張馳昊，鄭 迪，張 成，軒永麗，李文華，2△

（1徐州醫(yī)科大學(xué)心血管病研究所，江蘇徐州 221000；2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇徐州 221000）

隨著臨床介入技術(shù)的廣泛使用，由對(duì)比劑引起的急性腎損傷（contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI）已成為臨床急性腎損傷發(fā)生的重要原因［1-3］，CI-AKI 的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，目前公認(rèn)主要與對(duì)比劑的直接毒性作用、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變及氧化應(yīng)激損傷有關(guān)［4-6］。CI-AKI 尚無(wú)有效治療方法，當(dāng)前公認(rèn)的水化療法可以預(yù)防但具有一定的局限性［7］，有報(bào)道N-乙酰半胱氨酸、維生素C 等藥物能夠減輕CI-AKI［8-9］，但尚未在臨床廣泛使用。蝦青素（astaxanthin，AST）是在自然界中廣泛存在的一種類(lèi)胡蘿卜素，是目前已知較強(qiáng)的天然抗氧化劑［10］。研究證明AST 能夠減少活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的釋放從而減輕大鼠CI-AKI［11］，但機(jī)制未完全明確。有實(shí)驗(yàn)研究表明增強(qiáng)線粒體自噬能夠減輕大鼠急性腎損傷［12］。本研究通過(guò)大鼠CI-AKI模型探討PTEN 誘導(dǎo)假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/parkin信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體自噬在CI-AKI 發(fā)生中的作用及AST 預(yù)處理的治療效果，為CI-AKI預(yù)防藥物研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)7 周齡雄性SD 大鼠50 只，重（250±20）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為20211203Aazz0619000930。

2 主要試劑

AST 購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；吲哚美辛購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；N-硝基-L-精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine methylester，L-NAME）購(gòu)自北京索萊寶科技公司；碘海醇（每mL 含350 mg I）購(gòu)自揚(yáng)子江藥業(yè)；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；血清肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天；SDS-PAGE 試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程；ROS 染液、熱休克蛋白60（heat shock protein 60，Hsp60）抗體、Cy3-TSA和FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG購(gòu)自武漢賽維爾。兔抗PINK1 抗體（AFFINITY）；兔抗parkin 抗體（Abcam）；兔抗微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）抗體和溶酶體相關(guān)膜蛋白2（lysosomal-associated membrane protein 2，LAMP2）抗體（北京博奧森生物科技有限公司）；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG 和鼠抗GAPDH 抗體（Proteintech）；ECL顯色液購(gòu)自Bioworld。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 50 大鼠隨機(jī)分為5 組，假手術(shù)（sham）組、造模組（CI-AKI 組）、AST 治療組（AST+CI-AKI 組）、自噬抑制劑組（3-MA+CI-AKI 組）和AST 聯(lián)合自噬抑制劑組（AST+3-MA+CI-AKI 組），每組各10 只。大鼠模型構(gòu)建參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行，具體操作如下：大鼠禁食禁水12 h，10%水合氯醛麻醉（3.0 mL/kg）麻醉，各組經(jīng)尾靜脈依次注射吲哚美辛（10 mg/kg）、L-NAME（10 mg/kg）和碘海醇（每kg 含3 g碘），每次給藥間隔15 min；sham 組大鼠于相同時(shí)點(diǎn)依次注射相對(duì)應(yīng)藥劑等體積的PBS、生理鹽水和生理鹽水。AST+CI-AKI組在給予AST 灌胃1周后進(jìn)行CI-AKI模型的建立，且于造模后3 d繼續(xù)給予AST 灌胃。3-MA+CI-AKI 組參照前人文獻(xiàn)［13］在造模前30 min 腹腔注射3-MA 溶液（20 mg/kg），后進(jìn)行CI-AKI模型的建立。AST+3-MA+CI-AKI 組造模前給予AST灌胃1 周，并且于造模前30 min 腹腔注射3-MA 溶液，后進(jìn)行CI-AKI 模型建立，造模后給予AST 灌胃3 d。所有組大鼠于造模后72 h，心臟穿刺取血6～8 mL，室溫下靜置2 h，4 ℃、1 580×g離心15 min，取上清置于-80 ℃保存待用；剪開(kāi)腹部皮膚及肌肉組織，分離出雙側(cè)腎臟，組織剪剪取小部分腎臟置于電鏡固定液中4 ℃保存，以備后續(xù)電鏡樣本制作，切取腎臟切片，修剪整齊后部分置于4%多聚甲醛中，4 ℃保存，用于石蠟切片制作及HE 染色、免疫熒光檢測(cè)，部分置于-80 ℃保存，以備后續(xù)ROS 的檢測(cè)，剩余部分腎臟組織塊置于-80 ℃固定保存，用于腎臟組織蛋白提取及Western blot 檢測(cè)。

