夏永軍， 張 峰， 宋 馨， 王光強(qiáng)， 艾連中， 熊智強(qiáng)

上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

耐冷菌在原料乳低溫貯藏、加工運(yùn)輸過程中廣泛存在。原料乳作為乳制品生產(chǎn)的基本原料，在加工的不同階段，其耐冷菌的群落結(jié)構(gòu)各不相同，例如未巴氏殺菌階段以假單胞菌等耐冷菌為主[1]。原料乳在灌裝和低溫儲(chǔ)存過程中最常發(fā)生耐冷菌大量污染，而機(jī)器上冷凝水和灌裝機(jī)不清潔也易造成污染[2]。原奶的快速冷卻和冷藏有利于原料乳中耐冷菌的生長，在巴氏殺菌前原料乳中耐冷菌生長可達(dá)到較高的數(shù)量，使牛奶產(chǎn)生異味。盡管非孢子形態(tài)的耐冷菌可通過巴氏殺菌殺死，但其產(chǎn)生的蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶等胞外酶能耐受巴氏殺菌甚至超高溫瞬時(shí)殺菌的溫度[3]，仍可以水解牛奶中的蛋白質(zhì)、脂肪和卵磷脂等營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致牛奶產(chǎn)生腐臭、酸敗或肥皂味、苦味、奶油味等不良風(fēng)味，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)顯著下降，嚴(yán)重影響乳制品的貨架期。

本課題組前期采用變性梯度凝膠電泳和高通量測(cè)序分析嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化和分布，發(fā)現(xiàn)原料乳階段主要的微生物污染為假單胞菌屬，而奶粉產(chǎn)品中主要菌群為乳球菌屬、鏈球菌屬、棲熱菌屬、不動(dòng)桿菌屬和擬桿菌屬[4]。為探索原料乳中耐冷菌及其產(chǎn)胞外酶規(guī)律，本研究從原料乳樣品中篩選30株耐冷菌，進(jìn)行16S rRNA菌種和耐熱蛋白酶aprX基因鑒定，分析溫度對(duì)其產(chǎn)胞外酶酶規(guī)律的影響，為原料乳質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

原料乳取樣自光明乳業(yè)股份有限公司，4 ℃冰箱放置4 d后在4 ℃低溫培養(yǎng)條件下分離篩選耐冷菌。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白棟10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉10 g，調(diào)節(jié)pH 7.2，去離子水定容至1 L。

LA培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1 g，脫脂粉1 g，去離子水定容至1 L。

1.3 耐冷菌的分離

參照辛亮報(bào)道的方法[5]，采用LB和LA培養(yǎng)基對(duì)原料乳樣品在4 ℃低溫培養(yǎng)條件下進(jìn)行耐冷菌的分離。

1.4 耐冷菌16S rRNA和耐熱蛋白酶AprX基因的鑒定

將篩選出的耐冷菌分離純化后進(jìn)行菌落PCR，采用XIONG等報(bào)道的PCR反應(yīng)體系和程序條件[6]。引物SM2F(AAATCGATAGCTTCAGCCAT)和SM3R(TTGAGGTTGATCTTCTGGTT)用于鑒定耐熱蛋白酶AprX基因特異性引物[7]，引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1 492R(CTACGGCTACCTTGTTACGA)用于鑒定16S rRNA基因特異性引物[8]。PCR產(chǎn)物送至華大基因有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得的序列在NCBI nr數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源比對(duì)，確定耐冷菌的種類及AprX基因信息。

1.5 耐冷菌蛋白酶和脂肪酶酶活測(cè)定及其熱穩(wěn)定性

將活化的耐冷菌2%接種分別接種在LA和LB培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)2 d， 4 ℃ 8 000×g離心20 min，取上清分別采用國標(biāo)GB/T 23527—2009和GB/T 23535—2009測(cè)定胞外蛋白酶和脂肪酶酶活，上清90 ℃處理5 min測(cè)定酶活的熱穩(wěn)定性。

