唐永軍，張紅玉，吳勤奮

新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，烏魯木齊 830011

膿毒癥是一個高致死率的臨床綜合征［1］。有研究認為，肺損傷是導致膿毒癥患者死亡的主要原因之一［2］。目前認為，膿毒癥介導的失控性炎癥反應是導致肺損傷發(fā)生的重要機制［3］。微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，在膿毒癥并發(fā)肺損傷過程中發(fā)揮重要作用［4］。miR-98-5p是一種高度保守的miRNA，與膿毒癥全身炎癥反應激活密切相關(guān)［5］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）是一種胞內(nèi)接頭蛋白，可通過與多種信號分子結(jié)合激活核因子κB（NF-κB）信號通路，從而導致炎癥反應發(fā)生［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，TRAF6/NF-κB 信號通路在膿毒癥肺損傷模型中被激活［7］。但目前鮮見血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 表達與膿毒癥并發(fā)肺損傷關(guān)系的報道。為此，我們進行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020 年1 月—2022 年3 月新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院收治的膿毒癥患者172 例（觀察組）。膿毒癥診斷依據(jù)《中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南（2018）》［8］。納入標準：①符合膿毒癥診斷標準；②年齡≥18 歲；③臨床資料完整。排除標準：①合并心源性肺水腫、慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核等肺部疾病者；②合并造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)損害者；③合并惡性腫瘤者；④既往有肺損傷史者。其中，男120 例、女52 例，年齡32～88（68.41±13.84）歲，BMI 18.4～28.7（23.73 ± 2.34）kg/m2，基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?3 例、糖尿病54例、腦血管病69 例、冠心病37 例、慢性腎臟病10 例；感染部位：腹腔感染44例、導管相關(guān)血流感染48例、泌尿系統(tǒng)感染62例、其他感染19 例；膿毒癥分級［8］：膿毒癥50例、嚴重膿毒癥70例、膿毒性休克52例。同期另選在新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院體檢健康的志愿者56例（對照組），男37 例、女19 例，年齡24～86（66.68 ± 10.65）歲，BMI 19.8～27.2（23.17 ± 1.87）kg/m2。兩組性別、年齡、BMI 具有可比性。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理審批號：20211012-07C），所有研究對象或其家屬知情同意。

1.2 肺損傷診斷標準 肺損傷診斷依據(jù)《急性呼吸窘迫綜合征：柏林定義》［9］：①起病時間：從已知臨床損害以及新發(fā)系統(tǒng)癥狀或加重到符合診斷的時間≤7 d；②胸部影像學：不能用結(jié)節(jié)、大葉/肺不張、積液來解釋的雙肺致密影；③肺水腫原因：不能用液體過度負荷或心力衰竭來完全解釋的呼吸衰竭；④呼氣末正壓或持續(xù)氣道正壓≤5 cmH2O，血氧分壓/吸入氧濃度≤300 mmHg。膿毒癥患者符合上述4 項即可判定合并肺損傷。172例膿毒癥患者中，入住ICU期間并發(fā)肺損傷59例、未并發(fā)肺損傷113例。

1.3 血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 檢測 所有研究對象入院次日采集清晨空腹外周靜脈血5 mL，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min、離心半徑10 cm，留取上層血清。采用TRIzol法提取血清總RNA，經(jīng)紫外可見分光光度計鑒定，提取的總RNA 純度和濃度合格。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃1 h，95 ℃5 min。以cDNA為模板，按SYBR Green qPCR Mix試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列由北京深藍云生物科技有限公司設(shè)計合成。miR-98-5p 上游引物5"-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3′、下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAG-3"，U6上游引物5"-GTGTTCCTACCCCCAATGTG-3"、下游引物5"-CATCGAAGGTGGAAGAGTGG-3"；TRAF6 mRNA上游引物5′-TCTGGAAAACCTTCCTGCTG-3"、下游引物5"-CCGGCACATAGGTAAAAGGA-3"，β-actin 上游引物5"-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3"、下游引物5"-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3"。PCR 反應體系共20 μL：SYBR?Premix Ex Taq 10 μL，cDNA 模板2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase Free H2O 6.0 μL；反應條件：95 ℃90 s，95 ℃30 s、63 ℃30 s、72 ℃15 s 共45 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA相對表達量。