3.2 SCr 和BUN 檢測(cè) 取保存的血清樣本，按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)SCr和BUN水平。

3.3 腎臟組織T-SOD 和MDA 檢測(cè) 取保存的腎臟組織塊，按重量體積比1∶10 加入生理鹽水，研磨離心后取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，按T-SOD 和MDA 試劑盒說(shuō)明書(shū)配制試劑，檢測(cè)腎臟組織T-SOD和MDA水平。

3.4 HE 染色 取保存于4%多聚甲醛中的腎臟組織，按脫水透明浸蠟、包埋、切片步驟制作石蠟切片，按脫蠟、蘇木素-伊紅染色、脫水步驟進(jìn)行切片HE 染色，光學(xué)顯微鏡下（×400）觀察分析。

3.5 ROS 染色 取保存于-80 ℃中的腎臟組織，經(jīng)OCT 包埋、切片后制作成冰凍切片，再經(jīng)淬滅組織自發(fā)熒光、ROS 染色、DAPI 復(fù)染細(xì)胞核后，置于熒光顯微鏡下（×400）觀察分析。

3.6 透射電鏡觀察 取保存于4 ℃電鏡固定液中的腎臟組織小塊，經(jīng)漂洗、再次固定、脫水、包埋、聚合制成樹(shù)脂塊，后經(jīng)切片、染色制成銅網(wǎng)切片，于透射電鏡（Hitachi HT7800）下（×5 000）觀察分析。

3.7 免疫熒光雙標(biāo)共定位 取保存于4%多聚甲醛中腎臟組織，制作成石蠟切片后，按脫蠟、抗原修復(fù)、孵育LC3 抗體、孵育Ⅱ抗、CY3-TSA 染色標(biāo)記、孵育Hsp60（或LAMP2）抗體、熒光Ⅱ抗孵育標(biāo)記、DAPI復(fù)染細(xì)胞核、淬滅自發(fā)熒光后封片，置于熒光顯微鏡（Nikon Eclipse C1）下（×400）觀察分析。

3.8 Western blot 檢測(cè) 取保存于-80 ℃中的腎臟組織塊，經(jīng)提取蛋白后，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣本置于電泳儀中電泳，后經(jīng)電轉(zhuǎn)、脫脂奶粉溶液封閉，按說(shuō)明書(shū)配制抗體工作液（PINK1、parkin、LC3和LAMP2 抗體均按1∶2 000 稀釋?zhuān)? ℃搖床孵育過(guò)夜，相應(yīng)Ⅱ抗（1∶5 000）孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)成像。以GAPDH 為內(nèi)參照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 大鼠SCr和BUN的檢測(cè)

大鼠心臟取血后提取血清進(jìn)行SCr 和BUN 檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。CI-AKI組大鼠SCr和BUN水平較sham 組顯著升高（P＜0.05）；AST+CI-AKI 組SCr 和BUN 水平較CI-AKI 組顯著降低（P＜0.05）；與此相對(duì)應(yīng)的，3-MA+CI-AKI 組SCr 和BUN 水平較CI-AKI 組顯著上升（P＜0.05），而AST+3-MA+CI-AKI 組SCr 和BUN水平較AST+CI-AKI組顯著升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清肌酐及血尿素氮水平Table 1.SCr and BUN levels of rats in each group（Mean±SEM.n=10）

2 大鼠腎臟組織T-SOD和MDA的檢測(cè)

