楊曉波，姚 愷，祖恒兵，趙永飛

（復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 201508）

帕金森?。≒arkinson disease，PD）是老年人常見的神經(jīng)退行性疾病。流行病學(xué)研究證實(shí)衰老是散發(fā)性PD最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［1］。隨著人類平均壽命的不斷延長和人口老齡化不斷加劇，衰老相關(guān)疾病日益成為一個(gè)緊迫的問題。

PD 主要由黑質(zhì)致密部多巴胺能（dopaminergic，DA）神經(jīng)元嚴(yán)重丟失引起。氧化應(yīng)激和自由基損傷被認(rèn)為是衰老發(fā)生和PD 發(fā)病的重要關(guān)聯(lián)原因［2］。PD 中存在易于導(dǎo)致DA 神經(jīng)元死亡的物質(zhì)，如功能障礙的溶酶體和泛素蛋白酶體標(biāo)志物、氧化應(yīng)激標(biāo)志物等，這些物質(zhì)在正常衰老過程中以區(qū)域特異性模式蓄積（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)），最終可促進(jìn)PD 的發(fā)生。同時(shí)，自然衰老過程中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)抗氧化應(yīng)激損害能力逐漸減弱，也增加了患PD 的風(fēng)險(xiǎn)。因此，抗氧化應(yīng)激反應(yīng)有可能對(duì)延緩衰老進(jìn)展有一定的效果。根據(jù)散發(fā)性PD 二次打擊發(fā)病理論［3］，延緩衰老進(jìn)展可能在PD 防治過程中減輕第一次打擊的損傷，從而影響二次打擊后PD的發(fā)生。

α-硫辛酸（α-lipoic acid，α-LA）是機(jī)體在線粒體內(nèi)能自身合成的化合物，可作為輔酶參與物質(zhì)代謝中的?；D(zhuǎn)移，能消除導(dǎo)致加速老化與致病的自由基，通過多種機(jī)制參與抗氧化。研究表明，大鼠PD模型中，α-LA 處理可有效保護(hù)黑質(zhì)紋狀體DA 神經(jīng)元［4-5］，但既往的研究主要集中于注射給藥，對(duì)于口服給藥模式缺乏研究，同時(shí)對(duì)相關(guān)作用機(jī)制也尚未完全闡明。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）能誘導(dǎo)經(jīng)典的氧化應(yīng)激損傷PD 模型，因此本研究選用MPTP 誘導(dǎo)的老年小鼠PD 模型，探討口服α-LA 是否在衰老和PD的發(fā)生發(fā)展起一定的預(yù)防作用。

材料與方法

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 老年健康雌性C57/BL6 小鼠在8～10周齡時(shí)購自中國科學(xué)院上海分院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，置于（25±2）℃環(huán)境下，清潔級(jí)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。飼養(yǎng)至16 月齡時(shí)隨機(jī)分組，18 月齡時(shí)實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后處死，體重33～38 g。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)均符合復(fù)旦大學(xué)倫理委員會(huì)要求。

1.2 主要試劑 α-LA 和MPTP 購自Sigma；RIPA 裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物公司；兔抗小鼠酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗體購自Millipore；兔抗小鼠血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體購自Abgent；兔抗小鼠核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗 體、兔抗小 鼠NADPH 氧化酶2（NADPH oxidase 2，NOX2/gp91phox）抗體及兔抗小鼠GAPDH（內(nèi)參照）抗體購自Abcam；山羊抗兔Ⅱ抗IgG-HRP 及熒光Ⅱ抗購自Invitrogen；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑購自Millipore。

2 方法

2.1 建立小鼠氧化應(yīng)激損傷PD 模型 C57/BL6 老年小鼠32 只，隨機(jī)分為老年MPTP 組、老年LA+MPTP 組、老年對(duì)照組和老年LA 組，每組8 只。老年LA+MPTP 組和老年LA 組在16月齡時(shí)將日常飲用水換成0.5 g/L 的α-LA 溶液，每天自由飲用，平均每只飲用5 mL/d。老年MPTP 組和老年LA+MPTP 組在出生18 個(gè)月時(shí)，MPTP 劑量第1、2 天為20 mg/（kg·d），第3～5 天為25 mg/（kg·d），用生理鹽水稀釋，每次200μL 腹腔注射，每天1 次，共5 d；老年對(duì)照組和老年LA 組腹腔注射等體積的生理鹽水。首次注射后10 d，行為學(xué)檢測(cè)之后處死動(dòng)物，30 s內(nèi)快速取腦，每組4只固定后用于免疫熒光染色，其余4只去除小腦部位，用于蛋白定量檢測(cè)，-80 ℃保存。

