張松江，李龍洋，高劍峰

（河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其早期的主要病理變化是皮層和海馬部位神經(jīng)元外的β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉淀（Aβ 老年斑）和神經(jīng)元內(nèi)高度磷酸化的tau蛋白形成的纖維纏結(jié)［1-2］。研究顯示，AD 的病理機(jī)制與Aβ 導(dǎo)致的神經(jīng)元突觸可塑性下降有密切關(guān)系［3-5］。電針（electroacupuncture，EA）刺激AD 模型動(dòng)物相關(guān)穴位可以有效改善皮層和海馬的突觸數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能［6-8］。目前EA治療對(duì)突觸可塑性的研究所用的動(dòng)物模型基本是成年鼠，缺乏對(duì)幼年AD 模型鼠預(yù)防性電針刺治療的突觸可塑性機(jī)制探索。因此，本研究以6周齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為AD 模型，EA 刺激“百會(huì)”“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”，探索EA 刺激穴位對(duì)AD 模型幼鼠突觸可塑性的影響及其機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

SPF級(jí)6周齡雄性APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠24只，體質(zhì)量20～22 g，自由攝食和飲水，12 h/12 h 明暗交替，環(huán)境溫度為（24±1）℃，相對(duì)濕度55%～65%。將AD模型幼鼠隨機(jī)分為EA 組（12 只）和AD 模型組（AD組，12 只），另以同月齡的正常C57BL/6J 小鼠作為正常對(duì)照組（CO 組，12只）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2015-0005。本研究經(jīng)過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查（倫理編號(hào)：DWLL2018030019）。

2 主要儀器和試劑

華佗牌電針儀（型號(hào)SDZ-Ⅲ）和華佗牌針刺針（0.25 mm×13 mm）購(gòu)自蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；StepOnePlus?熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems）；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和蛋白顯影儀（Bio-Rad）；冰凍切片機(jī)（Leica）；快速Golgi 染色試劑盒（PK401，F(xiàn)D Neuro-Technologies）；RNA 提取液和引物（武漢賽維爾生物科技有限公司）；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、N-甲基-D-天冬氨酸受體2B 亞 基（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B，NR2B）及突觸小泡蛋白（synaptophysin，SYN）單克隆抗體（Immunoway）；其它基礎(chǔ)試劑均為國(guó)產(chǎn)。

3 電針干預(yù)

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，開(kāi)始對(duì)EA 組小鼠進(jìn)行EA干預(yù)治療。方法同文獻(xiàn)［6］：參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［9］對(duì)小鼠進(jìn)行穴位定位，于頂骨正中（“百會(huì)”）向后斜刺2 mm，枕骨頂嵴后枕寰關(guān)節(jié)背凹陷中（“風(fēng)府”）向后下方斜刺2 mm，第2 腰椎后兩旁凹陷中（雙側(cè)“腎俞”）直刺2 mm?！鞍贂?huì)”和左側(cè)“腎俞”為一對(duì)正負(fù)極，“風(fēng)府”和右側(cè)“腎俞”為一對(duì)正負(fù)電極。斷續(xù)波刺激頻率為10 Hz，刺激強(qiáng)度為2 mA。AD組和CO組在同樣的時(shí)間僅給予同樣的抓取和固定。EA 刺激每天1次，每次20 min，每周休息1 d，療程為16周。

4 檢測(cè)指標(biāo)及方法

4.1 Morris 水迷宮檢測(cè)各組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能 水迷宮為直徑1.2 m 的圓形水槽，水深25 cm，保持水溫22 ℃左右，水槽內(nèi)壁飾以固定圖案，作為標(biāo)志物。小鼠每天在固定的時(shí)間游泳，保持周圍環(huán)境不變。

4.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)時(shí)在一個(gè)象限內(nèi)放置直徑為8 cm 的平臺(tái)，平臺(tái)隱藏于水下1.5 cm。實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練期為4 d，每天1次，分別從平臺(tái)之外的三個(gè)象限放入水中，每次間隔休息2 min。記錄小鼠從不同的象限下水開(kāi)始到找到水下平臺(tái)所用的時(shí)間，最大時(shí)間為120 s，超過(guò)120 s 沒(méi)有找到時(shí)，按120 s 計(jì)，人工引導(dǎo)小鼠到平臺(tái)。

4.1.2 空間搜索實(shí)驗(yàn) 定位航行實(shí)驗(yàn)后，第5 天撤去平臺(tái)，從一固定入水點(diǎn)將小鼠放入水中，記錄小鼠2 min 內(nèi)在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