1.6 耐冷菌產(chǎn)酶能力的測(cè)定

耐冷菌菌株在15 mL UHT乳中采用4 ℃、25 ℃和37 ℃下分別培養(yǎng)5 d，取4 mL采用1.5中的方法測(cè)定蛋白酶和脂肪酶酶活。取1 mL發(fā)酵液在0.9%生理鹽水中梯度稀釋后，在平板上進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

上述各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料乳中耐冷菌的分離鑒定

為探究原料乳加工階段中耐冷菌的影響，本研究利用LB和LA培養(yǎng)基從原料乳樣品中分離出30株在4 ℃下能生長的耐冷菌，菌株命名為Z1-Z15和P1-P15。對(duì)此30株耐冷菌進(jìn)行菌種鑒定，16S rRNA測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，除P5為芽孢桿菌，其余29株都為假單胞菌(表1)，表明原料乳中耐冷菌主要為假單胞菌。XIONG 等[4]采用DGGE和高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)原料乳中微生物主要菌群為假單胞菌，與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

大量研究報(bào)道假單胞菌能產(chǎn)生多種耐熱蛋白酶，其中標(biāo)志性蛋白酶是AprX[9-11]，其保守結(jié)構(gòu)域堿基序列長度為850 bp。本實(shí)驗(yàn)選取分離的耐冷菌，采用特異性引物鑒定基因組中是否含有aprX基因。PCR結(jié)果表明Z1，Z2，Z3，Z5，Z6，Z7，Z8，Z9，Z10，Z11，Z12，Z13和Z15共13株耐冷菌含有aprX(表1)。MARCHAND S等[12]從牛奶中篩選的55株假單胞菌中，42株檢測(cè)到aprX基因。這些結(jié)果均表明原料乳中較多的假單胞菌都含有aprX基因?；诖?， DUFOUR D等[10]提出aprX基因可以用做檢測(cè)牛奶是否受到假單胞菌污染，但不能用來評(píng)估對(duì)牛奶影響的危害程度，且該基因在不同菌株中的表達(dá)水平也不一致。

表1 耐冷菌16S rRNA和耐熱蛋白酶AprX基因的鑒定

2.2 耐冷菌胞外脂肪酶和蛋白酶的熱穩(wěn)定性

為研究分離的耐冷菌所產(chǎn)胞外酶的熱穩(wěn)定性，對(duì)發(fā)酵液上清進(jìn)行90 ℃加熱處理5 min后，大部分菌株所產(chǎn)胞外脂肪酶的酶活比40 ℃處理進(jìn)一步提升(圖1A), 尤其是Z8、Z14、P4、P5和P8胞外脂肪酶活性提高1.88、2.20、2.00、2.25和3.67倍，表明原料乳中耐冷菌產(chǎn)生的脂肪酶具有很好的耐熱性，經(jīng)過巴氏殺菌后仍然會(huì)對(duì)牛奶中的脂肪產(chǎn)生很大的破壞，產(chǎn)生酸敗。多數(shù)耐冷菌菌株所產(chǎn)胞外蛋白酶70 ℃處理比40 ℃處理的酶活更高，而P11、P15和Z7菌株在90℃處理后胞外蛋白酶的酶活也比40 ℃處理分別提高1.89、1.81和2.11倍(圖1B)，表明耐冷菌不但能夠分泌耐熱蛋白酶，而且熱處理能激活蛋白酶的活性。POFFé R等[13]從53份散裝牛奶樣品中分離出143株耐冷菌，其分泌的蛋白酶熱穩(wěn)定性好，在80 ℃、90 ℃和100 ℃處理下蛋白酶的活性都增加，只有在55 ℃處理1 h和140 ℃處理2 min后酶活才下降。牛奶通常是巴氏殺菌，90 ℃處理5 min已高于普通巴氏殺菌處理?xiàng)l件，說明原料乳中如果存在耐冷菌，它們能夠產(chǎn)生的耐熱的蛋白酶和脂肪酶等胞外酶，能耐受巴氏殺菌而不影響其酶活，進(jìn)而可影響乳品品質(zhì)。