2.2 轉(zhuǎn)棒（rotarod）實(shí)驗(yàn) 小鼠行為學(xué)檢測(cè)采用rotarod 實(shí)驗(yàn)，在MPTP 腹腔注射后第2天開始。待測(cè)試小鼠安放于轉(zhuǎn)棒踏車（Ugo Basile）上，從4 r/min 的初速開始，在3 min 內(nèi)逐漸加速到40 r/min 的速度。計(jì)數(shù)每次從開始計(jì)數(shù)到從轉(zhuǎn)棒踏車上墜落的時(shí)間。檢測(cè)前2 d開始行為訓(xùn)練和學(xué)習(xí)，每天訓(xùn)練一次。檢測(cè)每日進(jìn)行一次，連續(xù)檢測(cè)4 d。

2.3 腦組織蛋白提取 取各組小鼠4 只，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后開胸，經(jīng)左心室先灌注溫的生理鹽水至肝臟顏色變白后，快速分離腦組織并稱量，置1.5 mL 離心管中，加入RIPA 裂解液，在冰上用勻漿器將組織勻漿。冰上充分裂解1 h，勻漿置4 ℃、12 000×g離心30 min，吸取上清液，棄沉淀，轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中。按BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度。

2.4 Western blot 將腦組織蛋白樣本與上樣緩沖液以4∶1 比例混合，100 ℃加熱5 min，每組標(biāo)本上樣蛋白量為10 μg，進(jìn)行SDS-PAGE 分離，200 mA 恒定電流下室溫電轉(zhuǎn)膜2 h；1×TBST 液洗膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h；分別將兔抗小鼠TH 抗體（1∶2 000）、兔抗小鼠Nrf2 抗體（1∶1000）、兔抗小鼠HO-1 抗體（1∶1 000）、兔抗小鼠NOX2/gp91phox抗體（1∶1 000）及兔抗小鼠GAPDH 抗體（1∶8000）4 ℃孵育過夜。1×TBST 洗膜10 min×3 次，加二抗山羊抗兔IgG-HRP，室溫孵育1 h，1×TBST 洗膜10 min×3 次；采用ECL 化學(xué)發(fā)光法置Bio-Rad 自動(dòng)曝光儀中進(jìn)行顯色曝光。圖像處理及分析：由Bio-Rad 自動(dòng)曝光儀自帶的分析軟件Image Lab 完成。TH、Nrf2、HO-1 和NOX2/gp91phox相對(duì)表達(dá)量以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照吸光度的比值表示。

2.5 免疫組織熒光 取各組小鼠4 只麻醉后開胸，經(jīng)左心室灌注溫的生理鹽水至肝臟顏色變白后，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注內(nèi)固定，分離腦組織，置10%～30%蔗糖溶液梯次脫水，OCT 包埋，液氮冰凍，LEICA 冰凍切片機(jī)切片（層厚10μm）。選取腦黑質(zhì)及紋狀體區(qū)組織標(biāo)本切片室溫充分干燥，PBS 洗5 min×3 次，5%小牛血清室溫下封閉30 min，切片分別滴加兔抗小鼠TH 抗體（1∶500）、兔抗小鼠Nrf2 抗體（1∶50）、兔抗小鼠HO-1 抗體（1∶50）、兔抗小鼠gp91phox抗體（1∶50）及大鼠抗小鼠CD11b 抗體（1∶50）；4 ℃孵育24 h 后PBS 洗5 min×3 次，滴加Fluor-555 山羊抗兔IgG（1∶1 000）或Fluor-488 山羊抗大鼠IgG（1∶1 000），室溫作用1 h。PBS 洗5 min×3 次，切片滴加Hochest 33342（1∶1 000），室溫孵育5min，PBS洗5 min×3 次，50%甘油封片。置Olympus 熒光顯微鏡下觀察，Image-Pro Plus 6.0 軟件分析免疫熒光圖像，計(jì)數(shù)黑質(zhì)和紋狀體區(qū)免疫陽性細(xì)胞或表達(dá)相應(yīng)蛋白的小膠質(zhì)細(xì)胞。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 α-LA對(duì)老年小鼠行為學(xué)的影響

