辛紫媛，靳曉飛，周曉紅，劉真一，高 萍，馬 嫻，高維娟，△

（1承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北承德 067000；2河北中醫(yī)學(xué)院河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室，河北石家莊 050091）

腦卒中是急性腦血液循環(huán)紊亂的一類腦血管疾病，可導(dǎo)致全球范圍內(nèi)患者的高致殘率和高死亡率，造成巨大的健康和經(jīng)濟負擔(dān)，其中最常見的是缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke，CIS）［1］。目前CIS的主要治療方法有早期靜脈注射組織型纖溶酶原激活劑（tissue plasminogen aetivator，tPA）、血管內(nèi)取栓、改善側(cè)支循環(huán)等［2］。然而，在長時間的缺血條件下，血液發(fā)生再灌注可能會導(dǎo)致更大的腦梗死體積，反過來加重初始損傷產(chǎn)生繼發(fā)性腦神經(jīng)損傷，稱為腦缺血/再灌注損傷（cerebral ischemia/reperfusion injury，CIRI）［3］。在CIRI 過程中可觸發(fā)的一系列炎癥級聯(lián)反應(yīng)會形成惡性循環(huán)，誘導(dǎo)神經(jīng)細胞死亡，這些反應(yīng)通過特定的炎癥信號通路發(fā)出信號，導(dǎo)致缺血性腦組織產(chǎn)生炎癥性病變，在CIRI 作用機制中起著至關(guān)重要的作用［4-5］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulation 1，SIRT1）是哺乳動物Ⅲ類組蛋白脫乙?；竤irtuin 家族的一個重要成員，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的脫乙?；富钚裕贑IRI 中可調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞存活、軸突伸長、突觸可塑性決定細胞的命運，介導(dǎo)相關(guān)的信號通路參與保護神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中的神經(jīng)細胞免受損傷，其中包括抑制其下游的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）核轉(zhuǎn)位進而減輕炎癥反應(yīng)［6-7］。補陽還五湯（Buyang-Huanwu decoction，BYHWD）在清朝王清任所著的《醫(yī)林改錯·下卷·癱痿論》一書中被首次提出，對癥治療氣虛血瘀所致中風(fēng)沿用至今，具有顯著的療效，但其確切的藥理機制尚不清楚［8］。有研究表明BYHWD 含藥血清能夠有效延緩?fù)砥谒ダ弦鸬难芷交〖毎╲ascular smooth muscle cells，VSMCs）的異常遷移和侵襲，并伴隨著基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）表達的減少，發(fā)現(xiàn)SIRT1 可能是影響其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［9］。同時，多項研究表明BYHWD 在抑制炎性細胞因子的產(chǎn)生和免疫紊亂調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用，減輕炎癥反應(yīng)緩解疾病進展［10］。本研究建立SD 大鼠大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型并給予BYHWD 干預(yù)，觀察BYHWD 是否可以通過調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB p65 炎癥信號通路發(fā)揮對CIRI 大鼠的神經(jīng)保護作用，進一步探索BYHWD調(diào)節(jié)CIRI的可能作用機制。

材料和方法

1 動物

75只SPF級健康雄性SD 大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量250～280 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號為SCXK（京）2016-0011，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后開始實驗，所有實驗動物給予人道關(guān)懷，實驗嚴格遵循河北中醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理審查標準，審核編號：DWLL2019025。

2 主要藥物、試劑和儀器

TTC 染液、HE 染液和免疫組化試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司）；SIRT1 抑制劑EX527（Selleck Chemicals）；兔抗SIRT1 抗體、兔抗NF-κB p65 抗體（Cell Signaling Technology）；兔抗NF-κB p65 acetyl K310 抗體（Abcam）；鼠抗IL-6 抗體、鼠抗TNFα 抗體（Santa Cruz）；辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；蛋白酶抑制劑（Sigma）；QuickBlock?免疫染色封閉液、含DAPI抗熒光淬滅封片液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；FITC-羊抗兔IgG 熒光標記抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；PVDF膜（Millipore）；

MCAO 栓線（北京西濃科技有限公司）；組織包埋機、輪轉(zhuǎn)切片機、冰凍切片機及顯微拍照系統(tǒng)（Leica）；電泳系統(tǒng)及半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)（Bio-Rad）；高速低溫組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）；冷凍高速離心機、多功能酶標儀（Thermo）；多功能成像系統(tǒng)（Vilber）。

