宋正陽，施曉倩，田云娜，王新雨，張 賽，王肖婷，張聰聰，王萬鐵△

（1溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所，浙江溫州 325035；2杭州醫(yī)學(xué)院中醫(yī)教研室，浙江杭州 310052；3浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，浙江寧波 315000）

低氧高二氧化碳性肺動(dòng)脈高壓（hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH）主要包括肺血管收縮、肺血管壁重構(gòu)和血栓形成三個(gè)方面［1］。其中，肺血管收縮和肺血管重構(gòu)為主要的致病環(huán)節(jié)［2］。而且，肺血管發(fā)生重構(gòu)后無法逆轉(zhuǎn)。因此，探明HHPH 的發(fā)生機(jī)制，進(jìn)而為防治HHPH 提供新的理論依據(jù)，是十分重要的研究課題。

研究表明，細(xì)胞自噬在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展中扮演著不可輕視的角色。自噬廣泛存在于機(jī)體組織中，在饑餓、病理應(yīng)激或者藥物（諸如雷帕霉素）等刺激時(shí)，通過降解自身細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)為細(xì)胞提供能量［3-4］。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路是最經(jīng)典的也是目前研究最多的自噬通路，整合了有關(guān)能量、營養(yǎng)狀態(tài)和生長因子的信號，參與了各種細(xì)胞的生長增殖過程。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）作為一個(gè)重要的能量轉(zhuǎn)換器，直接或者間接調(diào)節(jié)mTOR 復(fù)合體1（mTOR complex 1，mTORC1）活性［5-6］。AMPK/mTOR 信號通路是否參與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制又是如何，可以作為HHPH 的一個(gè)治療靶點(diǎn)進(jìn)行更深入的探討。

材料和方法

1 細(xì)胞與試劑

大鼠PASMCs 購于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；AMPK 激動(dòng)劑阿卡地新（acadesine；即5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside，AICAR）和AMPK抑制劑dorsomorphin（又稱compound C，CC）購于MedChemExpress；兔抗大鼠mTOR、p-mTOR、微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、p62、AMPK、p-AMPK、caspase-3和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體均購于Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購于Biosharp；CCK-8 試劑盒購于Dojindo；高糖DMEM 培養(yǎng)液、胰酶和胎牛血清均購于Gibco；Beyo-Click?EdU-488 細(xì)胞增殖檢測試劑盒購于碧云天公司；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞模型制備及分組 PASMCs 長至80%～90%時(shí)，用純高糖DMEM 培養(yǎng)液置于常氧培養(yǎng)箱（21%O2，5%CO2，74%N2，37 ℃）饑餓處理24 h，之后棄去舊培養(yǎng)液并洗滌，隨機(jī)分為5 組［正常對照（normal control，N）組、模型組（HH 組）、溶劑二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）組（D 組）、AICAR 組（AI組）和CC 組］，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)分組加入不同的培養(yǎng)混合液。N 組在常氧箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；HH 組用DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，D 組在DMEM 高糖培養(yǎng)液中加入與抑制劑相同比例的DMSO，AI 組在DMEM 高糖培養(yǎng)液中加入1 mmol/L AICAR 溶液，CC 組在DMEM 高糖培養(yǎng)液中加入10μmol/L CC，后4組均置于造模箱內(nèi)（5%O2，6%CO2，89%N2，37 ℃）培養(yǎng)24 h。

2.2 CCK-8 法檢測細(xì)胞的活力 取對數(shù)生長期的PASMCs 細(xì)胞按每孔1×104個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于96 孔板（每組3～6 個(gè)復(fù)孔），按以上分組造模結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液并用PBS洗滌，每孔加入110μL CCK-8混合液，37 ℃常氧培養(yǎng)箱孵育1 h 后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度（absorbance，A），取每組平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞相對活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。

2.3 5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）法檢測細(xì)胞增殖情況 取對數(shù)期生長的細(xì)胞接種于24 孔板，造模處理后，每孔加300 μL 工作液和等比例培養(yǎng)液，37 ℃孵育2h，去除培養(yǎng)液加1 mL 固定液（4%多聚甲醛），洗3 次，每次5 min；每孔加1 mL通透液，室溫15 min，PBS洗3次，每次5 min；每孔加100 μL click 反應(yīng)液，避光孵育30 min，洗3次，每次5 min；每孔200μL 1×Hoechest 33342，避光孵育10 min，洗3 次，每次5 min。封片后用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

2.4 TUNEL 檢測細(xì)胞凋亡情況 將細(xì)胞懸液接種在24 孔板1 cm×1 cm 的玻片上，待細(xì)胞貼壁后，饑餓過夜，隨后進(jìn)行不同處理。造模結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)液，PBS 清洗，加入4%多聚甲醛于4 ℃固定25 min。按TUNEL 細(xì)胞凋亡試劑盒的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后使用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照觀察，計(jì)算TUNEL 陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

