李淑賢，周美娟，李安娜，房振亞，郭君君，張美華

（山東省婦幼保健院國家衛(wèi)健委生育調(diào)控技術(shù)重點實驗室，濟南山東 250014）

絨毛膜羊膜炎（chorioamnionitis，CAM）是常見的宮內(nèi)感染性疾病，可導(dǎo)致產(chǎn)婦發(fā)生子宮內(nèi)膜炎、子宮腔內(nèi)粘連和盆腔膿腫，引發(fā)死胎、早產(chǎn)、新生兒感染和敗血病等，影響胎兒生長發(fā)育，引起多種新生兒疾?。?-2］，是目前產(chǎn)科和兒科專家共同關(guān)注的焦點，探究其分子機制，尋找有效的治療新靶點，對于臨床診療具有重要意義。

甲酰肽受體2（formyl peptide receptor 2，F(xiàn)PR2）屬于G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員，參與炎癥、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤和糖脂代謝紊亂等相關(guān)疾病的多種生理和病理過程［3-4］。研究表明，F(xiàn)PR2激活可促進炎癥反應(yīng)，增加單核細(xì)胞趨化性和中性粒細(xì)胞招募［5］；Fpr2基因缺陷的小鼠通過減少炎癥反應(yīng)和減輕心肌功能障礙來緩解膿毒癥［6］。另一方面，F(xiàn)PR2 也可與多種抗炎介質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生抗炎作用［7-8］。因此，F(xiàn)PR2是參與多種炎性疾病的細(xì)胞膜受體，是這些疾病的潛在診治靶點。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖、死亡以及細(xì)胞間多種生化反應(yīng)信號的識別、傳遞及放大等處理過程［9］，包含3 個主要通路：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK 信號通路［10］。研究顯示MAPK 信號通路可作為FPR2的下游調(diào)控信號通路，如在早期腦損傷的研究中，F(xiàn)PR2 通過MAPK 信號通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［11］，而且FPR2基因敲除可通過MAPK信號通路減輕由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)［12］。但FPR2 能否通過MAPK 信號通路調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)并參與CAM 的發(fā)生發(fā)展，目前尚不清楚。

本研究通過收集CAM患者胎盤組織，明確FPR2在其中的表達和定位；并利用LPS 建立滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo 體外炎癥模型，同時利用小干擾RNA敲減FPR2基因表達，探究炎癥條件下FPR2 對滋養(yǎng)細(xì)胞炎癥因子釋放及細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，并探究其作用的信號通路，揭示FPR2 對滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控作用和機制，以期為CAM 的治療提供參考資料。

材料和方法

1 胎盤樣本

收集2020 年1 月～2021 年1 月在山東省婦幼保健院診療的10 例CAM 患者和10 例正常產(chǎn)婦胎盤組織。所有患者均簽署知情同意書，臨床樣本采集過程經(jīng)山東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。胎盤剝離后分別于胎兒面及母體面各切取1 cm×1 cm×1 cm 大小的組織，立即置于預(yù)冷的PBS 中。PBS沖洗后置于做好標(biāo)記的凍存管中，液氮速凍后置于-80 ℃保存。另取相同大小組織，預(yù)冷PBS漂洗后置于4%多聚甲醛中固定，用于后續(xù)組織切片的制作。

2 細(xì)胞

人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo 購自ATCC。

3 主要試劑和儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、減血清培養(yǎng)液OPTI-MEM 和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Gibco；細(xì)菌LPS、丙酮酸鈉、青-鏈霉素混合液和FPR2小干擾RNA（siFPR2）購于Sigma；FPR2 抗體（ab63022）購自Abcam；ERK1/2 抗體（11257-1-AP）、p-ERK1/2 抗體（28733-1-AP）、p38抗體（14064-1-AP）和p-p38 抗體（28796-1-AP）購于Proteintech；JNK 抗 體（sc-7345）和p-JNK 抗體（sc-6254）購于Santa Cruz；β-actin 抗體（GB11001）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗IgG（G1213）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；EdU 細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、基質(zhì)膠和0.25%胰酶購自BD；劃痕插件購自ibidi；Transwell小室購自Corning；BCA 蛋白檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

