程培培，豐明會(huì)，李 贊，2，陳譽(yù)文，呂 嶸，徐 明△

（1上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；2上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院，上海 201803）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）在全球的發(fā)病率和死亡率居高不下；心梗發(fā)生后，心臟成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）在多種刺激因素下轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFBs），分泌膠原，促進(jìn)梗死區(qū)域的疤痕修復(fù)［1-2］。這一過(guò)程使心臟的硬度和均一性發(fā)生顯著改變，血流動(dòng)力學(xué)和結(jié)構(gòu)的變化造成的應(yīng)力改變成為CFs 直接而又持續(xù)的病理性機(jī)械力學(xué)刺激［3］。MI初期經(jīng)化學(xué)性刺激轉(zhuǎn)分化而來(lái)的MFBs 分泌大量膠原蛋白又將細(xì)胞外機(jī)械應(yīng)力刺激不斷傳遞至臨近細(xì)胞中，促使更多CFs 轉(zhuǎn)分化為MFBs；而MFBs 胞內(nèi)的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）主動(dòng)收縮時(shí)能對(duì)抗這種應(yīng)力刺激，又進(jìn)一步加劇這種應(yīng)力性正反饋調(diào)節(jié)作用［4］。然而，其中的作用機(jī)制仍待探索。

整合素家族（integrins）由α 和β 兩個(gè)亞單位組成，是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)耦合的橋梁，也是機(jī)械能的轉(zhuǎn)換器，將機(jī)械信息轉(zhuǎn)化為生化信號(hào)［5］，通過(guò)激活黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）或TGF-β/Smad2/3 等信號(hào)通路影響細(xì)胞的增殖、遷移、存活等，被認(rèn)為是傳遞細(xì)胞內(nèi)外機(jī)械應(yīng)力信息的關(guān)鍵作用分子，以往關(guān)于integrins 與心臟相關(guān)的眾多研究也說(shuō)明其重要作用［6-7］。然而已明確的24 種integrin 亞型分子在CFs中的作用尚缺乏系統(tǒng)性研究。本研究基于integrin αV 這個(gè)亞型展開(kāi)，通過(guò)離體細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，以鼠尾I型膠原蛋白（collagen type I，Col I）基質(zhì)模擬正常心臟組織的機(jī)械應(yīng)力，以聚苯乙烯材料模擬病理狀態(tài)下心臟組織的機(jī)械應(yīng)力，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞行為學(xué)以及靶向基因干擾等手段，初步探索胞外應(yīng)力刺激對(duì)CFs活化的直接影響，并探索其可能作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1 周齡雄性C57BL/6 小鼠購(gòu)自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0012；胎牛血清、高糖DMEM 培養(yǎng)液、雙抗（青、鏈霉素）、D'Hanks 平衡液和0.25%trypsin 購(gòu)自Gibco；兔抗integrin αV、Akt、FAK、p-Akt 和p-FAK 抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗α-SMA 和Ki67 抗體購(gòu)自Abcam；鼠抗GAPDH和Col I抗體及兔抗III型膠原蛋白（collagen type III，Col III）抗體購(gòu)自Proteintech；3.17 g/L 的鼠尾Col I 基質(zhì)購(gòu)自BD；聚苯乙烯材質(zhì)培養(yǎng)皿購(gòu)自Corning；siRNA 和助轉(zhuǎn)染試劑siRNA-Mate購(gòu)自上海吉碼制藥有限公司；DAPI購(gòu)自Sigma。

2 方法

2.1 原代CFs 分離培養(yǎng) 1 周齡雄性C57BL/6 小鼠處死后取心臟置于4 ℃PBS中洗凈后置于1 mL無(wú)血清消化液中（含0.25% trypsin、1× HBSS 和1 mol/L HEPES），于4 ℃搖床16 h后取出，加入含血清裂解液（含15%胎牛血清、1× HBSS 和1 mol/L HEPES）充分吹打組織至完全消化后，使用200 目篩網(wǎng)過(guò)濾重懸于完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)液）中置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中貼壁1 h 后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，直至顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至85%～95%，可傳代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 構(gòu)建軟、硬基質(zhì)CFs 培養(yǎng)體系（1）使用聚苯乙烯材質(zhì)的培養(yǎng)皿為硬基質(zhì)，以1×108/L 的密度接種細(xì)胞懸液4.5 mL 于10 cm 培養(yǎng)皿中，再加入完全培養(yǎng)液3.5 mL；（2）鼠尾Col I 構(gòu)建含細(xì)胞軟基質(zhì)（1 mL的體系：鼠尾膠200μL、NaOH 36μL、10×PBS 69μL和含6.95×104個(gè)細(xì)胞的完全培養(yǎng)液695μL），取6.5 mL 混勻鋪于皿底，室溫靜置30 min 成膠后，加入完全培養(yǎng)液5 mL。上述兩種體系細(xì)胞均置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 軟、硬基質(zhì)CFs 培養(yǎng)體系傳代 待到細(xì)胞長(zhǎng)滿至傳代時(shí)，硬基質(zhì)中細(xì)胞用0.25% tryspin 于37℃消化1 min，完全培養(yǎng)液終止消化，吸管反復(fù)吹打皿底直至顯微鏡下觀察到細(xì)胞脫落后收集細(xì)胞懸液；軟基質(zhì)中細(xì)胞首先使用IV 型膠原酶液化鼠尾Col I，釋放細(xì)胞，收集于離心管中，室溫1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入1 mL 完全培養(yǎng)液吹勻后，顯微鏡下計(jì)數(shù)并算出稀釋倍數(shù)，補(bǔ)足完全培養(yǎng)液使得最終細(xì)胞懸液體系為每100μL 10 000個(gè)后用于實(shí)驗(yàn)。