3 主要方法

3.1 實驗動物的分組與給藥 健康雄性SD 大鼠75只隨機分為5 組：假手術(shù)（sham）組、模型組（MCAO/R組）、BYHWD組、SIRT1抑制劑組（EX527組）和BYHWDZ+EX527組，每組15只大鼠。除sham 組外，其余各組大鼠均參照文獻［11］建立MCAO 模型模擬CIRI，手術(shù)缺血2 h 后再灌注3 d。BYHWD 組和BYHWD+EX527組大鼠給予BYHWD，劑量參照實驗室前期研究［12］為14.3 g/kg。EX527 是一種SIRT1 特異性抑制劑，可有效抑制SIRT1 去乙?；富钚裕珽X527 粉末需要溶解在1%二甲基亞砜，20%聚乙二醇和79%雙蒸水混合而成的溶劑中。EX527 組和BYHWD+EX527 組大鼠造模前開始腹腔注射給予EX527 溶液，劑量參照文獻［13］為5 mg/kg。BYHWD 于造模后2 h 開始至取材前，每1 d 灌胃給藥1 次；EX527 于造模前3 d開始至取材前2 h，每2 d腹腔注射給藥1次。同樣，設(shè)置EX527未經(jīng)干預(yù)的sham 組、MCAO/R 組和BYHWD 組腹腔注射相同體積的二甲基亞砜和聚乙二醇溶劑作為對照。

3.2 Zea Longa 評分標準評價神經(jīng)功能缺損狀況大鼠清醒后根據(jù)Zea Longa 評分，將得到1、2、3 分的大鼠隨機分配入組，其余剔除；MCAO 缺血2 h 再灌注3 d，觀察神經(jīng)功能缺損狀況并記錄各組大鼠評分。評分標準為：無神經(jīng)功能缺損記為0 分；懸尾時對側(cè)前爪不能伸展記為1 分；行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記為2 分；行走時向?qū)?cè)傾倒記為3 分；無自主活動或意識喪失記為4分。

3.3 TTC 染色檢測腦梗死體積百分比 所有大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，立即取出腦組織冰凍后切成6 個2 mm 厚的冠狀切片，浸泡在TTC 溶液中于37 ℃恒溫箱避光染色30 min，然后在4%中性甲醛固定液中固定，隔天將組織切片按順序放置，使用相機拍攝圖像后應(yīng)用Image J 軟件計算缺血側(cè)局部腦梗死體積占總體積百分比。

3.4 HE 染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化 大鼠麻醉后取出完整腦組織，4%中性甲醛固定液充分固定24 h 以上，梯度乙醇脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋后制備厚度約5μm 的石蠟切片。染色時切片脫蠟復(fù)水，蘇木素染色后流水沖洗，蘇木素分化液分化后流水沖洗，蘇木素返藍液返藍后流水沖洗，伊紅染液染色后流水沖洗，經(jīng)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下采集圖像，觀察各組大鼠腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域病理學(xué)改變。

3.5 Western blot 檢測SIRT1、乙酰化NF-κB p65（Ac NF-κB p65）、NF-κB p65 及IL-6 蛋白表達水平 冰上快速取出新鮮腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域，用液氮處理之后冷凍貯存?zhèn)溆?。檢測時組織在冰冷裂解緩沖液（裂解液由RIPA、PMSF、Cocktail混合而成）中快速剪碎，并用低溫研磨儀勻漿，離心后進行BCA法蛋白定量，其余上清液在loading buffer 中100 ℃煮沸變性。蛋白經(jīng)過SDS-PAGE 分離，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上；5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，TBST 洗膜后在Ⅰ抗［SIRT1 抗體（1∶1 000）、Ac NF-κB p65 抗體（1∶1 000）、NF-κB p65 抗體（1∶1 000）、IL-6 抗體（1∶200）及內(nèi)參照β-actin抗體（1∶2 000）］溶液中4 ℃孵育過夜，洗膜后與相應(yīng)種屬的Ⅱ抗［辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的IgG 抗體］室溫孵育2 h，洗膜后ECL 顯色劑避光孵育后曝光成像，使用VisionCapt凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。實驗以β-actin 為內(nèi)參照蛋白，通過觀察目的蛋白與β-actin比值，乙?；鞍着c總蛋白比值分析蛋白的相對表達水平。