4 主要方法

4.1 細(xì)胞培養(yǎng) HTR-8/SVneo 細(xì)胞在含10% FBS、1%丙酮酸鈉和1%青-鏈霉素混合液（包括1×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素）的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 換液1 次。待細(xì)胞密度達80%～90%時，用0.25%胰酶消化，進行傳代培養(yǎng)做后續(xù)實驗。

4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 方法如前所述［13］。HTR-8/SVneo細(xì)胞以每孔2×105個的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)液換成減血清培養(yǎng)液OPTI-MEM。取100μL OPTI-MEM 于EP 管中，加入4 μL Lipofectamine 2000和1 200 ng siFPR2（6μL），混勻，室溫孵育15 min 后輕柔、均勻加入到每孔中。培養(yǎng)8 h 后，換成完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

4.3 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期HTR-8/SVneo 細(xì)胞，以每孔2×105個的密度接種至6 孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達60%時按以下分組進行處理：（1）正常對照（control，CON）組：HTR-8/SVneo細(xì)胞以完全培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h；（2）LPS 組：培養(yǎng)液中加入100μg/L LPS，培養(yǎng)12 h；（3）LPS+siFPPR2 組：取siFPR2轉(zhuǎn)染后的HTR-8/SVneo 細(xì)胞，待細(xì)胞密度達60%時，加入100μg/L LPS，培養(yǎng)12 h。

4.4 Western blot實驗 提取組織蛋白：取黃豆大小胎盤組織于預(yù)冷的研缽中，加入液氮，研磨至粉末狀，加入500μL 含1%PMSF 的RIPA，置于冰上反應(yīng)30 min，4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液轉(zhuǎn)移至EP管中。提取細(xì)胞蛋白：用預(yù)冷的PBS 輕柔洗滌孔板中的細(xì)胞，加入100μL 含1% PMSF 的RIPA，置于冰上反應(yīng)30 min，4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液轉(zhuǎn)移至EP 管中。提取的組織蛋白和細(xì)胞蛋白用BCA試劑盒檢測蛋白含量。取適量蛋白，加入適量上樣緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性，進行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h；分別加入FPR2、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK 和β-actin 抗體，4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗IgG，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3次后加入增強化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像分析儀采集圖片，ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照β-actin比值作為各蛋白相對含量。實驗重復(fù)3次。

4.5 免疫組織化學(xué)染色 方法如前所述［14］。胎盤組織石蠟包埋切片后，室溫放置30 min，回溫后60 ℃烘烤30 min，放入二甲苯中10 min，之后依次放入100%、95%、90%、80%、70%和50%乙醇中各5 min，最后置于PBS；將切片置于0.01 mol/L 的檸檬酸鹽緩沖液中，加熱至沸騰，保持10 min 進行抗原修復(fù)；待玻片自行冷卻后加入0.3% Triton X-100 作用20 min；PBS 沖洗后標(biāo)本上加入3% H2O2，孵育10 min，隨后加入山羊血清室溫封閉60 min，滴加Ⅰ抗4 ℃封閉過夜。PBS 清洗3 次后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，滴加蘇木素復(fù)染5 min，流水沖洗，鹽酸乙醇分化10 s后繼續(xù)流水沖洗5 min，切片依次置于70%、80%和90%酒精中各3 min，95%乙醇5 min，100%乙醇10 min，二甲苯20 min；最后中性樹膠封片，晾干后顯微鏡下觀察拍照。

4.6 ELISA 各組細(xì)胞按條件處理后，吸取上清于EP管中，用ELISA試劑盒檢測白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-8 和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。按說明書要求配制標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液和樣品各100μL 加入到酶標(biāo)板孔中，加上封板膜，37 ℃反應(yīng)90 min。吸除酶標(biāo)板內(nèi)液體，每孔加入抗體工作液100 μL，37 ℃反應(yīng)60 min。1×洗滌緩沖液洗滌3 次，每次浸泡1 min 左右。將準(zhǔn)備好的ABC 工作液按每孔100 μL 加入酶標(biāo)板中，反應(yīng)30 min。1×洗滌緩沖液洗滌5 次，每次浸泡1～2 分鐘。每孔加入90 mL TMB 顯色液，37 ℃避光反應(yīng)15～20 min。用酶標(biāo)儀在450 nm測定A值。

