鄭少秋，羅敬，盧善明，劉清華，謝壽城，劉堃，謝玉珍

1 梅州市人民醫(yī)院病理科，廣東梅州 514000；2 梅州市人民醫(yī)院盆腔放療科

瘤芽是腫瘤浸潤前緣分散在間質(zhì)的單個腫瘤細(xì)胞或5 個以下的腫瘤細(xì)胞簇，是許多實(shí)體瘤預(yù)后的獨(dú)立影響因素［1］。在國際癌癥控制聯(lián)盟、美國癌癥聯(lián)合委員會和世界衛(wèi)生組織發(fā)布的癌癥分類指南中，瘤芽均被列為腫瘤預(yù)后的獨(dú)立影響因素［2］。瘤芽與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)，近年來受到廣泛關(guān)注。但目前關(guān)于宮頸鱗癌瘤芽的研究較少，且未形成統(tǒng)一的瘤芽評估標(biāo)準(zhǔn)。本研究比較了不同瘤芽評估對象與計(jì)數(shù)方法，旨在探索一種一致性高的宮頸鱗癌瘤芽評估方法，以期為宮頸鱗癌瘤芽評估標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018 年1 月—12 月梅州市人民醫(yī)院收治的宮頸鱗癌患者95 例。所有患者經(jīng)組織病理檢查明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合宮頸鱗癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；②初診；③接受宮頸癌根治術(shù)；④入院前未接受任何抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤者；②合并心、肝、腎等重要臟器嚴(yán)重疾病者；③未規(guī)范治療者。患者年齡26～78 歲、中位年齡52 歲，F(xiàn)IGO 分期：ⅠB 期43 例、ⅡA 期52 例，有脈管侵犯43例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例。本研究經(jīng)梅州市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批件編號：梅市倫審2019-C-51），患者或其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 瘤芽評估 ①瘤芽判斷：參照HASE 等［3］研究結(jié)果，在腫瘤浸潤前緣孤立的單個腫瘤細(xì)胞或少于5 個腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞簇。②瘤芽評估對象篩選：隨機(jī)選取50 例份宮頸鱗癌組織HE 染色切片，由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師分別篩選出腫瘤浸潤最深切片和瘤芽密度最大切片并記錄切片號。同一病例，若兩名病理醫(yī)師選取的腫瘤浸潤最深和瘤芽密度最大切片為同一切片，則篩選結(jié)果一致，反之則篩選結(jié)果不一致。統(tǒng)計(jì)分析兩名病理醫(yī)師篩選腫瘤浸潤最深切片和瘤芽密度最大切片的一致率，并計(jì)算腫瘤浸潤最深切片與瘤芽密度最大切片為同一切片的概率。③瘤芽計(jì)數(shù)：選取50例份宮頸鱗癌組織中瘤芽密度最大切片，分別由兩名病理醫(yī)師在20 × 物鏡（0.785 mm2，20 mm）下進(jìn)行瘤芽計(jì)數(shù)。選擇瘤芽密度最大的視野計(jì)數(shù)單視野最高瘤芽數(shù)，采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）評估兩名病理醫(yī)師計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性。以瘤芽密度最大的視野為中心，向左右兩側(cè)平移獲取10 個不重疊視野，計(jì)數(shù)10 個視野的瘤芽總數(shù)，獲取每視野平均瘤芽數(shù)，采用ICC 評估兩名病理醫(yī)師計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性。篩選一致性高的計(jì)數(shù)方法。④截取瘤芽評估閾值：選擇一致性高的瘤芽評估對象和計(jì)數(shù)方法對95例份宮頸鱗癌組織HE染色切片重新進(jìn)行瘤芽評估，采用受試者工作特征（ROC）曲線分析瘤芽數(shù)對宮頸鱗癌脈管侵犯的預(yù)測效能，并獲取瘤芽數(shù)的最佳截?cái)嘀怠８鶕?jù)最佳截?cái)嘀祫澐指吡鲅拷M、低瘤芽組，比較兩組脈管侵犯的發(fā)生率，并分析脈管侵犯與瘤芽數(shù)的關(guān)系。