2.4 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞敲減integrin αV 超凈臺(tái)中配制75 nmol/L 靶向integrin αV 的siRNA 和同濃度陰性對(duì)照（negative control，NC）siRNA，溶解于200 μL 無(wú)胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液中，同時(shí)配制助轉(zhuǎn)染試劑siRNA-Mate，室溫混勻后，靜置15 min 后加入60%細(xì)胞密度的第1 代CFs 中，轉(zhuǎn)染8 h 后更換新鮮全細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率。

2.5 細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞培養(yǎng)至60%密度時(shí)，更換為含1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液同步化處理12 h，置于倒置顯微鏡10 倍物鏡白場(chǎng)觀察拍照，通過(guò)ImageJ軟件計(jì)算其細(xì)胞面積和偽足分類數(shù)量，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2.6 CCK-8 檢測(cè)CFs 活力 取100μL 第1 代CFs 懸液等濃度接種于已構(gòu)建好軟硬基質(zhì)的96 孔培養(yǎng)板中，無(wú)細(xì)胞等量培養(yǎng)液孔為空白對(duì)照組，每組樣本均設(shè)復(fù)孔3 個(gè)，培養(yǎng)48 h 后，負(fù)壓吸引器吸去上清液，每孔加入100 μL CCK-8 檢測(cè)試劑于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，然后用避光酶標(biāo)儀于450 nm 處讀取吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.7 Ki67 免疫熒光染色檢測(cè)CFs 的增殖能力 接種細(xì)胞或含細(xì)胞的鼠尾膠于3.5 cm 玻璃皿中，待細(xì)胞增殖至60%密度時(shí)，含1%胎牛血清的培養(yǎng)液同步化12 h 后，棄上清，加入500 μL 冰甲醇室溫固定10 min 后，PBS 洗滌3 次，每次5 min；0.1%Trition X-100破膜，PBS 洗滌3 次，每次5 min；封閉液（5%牛血清白蛋白）封閉30 min 后，加入1∶100 兔抗Ki67，置于4 ℃搖床中過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次5 min；Alexa Fluor 594熒光標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗（1∶250）室溫避光孵育1 h 后，PBS 洗滌3 次，每次5 min；最后加入DAPI 室溫避光孵育20 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min；抗熒光淬滅劑封片后激光共聚焦顯微鏡采集圖像并進(jìn)行分析。

2.8 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CFs 的遷移能力 細(xì)胞于6 孔板中培養(yǎng)至85%密度，含1%胎牛血清的培養(yǎng)液同步化處理2 h后，使用10μL槍頭做均一劃痕，并在顯微鏡下拍照留取0 h原始圖，繼續(xù)培養(yǎng)36 h后再留取原始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖，最終實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用ImageJ 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.9 Western blot 檢測(cè)CFs 中α-SMA、Col I 和Col III蛋白表達(dá)水平 收取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，PBS 洗滌3 次，每孔加入65μL 細(xì)胞裂解液（1 mL 體系：940μL RIPA+20 μL PMSF+20 μL protein inhibitor+20 μL phosphatase inhibitor），冰上刮取細(xì)胞收集于1.5 mL 離心管中，裂解30 min 后于4 ℃、14 000 r/min 離心25 min，收取上清蛋白進(jìn)行BCA 方法定量。100 ℃加熱蛋白10 min 后使之變性，行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白-TBST室溫封閉1 h，稀釋相關(guān)抗體于5%牛血清白蛋白-TBST 中（鼠抗GAPDH 為1∶5 000；鼠抗Col I為1∶1 000；兔抗Col III、α-SMA、integrin αV、FAK、p-FAK、Akt 及p-Akt 均為1∶1 000），4 ℃冰箱搖床中孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min，室溫孵育Ⅱ抗1 h，曝光顯影采集圖像信息后，使用ImageJ 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.10 免疫共沉淀檢測(cè)蛋白相互作用 全收取蛋白裂解液濃度為2 g/mL，留取部分全蛋白裂解液做Input，剩余共計(jì)300 μg 加入1 g/L 的抗fibronectin 抗體2μL 或同比例稀釋的同型IgG 抗體（陰性對(duì)照），4 ℃搖床過(guò)夜，加入含50%預(yù)洗脫的protein A/G 磁珠反復(fù)清洗后吸取上清，加入20 μL 5× loading buffer，100 ℃裂解變性10 min，Western blot驗(yàn)證。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。使用非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)CFs的形態(tài)變化