4.7 EdU 細(xì)胞增殖活性檢測實驗 接種各組細(xì)胞于96 孔板中，每孔5 000 個細(xì)胞。按說明書要求在100 μL 培養(yǎng)液中加入100 μL 2× EdU 工作液，37 ℃孵育2 h；去除培養(yǎng)液，每孔加入200μL 4%多聚甲醛固定液，室溫固定15 min；去除固定液，每孔用200μL PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次3 min；每孔加入200 μL通透液，室溫孵育15 min，去除通透液，每孔用200μL PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次3 min；每孔加入0.5 mL Click 反應(yīng)液，室溫避光孵育20 min，去除反應(yīng)液，PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次3 min；加入Hoechest 進行細(xì)胞核染色，避光孵育15 min 后PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次3 min，將96孔板置于高內(nèi)涵分析儀中拍照，計數(shù)。用ImageJ軟件進行數(shù)據(jù)分析。

4.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 收集不同組的HTR-8/SVneo 細(xì)胞，PBS 輕柔洗滌2 遍，1 500×g離心5 min，棄除上清液，加入100μL上樣緩沖液，吹打懸浮細(xì)胞，按說明書要求加入5 μL annexin V-FITC和5μL PI，混合均勻；室溫避光孵育15 min 后，再加入400μL 上樣緩沖液，置于冰上，1 h 內(nèi)置于流式細(xì)胞儀中檢測。實驗重復(fù)3次。

4.9 劃痕實驗 方法如前所述［15］。將ibidi 劃痕插件置于6孔板中，按每孔6×104個細(xì)胞密度接種HTR-8/SVneo 細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后用鑷子小心揭除插件，用PBS 輕柔沖洗細(xì)胞碎片，孔板內(nèi)注入無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后置于顯微鏡下觀察劃痕，并通過ImageJ軟件進行分析。

4.10 Transwell 實驗 方法如前所述［16］。將50 μL 1 g/L 基質(zhì)膠加至上層小室中，37 ℃放置1 h 后，上層小室中接種200μL無血清培養(yǎng)液懸浮的細(xì)胞1×105，下室加入600μL 含10%血清的完全培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)24 h。用鑷子小心夾取上層小室，吸除小室中培養(yǎng)液，小室在PBS 中輕柔洗滌2 次，用棉簽小心擦拭小室內(nèi)側(cè)底部，將小室放回板內(nèi)，加入1 mL 4%多聚甲醛固定小室下層細(xì)胞20 min，PBS 輕柔洗滌2 次，加入0.1%結(jié)晶紫稀釋液，染色20 min，PBS 輕柔洗滌2 次后，將小室置于正置顯微鏡下，觀察小室底部細(xì)胞并拍照。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗均進行了至少3 次重復(fù)。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖片數(shù)據(jù)的采集和處理用ImageJ軟件進行。

結(jié)果

1 CAM患者胎盤組織中FPR2表達情況

免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)PR2在CAM患者胎盤組織中的表達量明顯高于正常產(chǎn)婦，且主要表達于滋養(yǎng)細(xì)胞層中，見圖1A。Western blot 檢測結(jié)果同樣顯示，CAM 患者胎盤組織中FPR2 表達量顯著增加（P＜0.01），見圖1B。利用LPS（100 μg/L）處理HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞構(gòu)建體外細(xì)胞炎癥模型，結(jié)果顯示自LPS 處理4 h 開始FPR2 表達量隨時間不斷增加，處理12 h 時，F(xiàn)PR2 表達量顯著增加（P＜0.01），見圖1C。因此后續(xù)實驗選取12 h 作為LPS 刺激HTR-8/SVneo細(xì)胞的作用時間。

2 敲減FPR2 可減少LPS 誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo 細(xì)胞促炎因子的分泌