為了評(píng)估較長時(shí)期口服抗氧化劑α-LA 抗衰老（即減輕首次打擊）的作用，以及是否能減輕二次打擊后DA 神經(jīng)元的丟失，我們用rotarod實(shí)驗(yàn)來評(píng)估各組小鼠的運(yùn)動(dòng)平衡和協(xié)調(diào)功能，從在轉(zhuǎn)棒上記時(shí)開始到從轉(zhuǎn)棒上跌落，時(shí)間越長代表運(yùn)動(dòng)平衡和協(xié)調(diào)功能越好。結(jié)果顯示，老年LA+MPTP 組在轉(zhuǎn)棒儀上的運(yùn)動(dòng)時(shí)間與老年對(duì)照組和老年LA 組之間無顯著差異（P＞0.05），而老年MPTP 組在轉(zhuǎn)棒儀上的運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著低于其余3 組（P＜0.05 或P＜0.01），見圖1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，α-LA 較長時(shí)期口服干預(yù)可以改善運(yùn)動(dòng)平衡和協(xié)調(diào)功能，在一定程度上減輕老年MPTPPD小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙。

Figutre 1.Results of rotarod test.MPTP：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；LA：lipoic acid；CTRL：control.Mean±SD. n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.圖1 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)

2 α-LA對(duì)老年小鼠腦內(nèi)TH表達(dá)的影響

TH 是多巴胺合成的關(guān)鍵酶，而多巴胺減少是PD 主要發(fā)病機(jī)制之一，于是我們檢測(cè)了α-LA 作用下各組小鼠腦內(nèi)TH的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，老年MPTP 組的TH 表達(dá)量顯著低于老年LA+MPTP組（P＜0.05），也顯著低于老年對(duì)照組和老年LA 組（P＜0.01），見圖2A。免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，老年小鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)TH 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞稀疏，以黑質(zhì)腹側(cè)部（ventral part of substantia nigra，vtSN）最為顯著。老年MPTP 組的TH 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞丟失最明顯，黑質(zhì)各區(qū)都很少能見完整的TH 免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元，而老年LA+MPTP 組、老年對(duì)照組和老年LA 組在vtSN 和黑質(zhì)背側(cè)部（dorsal part of substantia nigra，dtSN）TH 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞也大量丟失，但在腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）能見到一定數(shù)量完整的TH 免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元，見圖2B。以上研究結(jié)果提示，長期口服α-LA 并沒有顯著減少正常衰老狀態(tài)下的TH 神經(jīng)元丟失；在MPTP-PD 模型組中，沒有口服α-LA 的情況下，黑質(zhì)區(qū)TH 神經(jīng)元顯著丟失；而長期口服α-LA 能很好地發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和自由基清除作用，從而保護(hù)TH 神經(jīng)元免受MPTP 毒物損害造成的丟失。

3 α-LA 對(duì)老年小鼠腦內(nèi)抗氧化應(yīng)激蛋白Nrf2 和HO-1表達(dá)的影響

氧化應(yīng)激是衰老和PD 的重要原因，我們檢測(cè)α-LA 對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)分子的影響。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，老年MPTP 組的Nrf2 表達(dá)顯著低于老年LA+MPTP 組（P＜0.05），亦顯著低于老年對(duì)照組和老年LA 組（P＜0.01），而老年對(duì)照組與老年LA 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。免疫熒光結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果一致，黑質(zhì)紋狀體區(qū)老年MPTP組的Nrf2免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)（29±5）顯著低于老年LA+MPTP 組（57±6）、老年對(duì)照組（74±6）和老年LA組（96±11），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），老年對(duì)照組與老年LA 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）；我們通過CD11b 標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Nrf2免疫陽性熒光主要與CD11b 免疫陽性熒光共定位。HO-1 的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果 與Nrf2 類 似，老 年MPTP-PD 組 的HO-1 表達(dá)顯著下調(diào)，與老年LA+MPTP 組、老年對(duì)照組和老年LA 組相比均有顯著差異（P＜0.05 或P＜0.01），老年對(duì)照組與老年LA組之間無顯著差異（P＞0.05）。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果與Western blot 檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相似，老年MPTP-PD組黑質(zhì)紋狀體區(qū)的HO-1免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞（17±3）顯著低于老年LA+MPTP 組（43±8）、老年對(duì)照組（66±8）和老年LA 組（86±4），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），老年對(duì)照組與老年LA 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＞0.05）。HO-1 免疫陽性熒光也主要與CD11b 免疫陽性熒光共定位。見圖3。

Figure 2.Effect of α-lipoic acid（LA）on the expression of tyrosine hydroxylase（TH）in the brain of aged mice.A：Western blot was used to detect TH expression；B：immunofluorescence showed TH immunoreactive neurons（scale bar=50μm）.MPTP：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；CTRL：control；VTA：ventral tegmental area；dtSN：dorsal part of substantia nigra；vtSN：ventral part of substantia nigra.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.圖2 α-硫辛酸對(duì)老年小鼠腦內(nèi)酪氨酸羥化酶表達(dá)的影響