A：脂肪酶的酶活及熱穩(wěn)定性；B：蛋白酶的酶活及熱穩(wěn)定性圖1 耐冷菌的胞外酶熱穩(wěn)定性研究

2.3 不同溫度下耐冷菌的產(chǎn)酶能力

為研究耐冷菌在不同溫度下的產(chǎn)酶能力，本實(shí)驗(yàn)在4 ℃、25 ℃和37 ℃培養(yǎng)條件下測(cè)定耐冷菌胞外蛋白酶的酶活(圖2)。4 ℃時(shí)Z9表現(xiàn)具有較好的蛋白酶活性，25 ℃所有耐冷菌數(shù)量達(dá)到峰值，而37 ℃蛋白酶活顯著增加。KARLSSON MA等[14]研究也發(fā)現(xiàn)夏季環(huán)境溫度升高會(huì)導(dǎo)致較高的貯藏溫度，耐冷菌數(shù)量也隨之增加。大部分耐冷菌特別是Z3在37 ℃表現(xiàn)出很高的活性(圖2C)，這可能是牛奶在37 ℃更易變質(zhì)的原因。MENG L等[15]研究表明大多數(shù)耐冷菌2 ℃水解活性低于4 ℃、7 ℃和10 ℃，但也存在部分假單胞菌在2 ℃儲(chǔ)藏后具有更高的水解活性，表明培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響與菌株特性相關(guān)，例如熒光假單胞菌產(chǎn)酶的最適產(chǎn)酶溫度為22 ℃，其次為7 ℃和32 ℃[16]。

在4 ℃、25 ℃和37 ℃培養(yǎng)條件下測(cè)定耐冷菌胞外脂肪酶的酶活(圖3)，25 ℃脂肪酶的產(chǎn)量要高于4 ℃和37 ℃，且25 ℃會(huì)有更多菌株產(chǎn)脂肪酶，表明低溫和高溫培養(yǎng)能有效降低產(chǎn)胞外脂肪酶的耐冷菌數(shù)量。不同菌株對(duì)溫度的敏感性具有顯著差異，Z11在4 ℃和25 ℃具有較高的脂肪酶活性，而在37 ℃則沒有檢測(cè)出脂肪酶活性。Z15在低溫下會(huì)產(chǎn)生脂肪酶，37 ℃卻沒有檢測(cè)出酶活，表明較高培養(yǎng)溫度能抑制其脂肪酶的產(chǎn)生。

A：4 ℃；B：25 ℃；C：37 ℃圖3 不同溫度下耐冷菌產(chǎn)胞外脂肪酶能力

3 結(jié)論

從原料乳中共篩選出30株耐冷菌，包括29株假單胞菌和1株芽孢桿菌，表明假單胞菌在原料乳中的耐冷菌占據(jù)主導(dǎo)地位。耐冷菌所產(chǎn)胞外蛋白酶和脂肪酶具有較好的熱穩(wěn)定性，特別是Z8、Z14、P4、P5和P8菌株所產(chǎn)脂肪酶和P11、P15和Z7菌株所產(chǎn)蛋白酶熱處理后酶活顯著增強(qiáng)，均提高1.8倍以上；分離的耐冷菌在4 ℃培養(yǎng)條件下能抑制耐冷菌的蛋白酶產(chǎn)生，而37 ℃培養(yǎng)條件下對(duì)脂肪酶產(chǎn)生影響較大，表明溫度對(duì)耐冷菌產(chǎn)胞外酶有明顯影響，且較低和較高的培養(yǎng)溫度能夠抑制耐冷菌的產(chǎn)酶能力。