利用小干擾RNA 敲減HTR-8/SVneo 細(xì)胞中FPR2基因，Western blot 實驗結(jié)果顯示FPR2 蛋白表達顯著減少（P＜0.01），見圖2A。LPS 刺激HTR-8/SVneo 滋養(yǎng)細(xì)胞12 h 后，ELISA 檢測結(jié)果顯示培養(yǎng)液上清中促炎因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表達水平顯著升高（P＜0.01）；將LPS 作用于FPR2敲減的HTR-8/SVneo 滋養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果顯示促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表達水平均較LPS 組顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01），見圖2B。

3 敲減FPR2 可減輕LPS 誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo 細(xì)胞功能損傷

利用EdU 實驗檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示與正常組相比，LPS處理組中HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖活性顯著降低，細(xì)胞增值率由之前的80%左右降至50%左右（P＜0.01），但FPR2敲減后，細(xì)胞增殖率增加至70%左右（P＜0.05，圖3A、3B）。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率約為8%，LPS 處理后，HTR-8/SVneo 細(xì)胞凋亡率增至25%左右（P＜0.01），當(dāng)FPR2敲減后凋亡率減少到12%左右（P＜0.01，圖3C、3D）。Transwell 實驗結(jié)果顯示，LPS處理組穿透至小室底部的細(xì)胞數(shù)目顯著降低，表明LPS 可顯著抑制HTR-8/SVneo 細(xì)胞侵襲能力（P＜0.01），但FPR2敲減后，侵襲至小室底面細(xì)胞數(shù)目顯著增加（P＜0.01，圖3E、3F）。劃痕實驗結(jié)果顯示，LPS 處理24 h 后HTR-8/SVneo 細(xì)胞遷移能力較正常對照組顯著減弱，遷移面積約為正常組的20%（P＜0.01）；FPR2敲減后，遷移面積顯著增加（P＜0.01，圖3G、3H）。

4 FPR2 通過ERK1/2 信號通路調(diào)控炎癥狀態(tài)下滋養(yǎng)細(xì)胞功能

提取CON 組、LPS 組T LPS+siFPR2 組細(xì)胞的總蛋白，利用Western blot檢測細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 和p-p38 的蛋白表達水平（圖4A、4B），結(jié)果顯示ERK、JNK 和p38 表達無顯著差異，但LPS 組p-ERK1/2、p-JNK 和p-p38 蛋白表達均顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)PR2基因敲減后，p-JNK 和pp38蛋白表達與LPS處理組無顯著差異，但p-ERK 蛋白表達下降顯著（P＜0.01，圖4A、4B）。

討 論

CAM是由于胎盤組織受到病原菌入侵后引起的感染性炎癥，是早產(chǎn)的常見原因，可能導(dǎo)致多種不良妊娠結(jié)局，如胎兒生長受限、早產(chǎn)、新生兒感染和敗血癥等，因此臨床上常用抗炎藥物進行治療［17-18］。滋養(yǎng)細(xì)胞是構(gòu)成母胎界面的關(guān)鍵細(xì)胞，其重要作用貫穿妊娠過程的始終。越來越多的證據(jù)顯示，妊娠過程中的炎癥感染會造成滋養(yǎng)細(xì)胞功能損傷、侵襲缺陷、子宮螺旋動脈重塑障礙，進而引發(fā)胎盤血管網(wǎng)絡(luò)生長構(gòu)建不良，胎盤缺血、缺氧、過度氧化應(yīng)激及代謝功能紊亂等病理改變，最終導(dǎo)致多種不良妊娠結(jié)局的發(fā)生［19-20］。這些研究提示CAM 可能與炎癥狀態(tài)下滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能受損有關(guān)，但具體作用機制尚不明確。

Figure 1.The expression of FPR2 increased in the placenta of chorioamnionitis（CAM）patients.A：the expression and location of FPR2 in the placenta tissues derived from CT（n=10）and CAM（n=10）patients were analyzed by IHC（scale bar=50μm）；B：the expression of FPR2 in the placenta tissues derived from CT and CAM patients was analyzed by Western blot（n=3）；C：Western blot was used to detect the protein levels of FPR2 in HTR-8/SVneo cells treated with 100μg/L LPS for different time（0，2，4，8，12，24 and 48 h）.Mean±SD.△△P＜0.01 vs CT group；**P＜0.01 vs 0 h group.圖1 FPR2在CAM患者胎盤組織中高表達