大鼠處死后摘取腎臟組織進(jìn)行T-SOD 和MDA檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。CI-AKI 組T-SOD 活性較sham 組顯著降低，MDA 含量顯著增加（P＜0.05）；同樣地，與CI-AKI 組相比，AST+CI-AKI 組T-SOD 活性顯著增高，MDA 含量顯著減少（P＜0.05），而3-MA+CI-AKI組T-SOD 活性較CI-AKI 組顯著降低，MDA 含量顯著增加（P＜0.05）；與此相對(duì)應(yīng)的，AST+3-MA+CI-AKI組T-SOD活性較AST+CI-AKI組顯著降低，MDA含量顯著增加（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腎臟組織T-SOD及MDA水平Table 2.T-SOD and MDA levels in kidney tissues of rats in each group（Mean±SEM. n=10）

3 腎臟HE染色

大鼠腎臟組織取材后進(jìn)行HE 染色，結(jié)果如圖1所示。sham組腎小管結(jié)構(gòu)清晰、無(wú)擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊；CI-AKI組腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，腎小管可見(jiàn)擴(kuò)張，同時(shí)部分官腔可見(jiàn)阻塞，腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)空泡樣變性；AST+CI-AKI 組腎小管上皮細(xì)胞損傷與CI-AKI 組比較明顯減輕，而3-MA+CI-AKI 組腎小管細(xì)胞損傷與CI-AKI組比較明顯加重。

4 透射電鏡觀察線粒及自噬小體形態(tài)

大鼠腎臟組織取材后進(jìn)行電鏡標(biāo)本制作后行透射電鏡觀察，結(jié)果如圖2 所示。sham 組線粒體體積較大；而CI-AKI 組線粒體較sham 組可見(jiàn)線粒體體積減小，可見(jiàn)線粒體碎片及少量自噬小體；3-MA+CIAKI 組可見(jiàn)線粒體損傷嚴(yán)重及大量線粒體碎片，未見(jiàn)自噬小體；AST+CI-AKI 組線粒體呈長(zhǎng)橢圓形，體積較大可見(jiàn)較多自噬小體及包裹了線粒體小碎片的自噬小體；與AST+CI-AKI 組相比，AST+3-MA+CIAKI組線粒體較小，自噬小體數(shù)量很少。

Figure 1.Observation under optical microscope（HE staining，scale bar=50 μm）.A：sham group；B：CI-AKI group；C：AST+CIAKI group：D：3-MA+CI-AKI group；E：AST+3-MA+CI-AKI group.No tubular lumen stenosis and vacuolar degeneration of tubular epithelial cells were seen in the sham group，while obvious tubular lumen stenosis and massive vacuolar degeneration of tubular epithelial cells were seen in the CI-AKI group，and lumen stenosis and vacuolar degeneration were significantly reduced in the AST+CI-AKI group and aggravated in the 3-MA+CI-AKI group.圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色

5 免疫熒光雙標(biāo)共定位檢測(cè)

大鼠腎臟組織取材后，進(jìn)行雙標(biāo)免疫熒光染色，后行熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖3、4所示：與sham 組相比，CI-AKI 組LC3 表記的自噬小體與Hsp60 標(biāo)記的線粒體兩者距離較近，有共定位信號(hào)，LC3 標(biāo)記的自噬小體與LAMP2 標(biāo)記的溶酶體距離較近，可見(jiàn)共定位信號(hào)，可認(rèn)為CI-AKI 組較sham 組線粒體自噬水平有所提高；與CI-AKI 組相比，AST+CI-AKI 組LC3表記的自噬小體與Hsp60 標(biāo)記的線粒體距離較近，共定位信號(hào)較多，LC3 標(biāo)記的自噬小體與LAMP2 標(biāo)記的溶酶體共定位信號(hào)同樣較多，可見(jiàn)AST+CI-AKI組線粒體自噬水平及細(xì)胞自噬水平較CI-AKI組明顯提高；3-MA+CI-AKI 組LC3 標(biāo)記的自噬小體熒光強(qiáng)度微弱，且與Hsp60 標(biāo)記的線粒體距離較遠(yuǎn)，未見(jiàn)有共定位信號(hào)，線粒體自噬及細(xì)胞自噬水平很低。

