安加提·艾尼瓦爾，迪麗努爾·買買提依明，伊力亞爾·尼加提，楊濤，艾尼娃爾·艾克木

1 新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科；3 新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室

慢性高原病是指長(zhǎng)期生活在海拔2 500 m以上的世居者或移居者，對(duì)高原低氧環(huán)境逐漸失去習(xí)服而導(dǎo)致的臨床綜合征［1］。長(zhǎng)期高原低氧環(huán)境能夠引起肺小動(dòng)脈功能性和器質(zhì)性改變，出現(xiàn)缺氧性肺動(dòng)脈高壓和右心肥厚，進(jìn)而導(dǎo)致右心功能不全甚至全心衰竭［2-3］。目前，慢性高原病的藥物治療仍以西藥為主［4］，但西藥個(gè)體化治療復(fù)雜，并且治療效果不佳。而中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同調(diào)控作用，在慢性高原病治療中日益受到關(guān)注。黑種草子為毛茛科植物瘤果黑種草的干燥成熟種子，其提取物中含有多種活性物質(zhì)，可發(fā)揮抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等生物學(xué)作用［5-6］。有研究報(bào)道，黑種草子提取物對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部炎癥有一定治療效果［7］。此外，黑種草子提取物還能改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)新生血管成熟與穩(wěn)定［8］。但目前鮮見黑種草子提取物治療慢性高原病的報(bào)道。2018年10月—2019年10 月，本研究探討了黑種草子提取物對(duì)慢性高原病大鼠心臟損傷的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SD 大鼠50 只，SPF 級(jí)，雌雄各半，10 周齡，體質(zhì)量（200 ± 30）g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（新）2016-0003。黑種草子，購(gòu)自新疆麥迪森藥業(yè)有限公司制藥廠；硝苯地平，購(gòu)自山西云鵬制藥有限公司。西北地區(qū)平時(shí)和戰(zhàn)時(shí)衛(wèi)勤保障人工試驗(yàn)艙，由中國(guó)人民解放軍新疆軍區(qū)總醫(yī)院提供；小動(dòng)物呼吸機(jī)，購(gòu)自北京科思佳科技有限責(zé)任公司；BL-420S 型多道生理記錄儀，購(gòu)自成都泰盟軟件有限公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；DM3000 型光學(xué)顯微鏡，購(gòu)自德國(guó)Leica公司。大鼠C反應(yīng)蛋白（CRP）ELISA 試劑盒，購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；大鼠血管緊張素原（AGT）ELISA 試劑盒，購(gòu)自亞諾法生技（中國(guó)臺(tái)灣）股份有限公司；大鼠胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）ELISA 試劑盒，購(gòu)自上海安迪生物科技有限公司；大鼠載脂蛋白C1（ApoC1）ELISA 試劑盒，購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

1.2 大鼠慢性高原病模型構(gòu)建 采用分層隨機(jī)抽樣法，按照雌雄混雜因素分層，隨機(jī)選取SD大鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后置于西北地區(qū)平時(shí)和戰(zhàn)時(shí)衛(wèi)勤保障人工試驗(yàn)艙構(gòu)建慢性高原病模型。該試驗(yàn)艙環(huán)境設(shè)置：海拔5 000 m，大氣壓54.1 kPa，氧分壓10.84 kPa，溫度18～26 ℃，濕度40%～60%。SD 大鼠在試驗(yàn)艙內(nèi)分籠飼養(yǎng)，每組10只，雌雄各半，自由飲水和攝食。建模期間，每日觀察SD大鼠是否存在毛發(fā)脫落、大小便失禁以及口、鼻、眼分泌物等。建模30 d測(cè)量肺動(dòng)脈壓，肺動(dòng)脈壓≥30 mmHg提示模型構(gòu)建成功。