4 α-LA 對(duì)老年小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激蛋白NOX2/gp91phox表達(dá)的影響

我們進(jìn)一步檢測(cè)了氧化應(yīng)激相關(guān)的分子改變。Western blot 結(jié)果顯示，老年MPTP 組的NOX2表達(dá)顯著高于老年LA+MPTP 組（P＜0.05），也顯著高于老年對(duì)照組和老年LA 組（P＜0.05），老年對(duì)照組與老年LA 組之間無顯著差異（P＞0.05）。免疫熒光檢測(cè)與Western blot 檢測(cè)結(jié)果趨勢(shì)相似，老年MPTP 組黑質(zhì)紋狀體區(qū)的NOX2 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞（86±4）顯著高于老年LA+MPTP 組（71±5），也顯著高于老年對(duì)照組（62±4）和老年LA 組（45±6），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P＜0.05），老年對(duì)照組與老年LA組之間也有顯著差異（P＜0.05）。NOX2 免疫陽性熒光主要與CD11b 免疫陽性熒光共定位。見圖4。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與正常老年對(duì)照組相比，長期口服抗氧化劑α-LA 未發(fā)現(xiàn)能顯著改變正常衰老狀態(tài)下氧化應(yīng)激反應(yīng)Nrf2/抗氧化反應(yīng)原件信號(hào)通路中氧化和抗氧化信號(hào)因子的表達(dá)量，但在遭遇二次打擊時(shí)（MPTP 毒物損害），氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著加劇時(shí)，α-LA 能很好地發(fā)揮清除自由基、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，保護(hù)神經(jīng)元，顯著減少TH 神經(jīng)元的進(jìn)一步丟失。我們還發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞是氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要參與者。

討 論

衰老與PD 的發(fā)生密切相關(guān)，我們既往的研究也證明衰老是散發(fā)性PD 的促進(jìn)因素之一［6］，而氧化應(yīng)激損傷在其中扮演了重要角色［7］。自從發(fā)現(xiàn)MPP+通過抑制電子傳遞鏈復(fù)合物Ⅰ導(dǎo)致黑質(zhì)神經(jīng)元丟失引起帕金森癥狀群以來，線粒體功能異常、氧化應(yīng)激對(duì)黑質(zhì)內(nèi)健康、存活的神經(jīng)元的作用以及PD 發(fā)病機(jī)制的重要性的認(rèn)識(shí)不斷加深。隨著年齡增長，功能缺陷的線粒體蓄積不斷增加，線粒體產(chǎn)能過程受損，活性氧族生成增多，氧化應(yīng)激損傷加重［8］，足以引起PD 相關(guān)的神經(jīng)病理和癥狀，被認(rèn)為是PD 發(fā)病的重要原因。同時(shí)，作為PD 發(fā)生機(jī)制的多巴胺的自身代謝可導(dǎo)致α-synuclein聚集［9］，加重氧化應(yīng)激損害及神經(jīng)元損害。過多的DA 氧化代謝的產(chǎn)物可直接導(dǎo)致線粒體功能障礙、引起氧化應(yīng)激加重［10］?？梢姡€粒體功能障礙、氧化應(yīng)激損傷可促進(jìn)細(xì)胞衰老丟失，進(jìn)一步促進(jìn)PD的發(fā)生。

Figure 3.The effect of α-lipoic acid（LA）on the expression of heme oxygenase-1（HO-1）and nuclear factor E2-related factor 2（Nrf2）and HO-1 in the brain of aged mice.A and B：Western blot analysis of HO-1 and Nrf2 expression；C and D：immunofluorescence showed HO-1 and Nrf2 immunoreactive positive cells（scale bar=50 μm）.MPTP：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；CTRL：control.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.圖3 α-硫辛酸對(duì)老年小鼠腦內(nèi)抗氧化應(yīng)激蛋白Nrf2和HO-1表達(dá)的影響

Figure 4.Effect of α-lipoic acid（LA）on the expression of oxidative stress protein NOX2/gp91phox in the brain of aged mice.A：the expression of NOX2/gp91phox was detected by Western blot；B：immunofluorescence showed NOX2/gp91phox immunoreactive positive cells（scale bar=50μm）.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.圖4 α-硫辛酸對(duì)老年小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激蛋白NOX2/gp91phox表達(dá)的影響