1.4 資料收集分析 收集膿毒癥患者臨床資料，包括性別、年齡、BMI、基礎(chǔ)疾病（高血壓、糖尿病、腦血管病、冠心病、慢性腎臟病）、感染部位（腹腔感染、導管相關(guān)血流感染、泌尿系統(tǒng)感染、其他）、膿毒癥分級（膿毒癥、嚴重膿毒癥、膿毒性休克）、入住ICU時間、機械通氣、機械通氣時間和入院時體溫、心率、呼吸頻率、平均動脈壓、血小板計數(shù)、白細胞計數(shù)、血糖、血肌酐、血乳酸、膿毒癥相關(guān)器官衰竭評估（SOFA）評分［8］以及血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 表達。比較膿毒癥患者并發(fā)肺損傷者與未并發(fā)肺損傷者上述臨床資料，將有統(tǒng)計學差異的指標納入多因素Logistic回歸模型，分析膿毒癥并發(fā)肺損傷的影響因素。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS28.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以±s 表示，結(jié)果比較采用t 檢驗；偏態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，結(jié)果比較采用U 檢驗。計數(shù)資料比較采用χ2或U 檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。危險因素分析采用多因素Logistic 回歸模型。預測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，曲線下面積（AUC）比較采用Hanley & McNeil 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 表達比較 見表1。

表1 兩組血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA相對表達量比較（±s）

表1 兩組血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA相對表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與同組未并發(fā)肺損傷者比較，#P＜0.05。

組別觀察組并發(fā)肺損傷者未并發(fā)肺損傷者對照組n 172 59 113 56 miR-98-5p 1.07±0.32*0.87±0.28#1.18±0.28 2.19±0.39 TRAF6 mRNA 2.12±0.54*2.48±0.43#1.93±0.49 0.94±0.13

2.2 膿毒癥患者血清miR-98-5p表達與TRAF6 mRNA表達的關(guān)系 Pearson 相關(guān)分析顯示，膿毒癥患者血清miR-98-5p 表達與TRAF6 mRNA 表達呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.768，P＜0.01）。

2.3 膿毒癥并發(fā)肺損傷的危險因素分析 膿毒癥患者并發(fā)肺損傷者與未并發(fā)肺損傷者臨床資料比較見表2。以膿毒癥患者是否并發(fā)肺損傷（是=1，否=0）為因變量，以膿毒癥分級（膿毒癥=1，嚴重膿毒癥=2，膿毒性休克=3）、入住ICU 時間、機械通氣（有=1，無=0）、機械通氣時間、血乳酸、SOFA評分、miR-98-5p、TRAF6 mRNA為自變量，納入多因素Logistic回歸模型。結(jié)果顯示，膿毒性休克、入住ICU 時間延長、機械通氣時間延長、血乳酸水平升高、SOFA 評分增加、TRAF6 mRNA 表達升高為膿毒癥并發(fā)肺損傷的獨立危險因素，而miR-98-5p 表達升高則為其獨立保護因素（P均＜0.05）。見表3。

2.4 血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 表達對膿毒癥并發(fā)肺損傷的預測價值 ROC 曲線分析顯示，血清miR-98-5p 表達預測膿毒癥并發(fā)肺損傷的AUC 為0.794（95%CI：0.726～0.852），其cut off值為1.04，此時其預測膿毒癥并發(fā)肺損傷的靈敏度為81.36%、特異度為69.03%；血清TRAF6 mRNA 表達預測膿毒癥并發(fā)肺損傷的AUC 為0.791（95% CI：0.722～0.849），其cut off值為1.89，此時其預測膿毒癥并發(fā)肺損傷的靈敏度為94.92%、特異度為47.79%；血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 表達聯(lián)合預測膿毒癥并 發(fā) 肺 損 傷 的AUC 為0.871（95% CI：0.812～0.917），其預測膿毒癥并發(fā)肺損傷的靈敏度為74.58%、特 異 度 為86.73%。 血 清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 表達聯(lián)合預測膿毒癥并發(fā)肺損傷的AUC顯著高于血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA表達單獨（Z分別為2.607、3.143，P均＜0.01）。