3.6 免疫熒光染色檢測NF-κB p65入核表達水平新鮮腦組織固定至少24 h，蔗糖溶液中梯度脫水，OCT 包埋劑包埋后制備厚度8 μm 的冰凍切片低溫保存。染色時切片恢復(fù)室溫后封閉液封閉，滴加Ⅰ抗NF-κB p65（1∶1 000）抗體于4 ℃冰箱中孵育過夜，洗片后滴加Ⅱ抗（FITC-羊抗兔IgG 熒光抗體，1∶100）室溫避光孵育1 h，洗片后使用含DAPI 抗熒光淬滅劑封片避光保存，熒光顯微鏡下分別采集大鼠腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域DAPI 圖像和NF-κB p65 圖像，將兩種熒光圖像融合分析細胞核內(nèi)NF-κB p65熒光強度。

實習(xí)后期的主要壓力源來自就業(yè)。實習(xí)后期，實習(xí)護生在應(yīng)對日益繁重的實習(xí)任務(wù)之余，還需為未來做準備。當前就業(yè)的供需矛盾及部分護生過高的就業(yè)期望，使許多實習(xí)護生精疲力竭(“才發(fā)現(xiàn)護理專業(yè)也不是我們想象中那樣好就業(yè)”[2]，“競爭那么激烈，找個編內(nèi)工作實在太難了”[6])。

3.7 免疫組化染色檢測TNF-α 表達水平 石蠟切片經(jīng)脫蠟復(fù)水后，浸泡在檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液中微波爐加熱進行抗原修復(fù)，室溫冷卻后PBS 洗片；雙氧水溶液避光孵育30 min 消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗片；3%BSA 室溫封閉30 min；Ⅰ抗TNF-α抗體（1∶50）濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，防止干片；次日PBS 洗片，Ⅱ抗（HRP-山羊抗小鼠抗體）室溫孵育1 h，PBS洗片；滴加DAB 顯色液并在顯微鏡下觀察到陽性表達為棕黃色時，自來水洗片；蘇木素復(fù)染細胞核，自來水洗片，蘇木素分化液分化數(shù)秒，自來水洗片，蘇木素返藍液返藍，自來水洗片；切片染色完成后脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察大鼠腦組織皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)域并采集圖像。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析并計算平均光密度（average optical density）以評價蛋白表達水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 8.0.1 軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進行分析并繪制柱狀圖。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（mean±SD）的形式表示。各組間比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Zea Longa評分觀察不同處理組大鼠神經(jīng)功能缺損狀況

sham 組神經(jīng)功能正常，其它各組大鼠均有不同程度的神經(jīng)功能缺損；與sham 組相比，MCAO/R 組出現(xiàn)顯著神經(jīng)功能缺損狀況，神經(jīng)功能學(xué)評分升高（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組神經(jīng)功能缺損狀況有所恢復(fù)，神經(jīng)功能學(xué)評分降低（P＜0.05），EX527 組神經(jīng)功能缺損程度加重，神經(jīng)功能學(xué)評分升高（P＜0.05）；與BYHWD 組相比，BYHWD+EX527出現(xiàn)更嚴重的神經(jīng)功能缺損狀況，神經(jīng)功能學(xué)評分升高（P＜0.05），見圖1。

2 TTC染色觀察不同處理組大鼠腦梗死體積改變

TTC 染色結(jié)果顯示，sham 組腦組織呈均勻紅色，無缺血梗死灶出現(xiàn)，其它各組大鼠均有不同程度的缺血梗死灶；與sham 組相比，MCAO/R 組缺血側(cè)腦組織出現(xiàn)明顯的白色缺血梗死灶，腦梗死體積百分比增加（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組白色缺血梗死灶有所減小，腦梗死體積百分比降低（P＜0.05），EX527 組白色缺血梗死灶增大，腦梗死體積百分比增加（P＜0.05）；與BYHWD 組相比，BYHWD+EX527 組出現(xiàn)更大面積的白色缺血梗死灶，腦梗死體積百分比增加（P＜0.05），見圖2。

Figure 1.Zea Longa score was used to observe the neurological deficits of the rats in different groups.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖1 Zea Longa評分觀察各組大鼠神經(jīng)功能缺損狀況

3 HE染色觀察不同處理組大鼠腦組織病理學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示，sham 組腦組織皮質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)正常，神經(jīng)細胞排列整齊、細胞完整、數(shù)量豐富，細胞核清晰可見；與sham 組相比，MCAO/R 組腦組織缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)部分呈疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，神經(jīng)細胞排列紊亂、完整性被破壞甚至萎縮、數(shù)量減少，核固縮、碎裂；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組腦組織病理損傷減輕，神經(jīng)細胞萎縮形態(tài)有所改善、數(shù)量增多；EX527 組腦組織病理損傷更為嚴重，呈疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、空泡狀，神經(jīng)細胞丟失、破裂甚至壞死，核溶解；與BYHWD組相比，BYHWD+EX527組腦組織病理損傷加重，神經(jīng)細胞破壞程度有所增加，見圖3。