FPR2 屬于甲酰肽受體家族成員，是一種G 蛋白偶聯(lián)受體（人的為FPR2，小鼠為Fpr2）。FPR2 被證實參與多種炎癥引發(fā)的疾病的發(fā)生和發(fā)展，如心肌炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺炎、結(jié)腸炎等［21-23］，F(xiàn)PR2通過結(jié)合配體參與人體的炎癥反應(yīng)，而且根據(jù)結(jié)合配體的不同，表現(xiàn)出促炎或抑炎兩種截然相反的功能。當(dāng)FPR2 與脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）、消退素D1（resolvin D1，RvD1）、糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白A 等抗炎介質(zhì)結(jié)合時，可抑制炎癥反應(yīng)［24-25］；另一方面，F(xiàn)PR2又可以通過增加單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化和募集，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1 極化，加速炎癥反應(yīng)［26］。在肺組織的炎癥模型中，F(xiàn)PR2基因敲除顯著降低了LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，降低促炎因子的表達［12］。研究顯示，人類胎盤組織中表達FPR2，且在子癇前期、胎兒生長受限、妊娠期糖尿病患者胎盤中表達出現(xiàn)異常［27，28］，在妊娠期糖尿病中，F(xiàn)PR2 表達顯著升高，且FPR2敲減后會逆轉(zhuǎn)高糖對滋養(yǎng)細(xì)胞功能損傷［29］。在胎兒生長受限母體胎盤中FPR2表達顯著升高，且FPR2 可影響滋養(yǎng)細(xì)胞分化和內(nèi)皮細(xì)胞功能導(dǎo)致胎盤功能不全［30］。這些研究結(jié)果表明FPR2 對于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能至關(guān)重要，但是在胎盤炎癥相關(guān)疾病中，F(xiàn)PR2研究較少，尤其在CAM中更是鮮有研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RvD1 可以與FPR2 結(jié)合減輕LPS 導(dǎo)致的滋養(yǎng)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，但FPR2 對于滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚待進一步的研究和討論。

Figure 2.Knockdown of FPR2 reduced the release of pro-inflammatory cytokines in HTR-8/SVneo cells treated with LPS.A：the Western blot results showed the expression of FPR2 was down-regulated in HTR-8/SVneo cells transfected with si-FPR2（600 μg/L）；B：the concentrations of IL-6，IL-1β and TNF-α in the supernatant of HTR-8/SVneo cells treated with 100μg/L LPS and 600 μg/L siFPR2 were detected by ELISA.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；△△P＜0.01 vs CON group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.圖2 敲減FPR2可減少LPS誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo細(xì)胞炎癥因子的分泌

本研究表明FPR2 在CAM 胎盤組織中的表達顯著增加，提示FPR2 可能參與了CAM 的疾病進程。細(xì)菌脂多糖是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外壁的主要組成成分，通過與宿主細(xì)胞上的特異性受體（Toll like receptor，TLR）結(jié)合，引發(fā)TNF-α，IL-1β 和IL-6 等炎癥因子釋放［31］。革蘭氏陰性細(xì)菌是宮內(nèi)感染的主要病原菌，近些年來關(guān)于LPS 引發(fā)滋養(yǎng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)與早產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、子癇前期以及胎兒宮內(nèi)生長受限等多種不良妊娠相關(guān)的研究備受關(guān)注［32-33］。因此本研究選擇利用LPS 構(gòu)建體外滋養(yǎng)細(xì)胞炎癥細(xì)胞模型。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS 顯著提高了HTR-8/SVneo 滋養(yǎng)細(xì)胞系中FPR2 的表達，這與CAM 患者胎盤組織中FPR2 表達升高的結(jié)果相一致；另一方面，F(xiàn)PR2敲減后顯著降低了LPS 誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo 滋養(yǎng)細(xì)胞中促炎因子TNF-α，IL-1β 和IL-6 的分泌，同時FPR2基因敲減改善了LPS 對HTR-8/SVneo 的增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響。這些研究結(jié)果提示，F(xiàn)PR2參與炎癥條件下滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，起到促炎作用。本課題組之前發(fā)現(xiàn)FPR2 可以與RVD1結(jié)合減輕胎盤炎癥反應(yīng)的研究結(jié)果，由此推測在CAM 發(fā)展過程中，胎盤炎癥受多種因素調(diào)節(jié)，在CAM 早期階段，胎盤受多種外來病原菌感染，誘發(fā)FPR2 產(chǎn)生促炎作用，但隨著疾病發(fā)展，多種抗炎物質(zhì)如RVD1 和LXA4 等分泌增加，F(xiàn)PR2 與之結(jié)合產(chǎn)生抑炎作用，協(xié)助機體消除炎癥反應(yīng)。當(dāng)然，這些假設(shè)需要更多的研究進行證實。