4.2 組織取材 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠用10%水合氯醛（0.3 mg/kg）腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下用pH 7.4 的0.9% NaCl 溶液100 mL 對(duì)所有小鼠從左心室灌流，沖洗腦組織血液后，每組隨機(jī)選6只，快速取出左側(cè)海馬置于Golgi 染色浸泡液中，進(jìn)行Golgi染色。每組隨機(jī)選6只小鼠的左側(cè)海馬置于4%多聚甲醛PBS 緩沖液中固定，用于透射電鏡檢測(cè)。在無(wú)菌環(huán)境下冰上快速取出右側(cè)海馬，置于液氮，再置于-80 ℃超低溫冰箱，用于mRNA 和蛋白檢測(cè)。

4.3 Golgi 染色觀察海馬CA1 區(qū)錐體細(xì)胞樹(shù)突結(jié)構(gòu) 取浸泡于Golgi 染色液中的左側(cè)海馬組織進(jìn)行冰凍切片，厚度100 μm，按快速Golgi 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色、封片，并置于高倍顯微鏡下觀察。每組小鼠從同一水平的腦區(qū)切片上選取20～30 個(gè)神經(jīng)元進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Image-Pro Plus 7.0 圖像分析軟件統(tǒng)計(jì)小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘數(shù)目。

4.4 透射電鏡觀察海馬CA1 區(qū)超微結(jié)構(gòu) 左側(cè)海馬經(jīng)含4%多聚甲醛的PBS 固定2 h 后，用0.1 mol/L PBS 漂洗三次；1%四氧化鋨（鋨酸）后固定1 h；同樣漂洗三次；丙酮逐級(jí)（50%→70%→90%→100%）脫水；Epon812 環(huán)氧樹(shù)脂包埋劑與100%丙酮1∶1 比例浸泡2～4 h，包埋，切片厚度70 nm；醋酸鈾和硝酸鉛雙重染色；每例觀察3 張銅網(wǎng)，每張銅網(wǎng)隨機(jī)拍攝5張照片。

4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)海馬區(qū)SYN、NR2B 和BDNF 的mRNA 表達(dá)水平 每組隨機(jī)選取6 只小鼠的右側(cè)海馬進(jìn)行組內(nèi)合并，液氮研磨。用Trizol試劑提取總RNA；進(jìn)行濃度和純度驗(yàn)證后，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25 μL）包括：2× qPCR Mix 12.5 μL，7.5 μmol/L 引物2.0 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL，ddH2O 8.0 μL。引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃15 s→60 ℃60 s，40 次循環(huán)；熔解曲線60 ℃→95 ℃，每15 s 升溫0.3 ℃。以GAPDH 為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

4.6 Western blot 檢測(cè)海馬區(qū)SYN、NR2B 和BDNF的蛋白表達(dá)水平 每組隨機(jī)選取6 只小鼠的右側(cè)海馬樣本進(jìn)行組內(nèi)合并，液氮研磨后用組織裂解液進(jìn)行蛋白抽提；蛋白濃度測(cè)定后進(jìn)行SDS-PAGE，恒壓90 V 電泳30 min，換壓至120 V 90 min；轉(zhuǎn)PVDF 膜，用1∶200 抗體稀釋液（3%脫脂奶粉的PBST 溶液）稀釋Ⅰ抗（BDNF、SYN 和NR2B 和β-actin 抗體），4 ℃孵育過(guò)夜；洗滌后用同樣稀釋液稀釋Ⅱ抗，37 ℃搖動(dòng)孵育1 h；洗滌后在顯影儀中用ECL 顯影液顯影。采用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin灰度的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。所有數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊，組間比較用單因素方差分析，重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Morris水迷宮檢測(cè)各組小鼠學(xué)習(xí)和記憶功能

從圖1 可以看出，EA 刺激AD 模型幼鼠“百會(huì)”、“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”16 周后，經(jīng)過(guò)4 d 的水迷宮訓(xùn)練，與CO 組相比，AD 組定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)滯留時(shí)間顯著縮短（P＜0.05）；與AD組相比，EA組小鼠的定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)滯留時(shí)間顯著增加（P＜0.05）。