2.5 qPCR 法檢測PASMCs 中LC3、p62 和caspase-3的mRNA 表達(dá)水平 造模結(jié)束的細(xì)胞去除培養(yǎng)液洗滌后，10 cm培養(yǎng)液加入1 mL Trizol，祛酶移液槍頭刮取細(xì)胞，加入1/5 體積氯仿，上下顛倒混勻，靜置15 min。4 ℃、12 000 r/min 離心25 min。吸取上層水相（約300 μL），隨后加等體積異丙醇使RNA 沉淀，棄上清同時(shí)加75%乙醇使沉淀懸浮，再次離心收集RNA。測完RNA 濃度后，進(jìn)行cDNA 合成和gDNA 去除及qPCR體系與條件的操作，所得結(jié)果以2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

2.6 Western blot 檢測PASMCs 中AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、LC3、p62、caspase-3 和PCNA 蛋白水平 取造模結(jié)束的細(xì)胞置于冰上，PBS 清洗后加入約1 mL 細(xì)胞裂解液（VPMSF∶VRIPA=1∶100），離心后收集上清。用BCA試劑盒測蛋白總濃度。每組加總上樣量1/5 體積的loading buffer，混合后煮沸8 min 備用。以每孔30 μg 的蛋白上樣量進(jìn)行電泳，并轉(zhuǎn)膜，10%脫脂牛奶中室溫封閉1.5 h。Ⅰ抗（AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、LC3、p62、caspase-3 和PCNA 抗體，1∶1 000）4 ℃冰箱過夜。次日洗滌后孵Ⅱ抗（1∶10 000）。孵育完成后，將漂洗后的PVDF 膜置于曝光儀中，滴加化學(xué)發(fā)光液（VA液∶VB液=1∶1），曝光并保存結(jié)果。

2.7 透射電鏡觀察PASMCs 中的自噬小體 取長勢良好的PASMCs 制成細(xì)胞懸液并離心，經(jīng)前固定、后固定和醋酸鈾塊染后，用丙酮脫水、浸透。待包埋聚合之后，分別對標(biāo)本進(jìn)行半薄和超薄切片，并用透射電鏡觀察PASMCs的超微結(jié)構(gòu)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組樣本間均數(shù)差異的比較用單因素方差分析（ANOVA），采用LSD 法對方差齊者進(jìn)行兩兩組間比較；方差不齊則采用Dunnett's T3檢驗(yàn)，P＜0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組細(xì)胞的活力

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與N 組相比，HH 組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.01）；與HH 組相比，D 組細(xì)胞活力的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），AI 組細(xì)胞活力進(jìn)一步增強(qiáng)（P＜0.05），而CC 組細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.The viability of PASMCs determined by CCK-8 assay.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs N group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HH group.圖1 CCK-8法測定PASMCs活力

2 各組細(xì)胞的增殖情況

EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與N 組相比，HH 組細(xì)胞EdU 陽性率顯著上升（P＜0.01）；與HH 組相比，AI 組細(xì)胞EdU陽性率進(jìn)一步上升（P＜0.05），而CC組細(xì)胞EdU陽性率顯著下降（P＜0.01），見圖2。

3 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況

TUNEL 染色結(jié)果顯示，與N 組相比，HH 組細(xì)胞TUNEL 染色陽性率顯著下降（P＜0.01）；與HH 組相比，AI 組TUNEL 染色陽性率進(jìn)一步下降（P＜0.05），而CC 組TUNEL 染色陽性率顯著上升（P＜0.01），見圖3。

4 各組細(xì)胞LC3、p62和caspase-3的mRNA表達(dá)

qPCR 結(jié)果顯示，與N 組相比，HH 組LC3 的mRNA 表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01），而p62 和caspase-3 的mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）；D 組LC3、p62 和caspase-3 的mRNA 表達(dá)水平與HH 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；AI 組LC3 的mRNA表達(dá)水平與HH 組相比顯著上升（P＜0.01），而p62和caspase-3 的mRNA 表達(dá)水平與HH 組相比顯著下降（P＜0.01）；CC 組LC3 的mRNA 表達(dá)水平比HH 組降低（P＜0.01），而p62 和caspase-3 的mRNA 表達(dá)水平比HH組上升（P＜0.01），見圖4。

Figure 2.Hoechst 33342 and EdU staining of PASMCs（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs N group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HH group.圖2 EdU測定PASMCs的增殖能力