4 Western blot 觀察不同處理組大鼠SIRT1、Ac NF-κB p65、NF-κB p65和IL-6蛋白表達水平

與sham 組相比，MCAO/R 組SIRT1 表達顯著降低，Ac NF-κB p65/NF-κB p65比值和IL-6表達顯著升高（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組SIRT1表達顯著升高，Ac NF-κB p65/NF-κB p65 比值和IL-6表達顯著降低（P＜0.05），EX527 組SIRT1 表達降低，Ac NF-κB p65/NF-κB p65 比值和IL-6 表達升高（P＜0.05）；與BYHWD 組相比，BYHWD+EX527 組SIRT1表達降低，Ac NF-κB p65/NF-κB p65比值和IL-6表達升高（P＜0.05），見圖4。

5 免疫熒光染色觀察不同處理組大鼠NF-κB p65入核表達水平

Figure 2.TTC staining was used to observe the cerebral infarction volume changes of the rats in different groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖2 TTC染色觀察不同處理組大鼠腦梗死體積改變

Figure 3.HE staining was used to observe the brain histopathological changes of the rats in different groups.圖3 HE染色觀察不同處理組大鼠腦組織病理學(xué)變化

免疫熒光結(jié)果顯示細胞核陽性表達為藍色熒光標記，NF-κB p65 陽性表達為綠色熒光標記，NF-κB p65在細胞漿中表達處于無活性的靜止狀態(tài)，在細胞核中表達處于被激活的活性狀態(tài)。sham組腦組織皮質(zhì)區(qū)NF-κB p65 主要表達于細胞漿中；與sham 組相比，MCAO/R 組缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)NF-κB p65 主要表達于細胞核中，核內(nèi)NF-κB p65 表達水平增加（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組細胞漿和細胞核中NF-κB p65 均有表達，核內(nèi)NF-κB p65 表達水平減少（P＜0.05），EX527 組核內(nèi)NF-κB p65 表達增多（P＜0.05）；與BYHWD 組相比，BYHWD+EX527 組核內(nèi)NF-κB p65表達增多（P＜0.05），見圖5。

6 免疫組化染色觀察不同處理組大鼠TNF-α 蛋白表達水平

免疫組化結(jié)果顯示TNF-α 陽性表達主要集中在細胞漿中，呈棕黃色細顆粒狀。sham 組腦組織皮質(zhì)區(qū)僅有少量TNF-α 表達；與sham 組相比，MCAO/R 組TNF-α 表達量顯著升高（P＜0.05）；與MCAO/R 組相比，BYHWD 組TNF-α 表達量有所降低（P＜0.05），EX527 組TNF-α 表達量增加（P＜0.05）；與BYHWD組相比，BYHWD+EX527 組TNF-α 表達量增加（P＜0.05），見圖6。

討 論

CIRI導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷的機制是級聯(lián)和多因素的，與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細胞凋亡等多個環(huán)節(jié)密切相關(guān)，涉及到多種病理生理機制形成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)，威脅人類機體的健康產(chǎn)生嚴重損害作用，靶向這些機制顯示有益的神經(jīng)保護作用，探索減輕CIRI的發(fā)病機制、治療方法和治療藥物是CIS治療中的亟待解決的關(guān)鍵難點［14-15］。

炎癥反應(yīng)是CIRI 重要的發(fā)病機制，也是缺血腦組織繼發(fā)性損傷的重要原因，貫穿了CIRI 的整個病理生理過程［16］。CIRI 會快速引起炎癥反應(yīng)，后者是免疫系統(tǒng)去除有害的感染性或非感染性刺激并啟動愈合過程的生理性防御反應(yīng)，過度的炎癥反應(yīng)不僅影響局部血液供應(yīng)，還對神經(jīng)細胞產(chǎn)生直接損傷，造成血腦屏障破壞，神經(jīng)細胞進一步損傷［17-18］。早期死亡和受損神經(jīng)細胞釋放損傷相關(guān)分子模式（damageassociated molecular patterns，DAMPs）誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細胞激活，包括小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞的活化和外周白細胞（淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞）的滲出，這些炎癥細胞會釋放大量的炎癥介質(zhì)，如TNF-α 和IL-6 等促炎因子的產(chǎn)生，其過表達是炎癥反應(yīng)在CIRI 損傷的一個典型病理特征，主要炎癥信號通路如NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）等信號通路通過調(diào)節(jié)這些炎癥介質(zhì)減輕CIRI［19-22］。因此，如何通過干預(yù)炎癥反應(yīng)，以影響CIS 患者的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，是值得關(guān)注的研究方向。