3 討論

膿毒癥肺損傷的病因和發(fā)病機制錯綜復雜，炎癥消退延遲、炎癥自限性機制破壞、炎癥消退障礙等引起的失控性炎癥反應是其發(fā)生的重要病理生理基礎(chǔ)［2］。目前，針對膿毒癥肺損傷臨床尚無特效藥物。因此，早期預測膿毒癥肺損傷對指導臨床個體化治療和改善患者預后至關(guān)重要。

miRNA 是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA 分子，可通過與mRNA的3"非翻譯區(qū)特異性結(jié)合而降解或抑制其翻譯，從而調(diào)控靶基因的表達。近年研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥肺損傷可引起多種miRNA 異常表達［4］。miR-98-5p是一個具有抗炎作用的miRNA，定位于人染色體Xp11.22。有研究報道，miR-98-5p 能夠通過靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1 而抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠氣道IL-6、IL-8、TNF-α 等炎癥因子分泌，還能通過靶向Rac 家族小GTPase1 而抑制IL-13 誘導的氣道炎癥反應［10-11］。董青等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-98-5p在機械通氣誘導的肺損傷小鼠肺組織中表達下調(diào)。巫興陽等［5］研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血清miR-98-5p 表達下調(diào)與全身炎癥反應激活有關(guān)。這些研究表明，miR-98-5p可能與膿毒癥肺損傷有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清miR-98-5p 表達顯著低于對照組，膿毒癥患者并發(fā)肺損傷者血清miR-98-5p 表達顯著低于未并發(fā)肺損傷者；多因素Logistic 回歸分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-98-5p 表達升高是膿毒癥并發(fā)肺損傷的獨立保護因素。進一步證實，血清miR-98-5p 表達降低與膿毒癥并發(fā)肺損傷密切相關(guān)，其機制可能與miR-98-5p 能夠靶向抑制Toll樣受體4（TRL4）介導的炎癥反應有關(guān)。TRL4能夠結(jié)合NF-κB 形成TRL4/NF-κB 炎癥信號通路，從而參與炎癥反應，而miR-98-5p 則可靶向抑制TLR4誘導的膿毒癥肺損傷［13］。

表2 膿毒癥患者并發(fā)肺損傷者與未并發(fā)肺損傷者臨床資料比較

表3 膿毒癥并發(fā)肺損傷的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

TRAF 是一類重要的細胞內(nèi)信號傳導因子，在炎癥反應、氧化應激等病理過程中激活和表達，從而參與調(diào)控c-Jun 氨基末端激酶、NF-κB 等信號通路激活［14］。TRAF6 為TRAF 家族成員之一。有研究表明，TRAF6能夠激活TLR4/NF-κB 信號通路，從而參與炎癥反應，抑制TRAF6 則抑制TLR4/NF-κB 信號通路，通過促進巨噬細胞M2 極化來改善脂多糖誘導的膿毒癥炎癥反應［6，15］。有研究報道，TRAF6 在脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠肺組織中表達上調(diào)，抑制TRAF6表達則能改善其肺部炎癥［16］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組血清TRAF6 mRNA表達顯著高于對照組，其原因可能與膿毒癥患者全身炎癥反應激活有關(guān)；膿毒癥患者并發(fā)肺損傷者血清TRAF6 mRNA表達顯著高于未并發(fā)肺損傷者，并且血清TRAF6 mRNA表達升高為膿毒癥并發(fā)肺損傷的獨立危險因素。進一步證實，血清TRAF6 mRNA 表達與膿毒癥并發(fā)肺損傷密切相關(guān)。究其原因，TRAF6 表達上調(diào)能夠激活TLR4/NF-κB 信號通路，增強肺部炎癥反應，從而導致膿毒癥肺損傷的發(fā)生風險增加。本研究相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者血清miR-98-5p 表達與TRAF6 mRNA 表達呈負相關(guān)關(guān)系，提示二者可能共同參與膿毒癥并發(fā)肺損傷的病理過程。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，膿毒性休克、入住ICU 時間延長、機械通氣時間延長、血乳酸水平升高、SOFA評分增加是膿毒癥并發(fā)肺損傷的獨立危險因素。膿毒性休克和血乳酸水平升高均可反映組織器官灌注不足，肺臟在組織血流灌注不足狀態(tài)下易出現(xiàn)肺缺血損傷，故肺損傷的發(fā)生風險增加。入住ICU 時間延長和機械通氣時間延長可反映膿毒癥患者病情更加危重，故其肺損傷的發(fā)生風險增加。SOFA 評分作為膿毒癥的診斷指標之一，其分值越高說明患者機體狀況越差，其肺損傷的發(fā)生風險越高。本研究ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA表達聯(lián)合預測膿毒癥并發(fā)肺損傷的AUC 顯著高于血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 表達單獨，表明血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 表達可作為膿毒癥并發(fā)肺損傷的預測指標，二者聯(lián)合時預測價值更高。

綜上所述，膿毒癥并發(fā)肺損傷患者血清miR-98-5p表達降低、血清TRAF6 mRNA 表達升高；血清miR-98-5p、TRAF6 mRNA 可作為預測膿毒癥并發(fā)肺損傷的生物標志物。