6 冰凍切片ROS染色

大鼠腎臟組織取材后，立即放于-80 ℃保存，后進(jìn)行冰凍切片制作及ROS 染色，結(jié)果如圖5 所示：sham組ROS表達(dá)很少，CI-AKI組較sham組ROS表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05），3-MA+CI-AKI 組較CI-AKI組ROS 表達(dá)水平有顯著上升（P＜0.05），AST+CI-AKI組較CI-AKI 組ROS 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），AST+3-MA+CI-AKI 組與AST+CI-AKI 組相比，ROS 表達(dá)量有顯著上升（P＜0.05）。

7 Western blot檢測(cè)結(jié)果

Figure 2.Mitochondria and autophagic vesicles were observed by transmission electron microscopy（scale bar=1 μm）.A：sham group；B：CI-AKI group；C：AST+CI-AKI group：D：3-MA+CI-AKI group；E：AST+3-MA+CI-AKI group.The mitochondria in the sham group were large and no autophagosomes were seen.The mitochondria in the CI-AKI group were small and sporadic autophagosomes were seen.The mitochondria in the AST+CI-AKI group were large and more autophagosomes were seen，and mitochondrial fragments wrapped by autophagosomes were seen.The mitochondria in the 3-MA+CI-AKI group were small and no autophagosomes were seen，and a large number of small mitochondrial fragments were seen.圖2 透射電鏡下各組大鼠腎組織線粒體及自噬小體形態(tài)

Figure 3.LC3-labeled autophagosomes（red）were fluorescently double-stained with Hsp60-labeled mitochondria（green）.The scale bar=50 μm.In the sham group，the two fluorescent signals were far apart and no co-localization was seen.In the CI-AKI group，the two signals were seen to be closer and co-localized，but the fluorescence intensity was weak.In the AST+CIAKI group，the two signals were seen to be extremely close and co-localized，and the fluorescence intensity was strong.In the 3-MA+CI-AKI group，the two signals were not co-localized and the fluorescence intensity was weak.圖3 LC3標(biāo)記的自噬小體與Hsp60標(biāo)記的線粒體熒光雙染

Figure 4.LC3-labeled autophagosomes（red）and LAMP2-labeled lysosomes（green）were fluorescently double-stained（scale bar=50 μm）.In the sham group，the two fluorescence intensities were seen to be weak，far apart and no co-localization was seen.In the CI-AKI group，the two fluorescence intensities were seen to be slightly stronger，slightly close together and a small amount of co-localization was seen.In the AST+CI-AKI group，the two fluorescence intensities were seen to be stronger，closer together and more co-localization was seen.In the 3-MA+CI-AKI group，the two fluorescence intensities were seen to be very weak，far apart and no co-localization was seen.圖4 LC3標(biāo)記的自噬小體與LAMP2標(biāo)記的溶酶體熒光雙染

Western blot 結(jié)果見(jiàn)圖6、7，與sham 組相比，CIAKI 組大鼠腎組織中PINK1、parkin、LC3 II/LC3 I 及LAMP2 蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；使用AST 預(yù)處理 后，與CI-AKI 組相比，AST+CI-AKI 組PINK1、parkin、LC3 II/LC3 I 及LAMP2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；在自噬抑制劑干預(yù)組，與CI-AKI組相比，3-MA+CI-AKI 組大鼠腎組織中PINK1、parkin、LC3 II/LC3 I 及LAMP2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；聯(lián)合應(yīng)用AST與自噬抑制劑后，與AST預(yù)處理的AST+CI-AKI組相比，AST+3-MA+CI-AKI組大鼠腎組織中PINK1、parkin、LC3 II/LC3 I 及LAMP2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。