1.2.2 CK、p63、p40免疫組化染色 取宮頸鱗癌組織蠟塊，3～4 μm 厚連續(xù)切片。切片經(jīng)65 ℃烤片1 h，常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫孵育8 min 以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，微波爐100 ℃熱抗原修復(fù)20 min；封閉液中室溫封閉5 min 后，分別加入鼠抗人CK、p63 和兔抗人p40 一抗，室溫孵育20～35 min；然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育8 min；最后DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

CK 陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，p63、p40陽性染色定位于細(xì)胞核，均呈棕黃色顆粒狀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。一致性檢驗(yàn)采用ICC，ICC＜0.4 表示一致性差，ICC＞0.75 表示一致性良好。相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析法。預(yù)測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘤芽評估結(jié)果 在腫瘤浸潤最深切片的篩選中，兩名病理醫(yī)師篩選結(jié)果一致41 例、不一致9 例，一致率為82%；在瘤芽密度最大切片的篩選中，兩名病理醫(yī)師篩選結(jié)果一致36 例、不一致14 例，一致率為72%。兩名病理醫(yī)師篩選腫瘤浸潤最深切片的一致率雖然高于篩選瘤芽密度最大切片的一致率，但二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩名病理醫(yī)師篩選腫瘤浸潤最深切片和瘤芽密度最大切片為同一切片的概率分別為28%（14/50）、36%（18/50）。

兩名病理醫(yī)師計(jì)數(shù)瘤芽密度最大切片單視野最高瘤芽數(shù)的ICC 為0.769，計(jì)數(shù)10 個視野平均瘤芽數(shù)的ICC為0.346。

瘤芽密度最大切片單視野最高瘤芽數(shù)預(yù)測宮頸鱗癌脈管侵犯的ROC 曲線下面積為0.736（95%CI：0.636～0.836），其最佳截?cái)嘀禐?.5 個，此時其預(yù)測宮頸鱗癌脈管侵犯的靈敏度為62.8%、特異度為73.1%。根據(jù)瘤芽密度最大切片單視野最高瘤芽數(shù)將95 例宮頸鱗癌患者分為高瘤芽組（單視野最高瘤芽數(shù)≥3個，最佳截?cái)嘀禐?.5個，實(shí)際工作中取最小整數(shù)）44 例、低瘤芽組（單視野最高瘤芽數(shù)＜3 個）51例。高瘤芽組脈管侵犯的發(fā)生率為68.2%（30/44），低瘤芽組為25.5%（13/51），高瘤芽組脈管侵犯的發(fā)生 率 顯 著 高 于 低 瘤 芽 組（χ2=23.22，P＜0.05）。Spearman 相關(guān)分析顯示，宮頸鱗癌患者脈管侵犯與瘤芽數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.466，P＜0.01）。

2.2 CK、p63、p40免疫組化染色結(jié)果 瘤芽與無核細(xì)胞微滴CK 染色均呈陽性（見圖1），而部分腫瘤細(xì)胞p63、p40表達(dá)缺失（見圖2、3）。

圖1 宮頸鱗癌組織CK染色結(jié)果（免疫組化染色，10×）

3 討論

圖2 宮頸鱗癌組織p63染色結(jié)果（免疫組化染色，10×）

圖3 宮頸鱗癌組織p40染色結(jié)果（免疫組化染色，20×）

宮頸鱗癌是女性第二大常見惡性腫瘤，雖然近年來宮頸鱗癌的診治取得了長足進(jìn)步，但由于其易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，臨床結(jié)局仍不盡如人意［4］。黃邦杏［5］研究報(bào)道，高瘤芽是宮頸癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險因素，也是早期宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和死亡的獨(dú)立危險因素。任燕［6］研究表明，瘤芽不僅與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度低密切相關(guān)，還與血管和淋巴結(jié)侵犯有關(guān)。因此，瘤芽可能是宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立影響因素［7］。但目前國際上對宮頸癌瘤芽評估尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。