2 各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘比較

Golgi染色顯示，CO組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘清晰，呈樹(shù)狀，且數(shù)目較多；與CO 組比較，AD 組小鼠海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘部分丟失，數(shù)目顯著減少（P＜0.05）；與AD 組比較，EA 組小鼠海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘數(shù)目增多（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 各組小鼠海馬CA1區(qū)透射電鏡結(jié)果

與CO 組比較，AD 組小鼠海馬CA1 區(qū)突觸數(shù)目減少，前膜活化區(qū)和后膜致密帶變細(xì)，突觸末梢內(nèi)遞質(zhì)小泡數(shù)量稀疏，境界不清；與AD 組比較，EA 組可見(jiàn)大量突觸，突觸前后成分境界清楚，輪廓完整，突觸前末梢內(nèi)突觸小泡分布密集均勻，清晰可見(jiàn)，突觸后膜致密帶變厚、密度增高，活性區(qū)變厚、較長(zhǎng)，見(jiàn)圖3。

4 各組小鼠海馬SYN、NR2B 和BDNF 的mRNA 表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，與CO 組相比，AD組小鼠海馬BDNF、SYN 和NR2B 的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與AD 組相比，EA 組小鼠海馬BDNF、SYN 和NR2B 的mRNA 表達(dá)水 平顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Figure 1.Morris water maze test results of the mice in each group after electroacupuncture（EA）treatment.A：escape latency；B：number of platform crossing；C：time spent in target quadrant.Mean±SD. n=12.*P＜0.05 vs control（CO）group；#P＜0.05 vs AD group.圖1 電針治療后各組小鼠的水迷宮檢測(cè)結(jié)果

Figure 2.Comparison of dendritic structure and number of dendritic spines in hippocampal CA1 region of the mice in each group（Golgi staining，×600）.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control（CO）group；#P＜0.05 vs AD group.圖2 各組小鼠海馬CA1區(qū)樹(shù)突結(jié)構(gòu)及樹(shù)突棘數(shù)目比較

Figure 3.Transmission electron microscopy showed synapses in the hippocampus（as indicated by red arrows；scale bar=500 nm）.圖3 透射電鏡顯示海馬區(qū)突觸

5 各組小鼠海馬BDNF、SYN和NR2B的蛋白表達(dá)

從圖5 可以看出，與CO 組相比，AD 組小鼠海馬BDNF、SYN 和NR2B 的蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與AD 組相比，EA 組小鼠海馬BDNF、SYN 和NR2B的蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。

討 論

Figure 4.Relative mRNA levels of BDNF，SYN and NR2B in hippocampal tissues of the mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.01 vs control（CO）group；#P＜0.01 vs AD group.圖4 BDNF、SYN和NR2B mRNA表達(dá)相對(duì)量

Figure 5.Western blot results of BDNF，SYN and NR2B.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control（CO）group；#P＜0.05 vs AD group.圖5 BDNF、SYN和NR2B的Western blot結(jié)果

很多研究證實(shí)EA 刺激可以改善AD 病人和模型小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能［10-12］。本研究的水迷宮檢測(cè)結(jié)果也顯示，經(jīng)過(guò)16 周的電針“百會(huì)”“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”后，與AD 模型小鼠相比，EA 組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能明顯增強(qiáng)。雖然EA 對(duì)其他原因造成的突觸損傷和學(xué)習(xí)記憶障礙有改善作用［13-14］，但是，我們認(rèn)為EA 對(duì)AD 模型小鼠的防治作用具有獨(dú)特的影響。Aβ 老年斑是AD 的早期特征性病理表現(xiàn)［2］。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在5 月齡（22 周左右）開(kāi)始出現(xiàn)老年斑。在我們前期的研究中，6周齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD 模型小鼠經(jīng)過(guò)16 周的繼續(xù)飼養(yǎng)后，大腦皮層和海馬出現(xiàn)大量Aβ 老年斑，而經(jīng)過(guò)16 周的EA 干預(yù)組小鼠老年斑數(shù)量明顯減少，同時(shí)學(xué)習(xí)記憶功能得到明顯改善［15-16］。

