CV圖3 不同流速比下微囊直徑和變異系數(shù)對(duì)幾何參數(shù)的敏感性

2.2 信噪比分析

田口試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過對(duì)幾何參數(shù)和流動(dòng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，調(diào)整液滴微流體裝置的性能。為實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，通過Minitab 軟件計(jì)算分析得到變異系數(shù)CV信噪比主效應(yīng)圖。從圖4中可以看出，孔口寬度和通道高度對(duì)變異系數(shù)CV有顯著的影響。五個(gè)參數(shù)對(duì)液滴直徑變異系數(shù)CV影響程度的排列順序?yàn)锽(通道高度)>A(孔口寬度)>C(歸一化進(jìn)油口)>D(歸一化進(jìn)水口)>E(歸一化出口)。

主效應(yīng)分析研究特定參數(shù)對(duì)系統(tǒng)響應(yīng)依賴性，主效應(yīng)圖清晰直觀地表明實(shí)驗(yàn)中分類參數(shù)每個(gè)水平的平均反應(yīng)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)最穩(wěn)健的性能參數(shù)在信噪比S/N最高點(diǎn)獲得，如圖4中所示，最佳因子水準(zhǔn)為A2B2C4D1E5，即孔口寬度為100 μm，通道高度為300 μm，歸一化進(jìn)油口為3.5，歸一化進(jìn)水口為2，歸一化出口為6時(shí)，獲得最小變異系數(shù)。根據(jù)以上參數(shù)組合進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示信噪比為-10.06，標(biāo)準(zhǔn)差為 0.44 處于較為穩(wěn)定的狀態(tài)，CV均值表現(xiàn)為3.17%，小于5%滿足設(shè)計(jì)要求。

(a) 孔口寬度

(b) 通道高度

(c) 歸一化進(jìn)油口

(d) 歸一化進(jìn)水口

(e) 歸一化出口圖4 變異系數(shù)CV信噪比主效應(yīng)圖

2.3 植物乳桿菌微膠囊的性能

按最佳參數(shù)制備芯片并用于微膠囊的制備，其中分散相流速為20 μL/min，連續(xù)相流速為300μL/min。圖5為制備所得的益生菌微膠囊及其粒徑大小和分布圖，從圖5中可以看出微膠囊的粒徑分布較為集中，統(tǒng)計(jì)分析得出微膠囊的平均粒徑為285.42 μm，變異系數(shù)為3.61%(<5%)，滿足了微膠囊粒徑可控、單分散性的設(shè)計(jì)要求。李龍等[16]采用內(nèi)源乳化法制備植物乳桿菌微膠囊的粒徑分布較廣，其粒徑范圍為1.43 mm～3.00 mm。劉歡[17]使用噴霧干燥法對(duì)乳酸菌進(jìn)行包封，制備所得的微膠囊粒徑為15 μm～20 μm，但其形狀普遍呈不規(guī)則狀。由此可見，液滴微流控技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)微膠囊形態(tài)、粒徑大小及分布的精確控制，從而完成對(duì)益生菌的高效封裝。

(a) 微膠囊實(shí)物圖

(b) 微膠囊粒徑及其分布圖圖5 植物乳桿菌微膠囊及其粒徑大小和分布

2.4 模擬胃腸道

將制備得到的植物乳桿菌微膠囊和裸菌分別加入到模擬胃腸液中培養(yǎng)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。在模擬胃腸液處理4 h后，裸菌及植物乳桿菌微膠囊的活菌數(shù)均不同程度地減少，而微囊化的植物乳桿菌存活率仍維持在較高水平(74.4%)，活菌數(shù)可達(dá)5.46×109CFU/mL，表明微流控裝置制備的尺寸均勻的微膠囊能夠提供給植物乳桿菌良好的胃液保護(hù)。THANGRONGTHONG等[18]提出可以通過控制微膠囊的大小來(lái)保護(hù)益生菌免受惡劣環(huán)境的侵害，由此可見微膠囊粒徑分布的均勻性也是影響益生菌抵抗胃腸道的因素之一。

圖6 植物乳桿菌微膠囊及裸菌在連續(xù)模擬胃腸液中的活菌數(shù)

3 結(jié)論

傳統(tǒng)的噴霧干燥法和乳化法等植物乳桿菌微膠囊制備方法無(wú)法很好地控制微膠囊的粒徑大小及分布，不利于菌體的包埋和生長(zhǎng)。本文以流聚焦液滴微流控芯片制備植物乳桿菌微膠囊，采用田口實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析微流控芯片的幾何參數(shù)及流動(dòng)參數(shù)對(duì)液滴直徑大小及變異系數(shù)的影響。通過方差分析和信噪比分析確定了孔口寬度和通道高度是決定液滴大小的關(guān)鍵參數(shù)，能明顯地影響液滴的分散性。孔口寬度為100 μm，通道高度為300 μm，歸一化進(jìn)油口為3.5，歸一化進(jìn)水口為2，歸一化出口為6時(shí)，微膠囊的平均粒徑為285.42 μm，變異系數(shù)為3.61%(<5%)，符合單分散性的設(shè)計(jì)要求。連續(xù)模擬胃腸道實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明微囊化的植物乳桿菌有較高的存活率。由此可見，通過液滴微流控裝置制備的植物乳桿菌微膠囊包埋效果良好，對(duì)菌種的保護(hù)作用顯著。植物乳桿菌微膠囊提高了植物乳桿菌對(duì)環(huán)境的耐受力，最大程度地發(fā)揮其益生作用。液滴微流控技術(shù)可以調(diào)節(jié)微膠囊粒徑、形態(tài)結(jié)構(gòu)等，提高植物乳桿菌的包埋率。下一步可以通過設(shè)計(jì)二維、三維并行化的液滴生成器，實(shí)現(xiàn)高通量制備植物乳桿菌微膠囊，為實(shí)現(xiàn)植物乳桿菌微膠囊工業(yè)化制備做準(zhǔn)備。