本研究同時探究了炎癥狀態(tài)下FPR2 調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能的相關(guān)信號通路。研究表明，LPS可與細(xì)胞膜上的Toll 樣受體相互作用，觸發(fā)多種信號通路。在多種滋養(yǎng)細(xì)胞系如HTR-8/SVneo 和JEG3 等中LPS激活細(xì)胞膜上Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR-4），進一步激活下游信號通路如MAPK、NF-κB和STAT 等，促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生和擴大。其中MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長、分化、炎癥和應(yīng)激等多種重要生理效應(yīng)的經(jīng)典信號通路［34-35］，主要包括三個分支：ERK、JNK、p38/MAPK。Western blot 結(jié)果顯示加入LPS 后，HTR-8/SVneo 中p-ERK1/2、p-p38 和p-JNK 表達均有顯著增加，但加入siFPR2 后p-ERK1/2 表達顯著降低，p-p38和p-JNK 表達沒有顯著變化。由此推測FPR2 可能通過MAPK/ERK 信號通路調(diào)控LPS 對滋養(yǎng)細(xì)胞的作用。有研究報道在蛛網(wǎng)膜下出血研究中FPR2 可與外源性LXA4 結(jié)合抑制p38 信號通路表達以此緩解炎癥反應(yīng)［36］。但在本研究中，F(xiàn)PR2基因敲除并不改變p38 信號通路表達，這可能是因為不存在配體LXA4的原因。以后的研究將進一步探究FPR2配體與FPR2 間的相互作用在CAM 中的作用及作用機制。明確FPR2 調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的信號通路，將為CAM的治療提供新的靶點。

目前本研究還存在一定的局限性，如缺乏CAM的動物模型，無法通過體內(nèi)實驗探究FPR2的作用機制，另外缺少在原代滋養(yǎng)細(xì)胞中進行FPR2功能分析的數(shù)據(jù)。這些內(nèi)容將在以后的研究中對這些方面進行進一步的探究。

Figure 3.The effects of LPS on proliferation，apoptosis，invasion and migration of HTR-8/SVneo cells were attenuated after FPR2 was knocked down.A：EdU assay showed that the proliferation of HTR-8/SVneo cells transfected with si-FPR2 was increased（the nuclei were stained with Hoechest in blue and the cells in the proliferation stage were stained with EdU in red）；B：annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry were used to determine the percentage of apoptotic cells treated with LPS and LPS+siFPR2；C：representative images of the transwell invasion assay at 12 h in different groups and statistical analysis；D：representative images of wound healing assay of HTR-8/SVneo cells under different conditions at 0 h and 24 h（scale bar=200μm）and statistical analysis. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs CON group；△△P＜0.01 vs LPS group.圖3 敲減FPR2減弱LPS對HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響

Figure 4.The expression of ERK1/2，JNK and p38 signaling pathway-related proteins detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group；##P＜0.01 vs LPS group.圖4 ERK1/2、JNK和p38信號通路相關(guān)蛋白表達情況

綜上所述，F(xiàn)PR2 通過MAPK/ERK 信號通路影響滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能，在CAM 中發(fā)揮重要作用，抑制FPR2的表達可以減輕滋養(yǎng)細(xì)胞的炎癥損傷，這可為臨床CAM的診治提供參考資料。