α-LA 是一種在線粒體內(nèi)可自然合成的小分子強(qiáng)力抗氧化劑，由辛酸衍生來的二硫化合物，是線粒體的能量代謝中一些脫氫酶所必需的輔因子［11］，它含有2 個(gè)氧化的或還原的巰基基團(tuán)，其還原型稱為二氫硫辛酸，是與ROS相互作用的主要形式，其氧化型通常稱為硫辛酸，同樣能清除自由基。α-LA 的作用機(jī)制較多，它可以直接螯合鐵離子，參與其代謝，在PD 發(fā)生中起到保護(hù)作用［12］，也可以通過激活Nrf2信號(hào)通路減輕神經(jīng)細(xì)胞死亡［13］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，α-LA 可通過改變細(xì)胞內(nèi)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽的比例發(fā)揮抗氧化作用，此外，還原型α-LA 還能促進(jìn)其它抗氧化劑如谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)水平，增強(qiáng)這些抗氧化劑的作用效果［14］。鑒于線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激損傷是衰老和帕金森病共同的重要危險(xiǎn)因素，而α-LA 具有自由基清除和抗氧化作用，補(bǔ)充α-LA 來抗衰老及抗PD 的研究已在人體和動(dòng)物模型的多種器官中進(jìn)行，研究最多的是耗氧量最大的腦和心臟組織［15-16］，如研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充α-LA 可在一定程度上改善記憶［17］。

盡管既往的研究結(jié)果提示α-LA 能有效抗衰老，但具體機(jī)制仍不完全明確，其用藥方式也多為腹腔注射，而無創(chuàng)性給藥途徑的效果尚缺乏評(píng)估。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予正常老齡小鼠每天口服α-LA，無論是行為學(xué)功能評(píng)價(jià)還是檢測(cè)TH 表達(dá)量，或是檢測(cè)黑質(zhì)紋狀體區(qū)TH 免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)量，與對(duì)照組之間的差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，與PD 發(fā)病密切相關(guān)的氧化應(yīng)激平衡和抗氧化應(yīng)激損害的Nrf2 氧化應(yīng)激通路［18］中信號(hào)因子的表達(dá)也沒有顯著差異，提示在正常衰老狀態(tài)下口服α-LA 對(duì)一般衰老狀態(tài)的改善效果并不明顯。我們推測(cè)，促進(jìn)衰老是由多種因素和機(jī)制參與，氧化應(yīng)激僅是其中之一，由于衰老機(jī)制的多樣性，單一口服α-LA 的抗氧化應(yīng)激作用還不能顯著消除內(nèi)源性氧化應(yīng)激產(chǎn)生的影響，導(dǎo)致不能顯著改善衰老及PD 相關(guān)的DA 神經(jīng)元丟失及氧化應(yīng)激反應(yīng)增加。

但是，我們的研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠在受到MPTP毒物打擊時(shí)，口服α-LA 能有效減輕MPTP 作用造成的傷害。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)老年α-LA+MPTP 組的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)平衡功能顯著好于老年MPTP組，同時(shí)減緩了腦內(nèi)TH 表達(dá)的下降和多巴胺能神經(jīng)元的丟失。此外，已有文獻(xiàn)報(bào)道α-LA 對(duì)Nrf2/HO-1通路具有激活作用［19-20］，是其抗氧化作用的機(jī)制之一，但在MPTP-PD 模型中尚未證實(shí)。我們研究發(fā)現(xiàn)，老年α-LA+MPTP 組中抗氧化應(yīng)激防御分子Nrf2及其下游的保護(hù)性抗氧化因子HO-1 表達(dá)顯著高于老年MPTP 組，而代表氧化應(yīng)激反應(yīng)嚴(yán)重度的NOX2表達(dá)顯著低于老年MPTP 組，說明口服α-LA 還能夠誘導(dǎo)Nrf2 氧化應(yīng)激通路激活，維持腦內(nèi)氧化應(yīng)激平衡，從而起到保護(hù)作用，與以往研究結(jié)果相似［21］。

綜上所述，α-LA 是一個(gè)有效的抗氧化劑和自由基清除劑，在正常生理性衰老狀態(tài)下并沒有顯著的保護(hù)黑質(zhì)紋狀體區(qū)DA 神經(jīng)元效果，但當(dāng)遭受環(huán)境因素的2 次打擊時(shí)，線粒體功能嚴(yán)重異常、自由基產(chǎn)生過度失衡，氧化應(yīng)激損傷明顯加重，超過了機(jī)體自身抗氧化能力，長期口服α-LA 能顯著緩解氧化應(yīng)激，減少黑質(zhì)紋狀體區(qū)DA 神經(jīng)元的進(jìn)一步丟失，具有一定的預(yù)防PD效果。