1.3 黑種草子提取物制備 將黑種草子的干燥成熟果實(shí)清洗干凈，晾干后粉碎，制成黑種草子粗粉。按料液比1∶30加入石油醚，在60 ℃下回流提取4 h，過(guò)3 號(hào)篩，備用。取黑種草子粉末按料液比1∶25 加入蒸餾水，在80 ℃下回流提取1.5 h，回收濾液；待濾液冷卻后，以5 000 r/min 離心15 min、離心半徑8.2 cm，留取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，在真空干燥箱內(nèi)烘干后研磨，獲得黑種草子水提物粉末。另取黑種草子粉末，按料液比1∶25 加入60%乙醇，在80 ℃下回流提取1.5 h，回收濾液。待濾液冷卻后，以5 000 r/min離心15 min、離心半徑8.2 cm，留取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，在真空干燥箱內(nèi)烘干后研磨，獲得黑種草子醇提物粉末［9］。

1.4 動(dòng)物分組干預(yù) 采用分層隨機(jī)抽樣法將慢性高原病模型大鼠隨機(jī)分為高原組、硝苯地平組、黑種草子醇提組和黑種草子水提組，每組10 只，雌雄各半。建模成功后，硝苯地平組予硝苯地平2.70 mg/kg灌胃［10］，黑種草子醇提組予黑種草子醇提物150 mg/kg灌胃［11］，黑種草子水提組予黑種草子水提物150 mg/kg灌胃，每天1次，持續(xù)15 d。高原組繼續(xù)在高原環(huán)境下飼養(yǎng)15 d，不予藥物干預(yù)。剩余10只SD大鼠作為平原組，在海拔720 m、溫度22～28 ℃、濕度60%～80%、大氣壓93.20 kPa、氧分壓19.54 kPa的平原環(huán)境下飼養(yǎng)45 d，自由飲水和攝食，不予藥物干預(yù)［12］。

1.5 肺動(dòng)脈壓檢測(cè) 硝苯地平組、黑種草子醇提組和黑種草子水提組末次灌胃次日，高原組和平原組同期，腹腔注射10%水合氯醛，待大鼠完全麻醉后固定于動(dòng)物解剖實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，剪開右側(cè)頸部皮膚，沿胸骨正中線切開，分離右側(cè)皮下脂肪組織，充分顯露頸外靜脈。使用24G靜脈留置針以45°角穿刺進(jìn)針約10 mm，撤出針芯，將經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)（PTCA）導(dǎo)絲沿套管置入并前行至上腔靜脈，撤出套管將PV-1聚乙烯塑料管沿導(dǎo)絲送入頸外靜脈，并結(jié)扎右側(cè)頸外靜脈遠(yuǎn)心端，退出PTCA 導(dǎo)絲。用0.3%肝素生理鹽水充滿的三通管與壓力換能器、生理信號(hào)記錄系統(tǒng)相連，將心導(dǎo)管緩慢送入右心室，當(dāng)出現(xiàn)肺動(dòng)脈波形時(shí)立即固定靜脈插管，并記錄肺動(dòng)脈壓。

1.6 血清CRP、AGT、IGF-1、ApoC1檢測(cè) 肺動(dòng)脈壓檢測(cè)完成后，采集大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，置于真空采血管中，室溫下自然凝固30 min，3 000 r/min 離心20 min、離心半徑8.2 cm，留取上層血清。采用ELISA法檢測(cè)血清CRP、AGT、IGF-1、ApoC1。

1.7 心臟病理形態(tài)觀察 腹主動(dòng)脈取血后，頸椎脫臼處死，完整取出心臟，生理鹽水清洗干凈。取部分心肌組織，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。37 ℃烘箱烤片12 h，常規(guī)HE染色，中性樹膠封固，顯微鏡下拍照觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺動(dòng)脈壓比較 平原組、高原組、硝苯地平組、黑種草子醇提組和黑種草子水提組肺動(dòng)脈壓分別為（20.53 ± 1.85）、（43.48 ± 2.29）、（28.65 ±1.06）、（37.15 ± 0.84）、（39.17 ± 0.68）mmHg。與平原組比較，高原組肺動(dòng)脈壓顯著升高（P＜0.05）；與高原組比較，硝苯地平組、黑種草子醇提組和黑種草子水提組肺動(dòng)脈壓顯著降低（P 均＜0.05）；與硝苯地平組比較，黑種草子醇提組和黑種草子水提組肺動(dòng)脈壓顯著升高（P 均＜0.05）；與黑種草子醇提組比較，黑種草子水提組肺動(dòng)脈壓顯著升高（P＜0.05）。