討 論

CI-AKI 是介入術(shù)后常見(jiàn)并發(fā)癥之一，是造成醫(yī)源性急性腎損傷的三大原因之一。目前研究CI-AKI發(fā)病機(jī)制的主要方法即為制備碘對(duì)比劑的急性腎損傷動(dòng)物模型的。本研究中大鼠CI-AKI的病理改變主要以腎小管損傷為主，可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、管腔狹窄和腎小管擴(kuò)張等，在給予AST 預(yù)處理后，腎小管損傷可見(jiàn)明顯減輕，說(shuō)明AST 能夠改善大鼠CI-AKI 的腎臟病理?yè)p害，而在使用自噬抑制劑干預(yù)的組別中，腎小管損傷有所加重。作為診斷CIAKI 傳統(tǒng)指標(biāo)的SCr 及BUN 主要反映腎小球的濾過(guò)功能，本實(shí)驗(yàn)中AST 預(yù)處理能明顯降低大鼠SCr 及BUN，表明AST 能夠減輕大鼠CI-AKI 后的腎小球損傷，在使用自噬抑制劑干預(yù)的組別中，大鼠SCr 及BUN 顯著上升。由此表明，AST 能夠改善大鼠CIAKI 后的腎小球?yàn)V過(guò)功能及腎小管損傷，而抑制自噬會(huì)加重腎小管及腎小球的損傷。

CI-AKI的發(fā)病機(jī)制目前公認(rèn)的有以下幾種：（1）碘對(duì)比劑的直接毒性作用；（2）血液動(dòng)力學(xué)改變；（3）氧化應(yīng)激損傷。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷是碘對(duì)比劑引起急性腎損傷的重要機(jī)制，碘對(duì)比劑造成腎臟的缺血缺氧，會(huì)引起ROS 的釋放，并引發(fā)急性腎小管壞死［6］。

ROS 是引起氧化應(yīng)激損傷的主要物質(zhì)，本課題組前期研究表明［11］，大鼠對(duì)比劑急性腎損傷的氧化應(yīng)激主要與線粒體途徑的ROS釋放有關(guān)。因此減少ROS 的過(guò)量釋放是緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的關(guān)鍵，而減少ROS的過(guò)量釋放可以通過(guò)減少線粒體的分裂以及避免線粒體小碎片的破裂來(lái)實(shí)現(xiàn)。

Figure 5.ROS staining of rat kidneys in each group（scale bar=50 μm）.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs CIAKI group；$P＜0.05 vs AST+CI-AKI group.圖5 冰凍切片ROS染色

自噬是通過(guò)吞噬并降解受損細(xì)胞器從而使細(xì)胞自我修復(fù)維持相應(yīng)功能，是細(xì)胞自我修復(fù)的重要途徑之一。其中選擇性降解線粒體的自噬，就被稱(chēng)為線粒體自噬。有研究表明，線粒體自噬是通過(guò)細(xì)胞自噬靶向清除受損傷的線粒體的過(guò)程，具有選擇性［14］。通過(guò)增強(qiáng)線粒體自噬可以使得自噬小體及溶酶體降解線粒體小碎片減少ROS 的釋放，阻止ROS過(guò)量產(chǎn)生，從而緩解氧化應(yīng)激損傷。本實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)透射電鏡觀察可見(jiàn)，在使用AST 預(yù)處理后，大鼠腎臟組織中線粒體體積增大，線粒體小碎片的產(chǎn)生減少，自噬小體增加，并可見(jiàn)自噬小體包裹線粒體小碎片，而在使用自噬抑制劑干預(yù)的組別中，可見(jiàn)大鼠腎組織線粒體體積較小，大量線粒體小碎片，未見(jiàn)自噬小體；冰凍切片ROS 染色可見(jiàn)，使用AST 預(yù)處理后，大鼠腎組織中ROS的表達(dá)量明顯降低，而在使用自噬抑制劑干預(yù)的組別中可見(jiàn)大鼠腎組織ROS表達(dá)量明顯上升，由此可以認(rèn)為，在大鼠CI-AKI 模型中，抑制自噬會(huì)加重線粒體碎片的產(chǎn)生及ROS 的釋放，而AST 預(yù)處理能夠明顯增強(qiáng)線粒體自噬并減少ROS的釋放。