本研究對(duì)海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突Golgi 染色也顯示，與CO 組比較，AD 組小鼠海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘部分丟失，數(shù)目減少；與AD 組比較，EA 組小鼠海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘數(shù)目明顯增多。通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，AD 模型小鼠海馬區(qū)突觸數(shù)目減少，前膜和后膜結(jié)構(gòu)稀疏不清；經(jīng)過(guò)16 周的EA 刺激“百會(huì)”“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”后突觸結(jié)構(gòu)數(shù)目增多，結(jié)構(gòu)清晰。這些結(jié)果與王煜［17］等的研究結(jié)果是一致的。樹(shù)突棘是形成突觸的重要部位，其數(shù)量可隨功能而變化，即表現(xiàn)為突觸的可塑性改變。突觸可塑性是評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶能力的生物學(xué)基礎(chǔ)。突觸結(jié)構(gòu)和生理功能的改變都可以導(dǎo)致其傳遞效能的改變［18］。這說(shuō)明EA 刺激“百會(huì)”“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”可改善AD 模型小鼠的突觸結(jié)構(gòu)，從而改善AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)，其分子機(jī)制是海馬谷氨酸突觸后NMDA 受體和AMPA 受體的大量激活，使突觸后反應(yīng)增強(qiáng)［18］。NR2B是NMDA 受體的一個(gè)調(diào)節(jié)亞單位，主要存在于海馬和皮層組織中，對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能有較強(qiáng)的影響［18-19］。有研究已經(jīng)證明，AD 模型小鼠海馬區(qū)NR2B 的表達(dá)下降［20］，通過(guò)慢病毒載體過(guò)表達(dá)NR2B 緩解了APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶障礙和焦慮抑郁樣行為［21］。本研究實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和Western blot 檢測(cè)結(jié)果也顯示，與CO 組相比，AD 組小鼠海馬NR2B 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低；與AD 組相比，EA 組小鼠海馬NR2B 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高，說(shuō)明對(duì)AD 模型鼠進(jìn)行16 周的EA 刺激“百會(huì)”“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”，其學(xué)習(xí)記憶功能的改善可能與NR2B 增加引起的突觸可塑性改善有關(guān)。

SYN 是分子量為38 000 的糖蛋白，位于突觸前結(jié)構(gòu)的突觸囊泡膜上，促進(jìn)突觸小泡的前移和遞質(zhì)的釋放，是成熟突觸小泡和突觸結(jié)構(gòu)的重要標(biāo)志性蛋白［22-23］。研究表明，SYN表達(dá)的增加能夠增強(qiáng)大鼠的空間辨別性學(xué)習(xí)記憶能力［24-25］。Dong 等［26］的研究顯示，與野生型大鼠相比，APP/PS1轉(zhuǎn)基因大鼠小腦內(nèi)SYN 和BDNF/TrkB 的表達(dá)降低，突觸間隙寬度增加，突觸后密度變薄。本研究結(jié)果也顯示，EA 刺激AD 模型小鼠后，SYN 的mRNA 和蛋白表達(dá)增加的同時(shí)，海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘數(shù)目增多，電鏡觀察突觸小泡增多、結(jié)構(gòu)呈清晰改變。這說(shuō)明EA 刺激“百會(huì)”“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”對(duì)AD 模型幼鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善與由SYN引起的海馬突觸可塑性增強(qiáng)有關(guān)。

BDNF 可以誘導(dǎo)軸突和樹(shù)突末端結(jié)構(gòu)和功能變化［27］。在器官型耳蝸外植體中，BDNF增強(qiáng)了螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和內(nèi)毛細(xì)胞之間的突觸形成，并在毒素誘導(dǎo)的突觸病中恢復(fù)了這些連接［28］。de Pins 等［29］的研究顯示，在過(guò)表達(dá)BDNF 的雜交鼠中，BDNF/TrkB下游信號(hào)傳導(dǎo)活性與樹(shù)突棘密度和形態(tài)的改善相關(guān)；與5xFAD 小鼠相比，雜交鼠的突觸標(biāo)志物PSD-95 和突觸素也有不同程度的恢復(fù)，興奮性突觸的突觸前小泡數(shù)量也有所增加。本研究結(jié)果也顯示，EA刺激AD 模型幼鼠的“百會(huì)”“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”，在電鏡觀察到突觸前活性區(qū)和突觸后致密帶增厚改變的同時(shí)，BDNF 的mRNA 和蛋白表達(dá)增加，說(shuō)明電針“百會(huì)”“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”對(duì)AD 模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善與BDNF 引起的海馬突觸可塑性改善有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)對(duì)6 周齡APP/PS1幼鼠進(jìn)行為期16 周的EA 刺激“百會(huì)”“風(fēng)府”和雙側(cè)“腎俞”，明顯改善了小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能和突觸可塑性。本研究結(jié)果將為EA刺激預(yù)防和治療AD 提供研究基礎(chǔ)，其信號(hào)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。