2.2 各組血 清CRP、AGT、IGF-1、ApoC1 水平比較 見表1。

表1 各組血清CRP、AGT、IGF-1、ApoC1水平比較（±s）

表1 各組血清CRP、AGT、IGF-1、ApoC1水平比較（±s）

注：與平原組比較，*P＜0.05；與高原組比較，#P＜0.05；與硝苯地平組比較，△P＜0.05；與黑種草子醇提組比較，▲P＜0.05。

組別平原組高原組硝苯地平組黑種草子醇提組黑種草子水提組n 10 10 10 10 10 CRP（ng/L）59.66±3.67 213.03±7.15*159.62±6.42#81.11±4.28#△94.66±4.63#△▲AGT（pg/mL）104.86±2.51 219.63±3.23*146.42±2.76#196.60±4.70#△155.35±6.71#△▲IGF-1（ng/mL）1 013.96±11.54 1 235.09±18.85*703.60±10.74#1 355.80±30.81#△1 154.72±21.99#△▲ApoC1（pg/mL）1 588.53±19.40 938.06± 8.61*1 016.42±13.69#859.51±23.35#△1 022.87±21.15#▲

2.3 各組心臟病理形態(tài)變化 平原組心肌纖維有序整齊排列，橫紋清晰，心肌細(xì)胞染色清楚，細(xì)胞核清晰致密，心臟組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常。高原組心臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，心肌纖維排列不規(guī)則，橫紋不清晰，心肌纖維呈明顯顆粒樣病變，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)血管明顯充血、水腫，并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。硝苯地平組心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維發(fā)生顆粒樣變，但心外膜下未見明顯異常病變，心肌間質(zhì)血管少量出血點(diǎn)，但未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。黑種草子水提組心肌纖維排列不規(guī)則，橫紋模糊，部分心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張并有明顯出血、水腫，心肌細(xì)胞明顯顆粒樣變并有少量嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)。黑種草子醇提組心外膜下較薄，心臟組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常，心肌纖維排列整齊清晰，但有輕度顆粒樣變，未見明顯嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)血管無(wú)明顯充血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討論

隨著海拔升高，大氣氧分壓和空氣含氧量逐漸降低，人體內(nèi)的動(dòng)脈氧分壓也會(huì)逐漸降低并出現(xiàn)組織缺氧。長(zhǎng)期處于低壓低氧狀態(tài)會(huì)引起機(jī)體一系列變化，如血管結(jié)構(gòu)病變、血流動(dòng)力學(xué)改變及體液因子變化，造成肺動(dòng)脈血管重構(gòu)、血液阻力增加，最終發(fā)展為缺氧性肺動(dòng)脈高壓［13］。硝苯地平是一種鈣通道拮抗劑，能夠有效控制低氧性肺血管收縮，促進(jìn)肺部血管擴(kuò)張，降低右心負(fù)荷和血管阻力，從而抑制慢性高原病病情進(jìn)展。