5 各組細(xì)胞AMPK和mTOR的磷酸化水平

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與N 組相比，HH 組p-AMPK/AMPK 比值顯著升高（P＜0.01），而p-mTOR/mTOR 比值顯著下降（P＜0.01）；D 組p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR 比值與HH 組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；AI組p-AMPK/AMPK 比值與HH組相比顯著升高（P＜0.01），p-mTOR/mTOR 比值與HH 組相比顯著降低（P＜0.01）；CC 組p-AMPK/AMPK 比值比HH 組低（P＜0.01），p-mTOR/mTOR 比值與HH 組相比顯著升高（P＜0.01），見圖5。

6 各組細(xì)胞LC3、p62、caspase-3和PCNA表達(dá)水平

Figure 3.Apoptosis of PASMCs determined by TUNEL staining（scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs N group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HH group.圖3 TUNEL測定PASMCs的凋亡水平

Figure 4.Relative mRNA levels of LC3，p62 and caspase-3 in each group.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs N group；##P＜0.01 vs HH group.圖4 各組LC3、p62和caspase-3的相對mRNA水平

Figure 5.The protein levels of AMPK，p-AMPK，mTOR and pmTOR in PASMCs were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs N group；##P＜0.01 vs HH group.圖5 Western blot檢測各組細(xì)胞中AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR蛋白水平

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與N 組相比，HH 組LC3-II/LC3-I比值顯著升高（P＜0.01），p62和caspase-3 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），PCNA 表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）；D 組與HH 組相比LC3-II/LC3-I 比值及p62、caspase-3 和PCNA 蛋白水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；AI 組LC3-II/LC3-I 比值和PCNA 蛋白水平與HH 組相比進(jìn)一步提高（P＜0.01），p62 和caspase-3 蛋白水平與HH 組相比顯著降低（P＜0.01）；CC 組LC3-II/LC3-I 比值和PCNA 蛋白水平與HH 組相比顯著降低（P＜0.01），p62 和caspase-3 蛋白水平則顯著升高（P＜0.01），見圖6。

7 各組細(xì)胞中的自噬小體

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，與N 組相比，HH 組自噬小體數(shù)量顯著增多；與HH 組相比，D 組自噬小體數(shù)量相仿，AI 組自噬小體數(shù)量增多，CC 組自噬小體數(shù)量顯著減少，見圖7。

討 論

肺動(dòng)脈高壓是一類以漸進(jìn)性的肺動(dòng)脈壓力異常增高致使右心泵血能力受損引起右心衰的一種惡性病理生理狀態(tài)。PASMCs 的增殖和遷移被認(rèn)為是導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓中肺動(dòng)脈重構(gòu)的主要因素。肺血管重構(gòu)一旦發(fā)生便無法逆轉(zhuǎn)，所以這是肺動(dòng)脈高壓治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。因此，闡明肺血管重構(gòu)的機(jī)制對HHPH和肺源性心臟病的治療具有重要意義。

Figure 6.The protein levels of LC3，p62，caspase-3 and PCNA in PASMCs were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs N group；##P＜0.01 vs HH group.圖6 Western blot檢測各組細(xì)胞中LC3、p62、caspase-3和PCNA蛋白水平

Figure 7.Transmission electron microscopic observation of PASMCs in each group（×30 000）.Arrows indicate autophagosomes.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs N group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs HH group.圖7 各組細(xì)胞的電鏡觀察

mTOR 屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶（phosphatidylinositol kinase-related kinases，PIKKs）家族成員，是存在于真核生物中保守的蛋白質(zhì)復(fù)合物，有蛋白激酶及信號傳導(dǎo)的功能［13］，包括對雷帕霉素敏感的mTORC1 和對雷帕霉素相對不敏感性的mTORC2 兩種復(fù)合體，前者參與調(diào)節(jié)自噬［4，14］。AMPK 是由α 催化亞基和β、γ 調(diào)節(jié)亞基組成的異源三聚體［15］；同時(shí)是一個(gè)重要的能量轉(zhuǎn)換器，感受ATP/AMP 比例來調(diào)節(jié)細(xì)胞能量狀態(tài)［15］；低ATP 水平狀態(tài)下（如饑餓或缺氧），AMPK 被啟動(dòng)。啟動(dòng)后的AMPK 可以通過磷酸化TSC2 抑制TSC1/TSC2 下游靶點(diǎn)mTORC1 而間接負(fù)性調(diào)控mTOR［16］，也可通過磷酸化mTOR Raptor 直接抑制［6］。有文獻(xiàn)報(bào)道，二甲雙胍在大鼠模型上可以啟動(dòng)AMPK 而發(fā)揮抗低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）的作用［21］。也有研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)apelin 通路可以啟動(dòng)AMPK，改善低氧誘導(dǎo)的APJ（putative receptor protein related to the angiotensin receptor）表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而減少PASMCs 的增殖和遷移［22-23］。另外也有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠在體模型中使用AMPK 抑制劑可以抑制HPH 的發(fā)生；在離體實(shí)驗(yàn)方面，可以通過抑制AMPKα 促進(jìn)低氧時(shí)PASMCs的死亡［24］。因此AMPK/mTOR 信號通路在肺動(dòng)脈高壓形成發(fā)展過程中的作用還未完全明確，有待更進(jìn)一步的研究。