Figure 4.Western blot was used to detect the protein levels of SIRT1，Ac NF-κB p65，NF-κB p65 and IL-6 of the rats in different groups.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖4 Western blot檢測不同處理組大鼠SIRT1、Ac NF-κB p65、NF-κB p65、IL-6的蛋白表達水平

隨著近年來的研究表明，SIRT1在體內(nèi)和體外都能保護機體改善CIRI，激活SIRT1 可以被認為是一種神經(jīng)保護策略，有望成為越來越多心腦血管疾病有前途的治療靶點［23］。Yeung 等［24］首次證明SIRT1作為去乙?；福粌H可以去乙?；M蛋白底物，還可以調(diào)節(jié)下游非組蛋白底物NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性進而調(diào)控細胞的生存。NF-κB 通常以p50/p65 異源二聚體形式存在，是啟動炎癥反應(yīng)的核心和關(guān)鍵調(diào)控因子，生理狀態(tài)下NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合主要以非活性形式存在于細胞質(zhì)中，在受到刺激后IκB 蛋白被磷酸化、泛素化及蛋白酶體降解，退化的IκB 與NF-κB 解離，使NF-κB p65 轉(zhuǎn)移進入到細胞核被激活，促進炎性因子的產(chǎn)生，有效調(diào)控NF-κB 信號通路抑制其核轉(zhuǎn)位是調(diào)控局灶CIRI早期炎性損傷至關(guān)重要的環(huán)節(jié)［25］。然而，NF-κB p65亞基需要經(jīng)過多種翻譯后修飾才能調(diào)控轉(zhuǎn)錄的激活［26］。在CIRI 發(fā)生后，調(diào)控SIRT1 靶點在缺血后炎癥反應(yīng)中起重要作用，SIRT1 可以通過抑制Ac NF-κB p65 310 賴氨酸殘基乙酰化水平，減少NF-κB p65從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)，使NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性下降，阻止發(fā)揮促炎的活性作用，減少炎癥因子TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生，以減輕炎癥反應(yīng)發(fā)揮保護作用［27-28］。

Figure 5.Immunofluorescence staining was used to observe the nuclear expression of NF-κB p65 of the rats in different groups.Blue represents DAPI positive signal；green represents NF-κB p65 positive signal.The scale bar=50 μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖5 免疫熒光染色觀察不同處理組大鼠NF-κB p65入核表達情況

Figure 6.Immunohistochemical staining was used to observe the protein expression levels of TNF-α of the rats in different groups.The scale bar=50μm.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs MCAO/R group；△P＜0.05 vs BYHWD group.圖6 免疫組化染色觀察不同處理組大鼠TNF-α蛋白表達水平

在中醫(yī)學(xué)上將腦卒中稱之為中風(fēng)，傳統(tǒng)中藥BYHWD 是臨床上廣泛應(yīng)用、切合中風(fēng)病機的一個中醫(yī)經(jīng)典名方。方中重用大劑量的黃芪益氣固表為君藥，當歸活血化瘀佐君配合加入為臣藥，其它單味藥赤芍、紅花、地龍、桃仁、川芎活血祛瘀通經(jīng)活絡(luò)均為佐藥。用藥主次分明，以補氣為主兼以活血化瘀通絡(luò)之功效，對癥治療氣虛血瘀所致中風(fēng)［29］。雖然BYHWD 在治療腦卒中進程發(fā)展中被證明可降低炎癥反應(yīng)，但具體機制仍未明確［30］。

本研究表明，建立CIRI 在體MCAO 模型并于再灌注損傷早期給予BYHWD治療，可減輕MCAO/R大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，降低腦梗死體積，減輕腦組織病理損傷。進一步的研究表明，其藥理作用的具體機制可能通過激活SIRT1 降低Ac NF-κB p65 表達，抑制NF-κB p65 活性，減輕TNF-α 和IL-6 等促炎因子的表達，通過EX527 干預(yù)后，BYHWD 引起的這些作用被減弱。這提示BYHWD 可能通過調(diào)控SIRT1/NF-κB p65 炎癥信號通路的潛在機制發(fā)揮其減輕CIRI 的藥理作用，了解這種修飾方式可以更加精確調(diào)節(jié)NF-κB 的轉(zhuǎn)錄激活，以此作為靶點的抗炎治療為BYHWD 治療腦血管疾病提供更精準的理論基礎(chǔ)。