黑種草子為毛茛科植物瘤果黑種草的干燥成熟種子，在我國(guó)主要產(chǎn)于新疆及云南傣族聚居區(qū)。黑種草子因其藥用價(jià)值而聞名于世，可用于治療哮喘、支氣管炎、風(fēng)濕等疾病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，黑種草子水提物對(duì)艾氏腹水瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤和抗氧化作用［14］。有研究報(bào)道，黑種草子醇提物中總黃酮、總皂苷和總生物堿具有抗血小板聚集作用，其總生物堿還具有舒張血管作用［8］。此外，黑種草子醇提物還可改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)新生血管成熟與穩(wěn)定［8］。本研究結(jié)果顯示，連續(xù)30 d 模擬高原環(huán)境飼養(yǎng)，高原組肺動(dòng)脈壓較平原組顯著升高，并且其平均肺動(dòng)脈壓≥40 mmHg，提示大鼠慢性高原病模型構(gòu)建成功。與高原組比較，硝苯地平組、黑種草子醇提組和黑種草子水提組肺動(dòng)脈壓顯著降低；與硝苯地平組比較，黑種草子醇提組和黑種草子水提組肺動(dòng)脈壓顯著升高；與黑種草子醇提組比較，黑種草子水提組肺動(dòng)脈壓顯著升高。病理結(jié)果顯示，硝苯地平組心肌間質(zhì)血管少量出血點(diǎn)，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；黑種草子水提組心肌間質(zhì)血管明顯充血、水腫，心肌細(xì)胞明顯顆粒樣變并有少量嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)；黑種草子醇提組未見明顯嗜酸性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌間質(zhì)血管無(wú)明顯充血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。提示黑種草子提取物能夠降低慢性高原病大鼠肺動(dòng)脈壓，改善其心臟病理形態(tài)。

CRP是一種急性時(shí)相蛋白，當(dāng)機(jī)體遭遇創(chuàng)傷、應(yīng)激或感染時(shí)，血清CRP 水平明顯升高。有研究表明，機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂與肺動(dòng)脈壓升高密切相關(guān)［15］。在高原環(huán)境下，持續(xù)低氧刺激能夠?qū)е聶C(jī)體血壓升高，還會(huì)使血管內(nèi)皮損傷和功能障礙，加之炎癥因子刺激，最終可能會(huì)引起動(dòng)脈粥樣硬化。ApoC1 不僅具有一定抗炎作用，還具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。在高血壓、心肌肥厚等疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）扮演重要角色，而RAS活性受AGT直接調(diào)控。血管內(nèi)皮損傷后，AGT 通過(guò)一系列反應(yīng)生成有生物學(xué)活性的AngⅡ。AngⅡ能夠介導(dǎo)血壓升高并導(dǎo)致心肌肥厚。IGF-1是由70 個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，在心血管疾病、糖尿病及創(chuàng)面修復(fù)等病理生理過(guò)程中具有重要作用。此外，作為體內(nèi)重要的生長(zhǎng)因子，IGF-1 還能調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程。有研究報(bào)道，IGF-1 可通過(guò)上調(diào)AngⅡ受體表達(dá)推動(dòng)血壓升高，從而促進(jìn)心肌和血管重構(gòu)［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與高原組比較，黑種草子醇提組和黑種草子水提組心臟組織病變有所改善且肺動(dòng)脈壓降低，說(shuō)明黑種草子提取物對(duì)慢性高原病大鼠受損的心臟組織有一定修復(fù)作用。高原組血清CRP水平上升，血清ApoC1水平下降，提示在高原環(huán)境下大鼠體內(nèi)出現(xiàn)了明顯的炎癥反應(yīng)。與高原組相比，硝苯地平組、黑種草子醇提組和黑種草子水提組血清CRP水平均有不同程度下降，以黑種草子提取物效果更明顯。與高原組比較，硝苯地平組和黑種草子水提組血清ApoC1水平顯著上升，提示黑種草子提取物不僅具有抗炎作用，還能改善體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂。病理結(jié)果顯示，藥物干預(yù)后大鼠心肌間質(zhì)血管無(wú)明顯充血和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以黑種草子醇提組效果更好。與高原組比較，硝苯地平組、黑種草子醇提組和黑種草子水提組血清AGT水平均有不同程度下降，以硝苯地平組效果更好。與高原組比較，硝苯地平組和黑種草子水提組血清IGF-1水平均顯著降低，其中黑種草子水提組血清IGF-1水平與平原組較為接近。提示黑種草子水提物對(duì)血清AGT、IGF-1水平均有一定調(diào)控作用，能夠通過(guò)調(diào)控肺動(dòng)脈壓而逆轉(zhuǎn)心肌肥厚。

綜上所述，黑種草子提取物能夠通過(guò)調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈壓、減輕炎癥反應(yīng)來(lái)改善慢性高原病大鼠心臟損傷。