在不同的研究中，學(xué)者們對瘤芽評估對象的選擇不同［8-10］。TANAKA 等［9］選擇腫瘤浸潤最深切片進(jìn)行評估，而HORCIC 等［10］則選擇瘤芽密度最大切片進(jìn)行評估。由于不同病理醫(yī)師對腫瘤浸潤最深切片或瘤芽密度最大切片的選擇存在主觀性，導(dǎo)致其選擇一致性可能存在偏差，從而對評估方法的可重復(fù)性產(chǎn)生影響。為此，本研究首先比較了不同病理醫(yī)師選擇腫瘤浸潤最深切片和瘤芽密度最大切片的一致性。結(jié)果表明，與篩選瘤芽密度最大切片的一致性比較，不同病理醫(yī)師選擇腫瘤浸潤最深切片的一致性較高，但二者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故認(rèn)為以腫瘤浸潤最深切片為評估對象并不能提高其一致性。瘤芽具有不沿侵襲性邊界均勻分布的特征，故對同一病例不同切片進(jìn)行瘤芽計(jì)數(shù)，結(jié)果可能大不相同。本研究結(jié)果顯示，不同病理醫(yī)師篩選腫瘤浸潤最深切片與瘤芽密度最大切片為同一切片的概率較低，表明對腫瘤浸潤最深切片進(jìn)行瘤芽計(jì)數(shù)并不能很好地反映瘤芽密度。瘤芽密度是惡性腫瘤預(yù)后的獨(dú)立危險因素。因此，以瘤芽密度最大切片作為瘤芽評估對象具有更高的臨床價值。

對于評估是基于單視野最高瘤芽數(shù)還是多視野平均瘤芽數(shù)，不同學(xué)者持不同意見［11-15］。HUANG等［14］以單視野最高瘤芽數(shù)作為評估對象，并把最高瘤芽數(shù)≥5 個作為高瘤芽標(biāo)準(zhǔn)；OLSEN 等［15］以10 個視野的平均瘤芽數(shù)作為評估對象，并把平均瘤芽數(shù)≥1 個作為高瘤芽標(biāo)準(zhǔn)。評估對象不同，高瘤芽的閾值亦有所不同。本研究中，兩名病理醫(yī)師評估單視野最高瘤芽數(shù)的一致性高于評估10 個視野的平均瘤芽數(shù)。這可能與評估10 個視野瘤芽數(shù)比評估單視野瘤芽數(shù)受視野選擇和移動的影響更大有關(guān)。此外，在局灶性高瘤芽的病例中，計(jì)數(shù)多個視野平均瘤芽數(shù)可能會“稀釋”最終的瘤芽數(shù)。因此，計(jì)數(shù)單視野最高瘤芽數(shù)比多個視野的平均瘤芽數(shù)能夠更好地反映浸潤前沿的瘤芽［16-17］。以計(jì)數(shù)瘤芽密度最大切片單視野最高瘤芽數(shù)為評估對象，觀察者之間的主觀差異較小，可重復(fù)性高、可操作性強(qiáng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在瘤芽密度最大切片中單視野最高瘤芽數(shù)對宮頸鱗癌脈管侵犯具有較高的預(yù)測效能，高瘤芽組脈管侵犯的發(fā)生率顯著高于低瘤芽組；Spearman 相關(guān)分析顯示，宮頸鱗癌患者脈管侵犯與瘤芽數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。進(jìn)一步證實(shí)瘤芽密度最大切片單視野最高瘤芽數(shù)的臨床價值更高。

SHINTO 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，CK 免疫組化染色除了能標(biāo)記廇芽外，還能標(biāo)記無核細(xì)胞微滴。本研究發(fā)現(xiàn)，瘤芽與無核細(xì)胞微滴CK染色均呈陽性，提示CK陽性染色能夠增加瘤芽計(jì)數(shù)。此外，凋亡小體亦可能因CK 陽性染色被認(rèn)為是瘤芽而被納入計(jì)數(shù)［4］，從而導(dǎo)致瘤芽數(shù)被高估。而p63、p40 在腫瘤細(xì)胞中存在表達(dá)缺失情況，故采用p63、p40 免疫組化染色切片進(jìn)行瘤芽計(jì)數(shù)可能導(dǎo)致瘤芽數(shù)被低估。因此，應(yīng)采用HE 染色切片進(jìn)行宮頸鱗癌瘤芽評估，而且HE染色在臨床上更易推廣。

綜上所述，通過HE 染色評估瘤芽密度最大切片單視野最高瘤芽數(shù)是簡單易行、重復(fù)性較高的宮頸鱗癌瘤芽評估方法；瘤芽數(shù)≥3 個定義為高瘤芽，其對宮頸鱗癌脈管侵犯具有較高的預(yù)測效能，高瘤芽預(yù)示其脈管侵犯的發(fā)生風(fēng)險較高。