除了基因的調(diào)控，細(xì)胞的增殖和凋亡還受多種其他因素的影響，如細(xì)胞因子、微小RNA、自噬等，這些因素互相之間也會(huì)產(chǎn)生調(diào)控，但最終表現(xiàn)為細(xì)胞的增殖和凋亡。自噬是一種用于降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的消化途徑，與細(xì)胞的存亡有著不可分割的聯(lián)系。不同的細(xì)胞微環(huán)境和調(diào)控作用［7］控制著自噬發(fā)揮“促生存”或者“促死亡”的不同作用［8-9］。有研究發(fā)現(xiàn)，野百合堿可以通過活化eIF2α 啟動(dòng)自噬，促進(jìn)PASMCs增殖和血管重構(gòu)［10］。另有研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可以以自噬依賴性的方式改善低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖［11］。自噬抑制劑氯喹可以抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，其途徑可能為通過抑制自噬途徑和BMPRII 溶酶體的降解來產(chǎn)生的［20］。凋亡誘導(dǎo)因子TIGAR 作為P53 的下游靶點(diǎn)，可以通過抑制自噬和ROS 水平抑制小鼠和人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移［21］。同時(shí)，又有研究發(fā)現(xiàn)，敲除羊的自噬基因Beclin-1 可以一定程度改善胎羊內(nèi)皮細(xì)胞血管的新生，說明自噬有助于肺動(dòng)脈高壓的形成。關(guān)于為什么在PH 的過程中沒有發(fā)生ACD（Autophagic cell death），學(xué)術(shù)界眾說紛紜，其中一種說法是：SMC發(fā)生的自噬為選擇性自噬，這種自噬既能清除受損的細(xì)胞器，為細(xì)胞提供能量，又能阻止ROS（主要來源于受損的線粒體）誘導(dǎo)的凋亡。綜合上述作用產(chǎn)生的效應(yīng)便是SMC不受機(jī)體控制不斷增生［12］。

Lee 等［25］觀察到人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在脂質(zhì)過氧化時(shí)自噬活動(dòng)增強(qiáng)。Hill 等［26］認(rèn)為自噬能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞在脂質(zhì)過氧化時(shí)的生存。研究證明，血管平滑肌細(xì)胞自噬受PI3K/Akt/mTOR、AMPK、NF-κB、MAPKs 等多種信號通路調(diào)節(jié)，且PI3K/Akt/mTOR、AMPK、NF-κB等信號通路參與了自噬調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過程［27］。所以我們猜想，調(diào)低血管平滑肌細(xì)胞自噬水平，抑制其不斷增殖，或許可以成為抑制肺血管重塑的作用靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HH 條件下，大鼠PASMCs 增殖增加，凋亡減少，自噬水平上調(diào)。AICAR 作為AMPK的激動(dòng)劑可以上調(diào)AMPK的磷酸化水平，降低mTOR 的磷酸化水平；CC 作為AMPK 的抑制劑可以抑制AMPK 的磷酸化水平，促進(jìn)mTOR 的磷酸化。此結(jié)果提示mTOR 作為AMPK 的下游分子，參與了HH 環(huán)境下PASMCs 的自噬。這 與Shaw 等［16］和 張興［17］的研究結(jié)果相同。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，HH 環(huán)境下，大鼠PASMCs中AMPK/mTOR 信號通路被啟動(dòng)，自噬水平上升。利用CC 抑制AMPK/mTOR 信號通路，可以下調(diào)PASMCs自噬水平，能夠促進(jìn)其凋亡，抑制其增殖；通過AICAR 激動(dòng)AMPK/mTOR 信號通路可以增強(qiáng)細(xì)胞活力，促進(jìn)PASMCs 的增殖，抑制其凋亡。這提示AMPK/mTOR 信號通路上調(diào)PASMCs 自噬可能是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生發(fā)展時(shí)肺血管重構(gòu)的誘因之一，通過抑制AMPK/mTOR 信號通路下調(diào)PASMCs 自噬可以抑制PASMCs 增殖，這與Zhou 等［18］的研究發(fā)現(xiàn)相類似。

綜上所述，在HH 條件下，大鼠PASMCs 增殖增加，凋亡減少，而基于AMPK/mTOR 信號通路的自噬增強(qiáng)可能參與了PASMCs的增殖。