Figure 6.The protein expression of PINK1 and parkin of rats in each group.Mean±SEM. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs CI-AKI group；$P＜0.05 vs AST+CI+AKI group.圖6 各組大鼠腎組織PINK1和parkin的蛋白表達(dá)量

線粒體自噬是維持線粒體數(shù)量及質(zhì)量的動(dòng)態(tài)平衡的一種重要方式之一，PINK1/parkin通路介導(dǎo)的線粒體自噬是主要機(jī)制之一。PINK1 是一種靶向線粒體及激 酶［15-16］。parkin 是一個(gè)E3 泛素連接酶，與PINK1 一樣，最初被認(rèn)為是與帕金森病息息相關(guān)的一組蛋白［17-18］。在正常線粒體中，PINK1 被轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜并被泛素-蛋白酶系統(tǒng)剪切及降解，當(dāng)線粒體受到損傷后，PINK1 轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)膜途徑被阻斷從而導(dǎo)致PINK1 在線粒體表面累積，自身發(fā)生磷酸化而被激活，激活的PINK1 將parkin 招募至線粒體表面并將其磷酸化，磷酸化的parkin 將線粒體膜上底物蛋白多聚泛素化，之后LC3 適配體蛋白識(shí)別多聚泛素化的底物蛋白并與之結(jié)合后，進(jìn)入自噬體，再與溶酶體結(jié)合，形成自噬-溶酶體，最終將受損的線粒體降解。在已知的自噬相關(guān)基因（Autophagy-related gene，Atg）編碼蛋白中，只有LC3 可以定位于所有類(lèi)型的自噬膜，新生的LC3（proLC3）在合成后立即被加工成LC3 I［19］，在自噬過(guò)程中，胞質(zhì)中的LC3 I 通過(guò)活化酶和結(jié)合酶與磷脂酰乙醇胺結(jié)合稱(chēng)為L(zhǎng)C3 II［20-21］，然后LC3 II被招募到自噬體膜上，當(dāng)自噬結(jié)束時(shí)，LC3 II被降解［22-23］。LAMP2構(gòu)成了溶酶體中絕大多數(shù)膜蛋白，有助于自噬空泡的成熟，有利于自噬溶酶體中細(xì)胞質(zhì)蛋白的選擇性導(dǎo)入和降解［24-25］。在本實(shí)驗(yàn)研究中，使用AST 預(yù)處理后，LC3 及Hsp60 免疫熒光雙染可見(jiàn)，兩者共定位信號(hào)有明顯增強(qiáng)，LC3 及LAMP2 免疫熒光雙染后，兩者共定位信號(hào)也明顯增強(qiáng)，同時(shí)PINK1 和parkin 蛋白表達(dá)量明顯上升，LC3 II/LC3 I 及LAMP2 蛋白表達(dá)量也有明顯上升，表明AST 能夠通過(guò)上調(diào)PINK1/parkin 通路增強(qiáng)線粒體自噬。

AST 已被證實(shí)除具有抗氧化能力外，還具有抗炎、調(diào)節(jié)脂質(zhì)及糖代謝的能力，且能夠預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓及血脂異常等疾病，對(duì)心血管系統(tǒng)有益［26］。同時(shí)AST 在腎臟相關(guān)疾病的動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出較好的治療能力［27-28］。我們的研究結(jié)果表明大鼠CI-AKI 模型經(jīng)過(guò)AST 預(yù)處理后，ROS 表達(dá)水平明顯降低，T-SOD及MDA水平也有相應(yīng)表現(xiàn)，同時(shí)線粒體自噬效應(yīng)明顯增強(qiáng)，相應(yīng)的線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1 及parkin 表達(dá)均有所上調(diào)，且于自噬小體與溶酶體產(chǎn)生相關(guān)的LC3 II/LC3 I 及LAMP2 蛋白也有相應(yīng)的上升，這與既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似［29-32］，由此我們推測(cè)AST 通過(guò)上調(diào)PINK1/parkin 通路，增強(qiáng)線粒體自噬，減少ROS的釋放，減輕氧化應(yīng)激損傷緩解大鼠對(duì)比劑急性腎損傷。本研究為對(duì)比劑急性腎損傷的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但AST 對(duì)腎臟的保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。