倒置熒光顯微鏡白場(chǎng)成像觀察結(jié)果顯示，soft組CFs形態(tài)較小，偽足呈絲狀；與soft組相比，stiff組CFs形態(tài)顯著增大，偽足呈板狀（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

2 軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)CFs增殖能力的差異

Ki67免疫熒光染色結(jié)果顯示，與soft組相比，stiff組CFs 的Ki67 陽(yáng)性率顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2A；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與soft組相比，stiff組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.01），見(jiàn)圖2B。以上結(jié)果提示硬基質(zhì)培養(yǎng)條件顯著促進(jìn)CFs增殖。

3 軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)CFs 中膠原合成及其轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物的改變

Western blot 結(jié)果顯示，與soft 組相比，stiff 組細(xì)胞中α-SMA（肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物）、Col I 和Col III蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)圖3。這一結(jié)果提示硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下細(xì)胞中抗應(yīng)力收縮性蛋白表達(dá)顯著增加。

Figure 1.Morphological changes of cardiac fibroblasts（CFs）on soft and stiff matrix substrates.A：inverted microscopic bright-field cell image（×200）；B：statistics of filopodia and lamellipodia in the CFs（at least 10 cells in each view were measured）；C：statistics of size difference of the CFs（at least 10 cells in each view were measured）.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs soft group.圖1 軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下CFs的形態(tài)變化

Figure 2.Varied proliferation ability of cardiac fibroblasts（CFs）on soft and stiff matrix substrates.A：Ki67 immunofluorescence staining and statistics（scale bar=100 μm）；B：CCK-8 statistical results.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs soft group.圖2 軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下CFs的增殖能力的差異

Figure 3.Changes of collagen synthesis and transdifferentiation markers in the cardiac fibroblasts（CFs）on soft and stiff matrix substrates.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs soft group.圖3 軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下CFs膠原合成及其轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物的改變

4 軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)CFs 中integrin αV/FAK/Akt 信號(hào)系統(tǒng)激活的差異

Western blot 結(jié)果顯示，stiff 組和soft 組CFs 的integrin αV 蛋白表達(dá)量本底沒(méi)有顯著差異；但免疫共沉淀結(jié)果顯示，stiff 組CFs 與細(xì)胞外基質(zhì)中fibronectin 直接結(jié)合的integrin αV 大量出現(xiàn)（P＜0.05），表明軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下CFs的功能性integrin αV有差異，見(jiàn)圖4A。與此同時(shí)，stiff組CFs的p-FAK 和p-Akt蛋白水平顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖4B。這一結(jié)果提示硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下integrin αV 表達(dá)上調(diào)并伴有FAK/Akt信號(hào)的顯著激活。

5 下調(diào)integrin αV 表達(dá)對(duì)硬基質(zhì)培養(yǎng)CFs 偽足形態(tài)和遷移能力的影響

靶向integrin αV 的siRNA 轉(zhuǎn)染CFs 下調(diào)integrin αV的表達(dá)，倒置熒光顯微鏡白場(chǎng)成像觀察（圖5A）及劃痕實(shí)驗(yàn)（圖5B）結(jié)果顯示，與NC 組相比，siRNA 組CFs 板狀/絲狀偽足比例及細(xì)胞遷移能力均顯著降低（P＜0.05）。

6 下調(diào)integrin αV 表達(dá)對(duì)硬基質(zhì)培養(yǎng)CFs 膠原合成的影響

靶向integrin αV 的siRNA 轉(zhuǎn)染CFs 下調(diào)integrin αV 的表達(dá)，Western blot 結(jié)果顯示，與NC 組相比，siRNA 組CFs 中Col I 和Col III 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），α-SMA蛋白表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，見(jiàn)圖6。這一結(jié)果提示integrin αV 參與硬基質(zhì)CFs 細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白合成的直接調(diào)控。

7 下調(diào)integrin αV 表達(dá)對(duì)硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下CFs中FAK/Akt信號(hào)系統(tǒng)的同向抑制性效果

靶向integrin αV 的siRNA 轉(zhuǎn)染CFs 下調(diào)integrin αV 的表達(dá)，Western blot 結(jié)果顯示，與NC 組相比，siRNA 組CFs 中p-FAK 和p-Akt 蛋白水平顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖7。這一結(jié)果提示integrin αV 可通過(guò)integrin αV/FAK/Akt 信號(hào)激活參與硬基質(zhì)CFs 生物活性的調(diào)控。

討 論

CFs 在心臟病變過(guò)程中的修復(fù)性纖維化和間質(zhì)性纖維化中起重要作用，在此過(guò)程中，CFs 的激活受到多種物理和化學(xué)性因素的直接或間接作用，并分化為最活躍的纖維化效應(yīng)細(xì)胞—肌成纖維細(xì)胞，從而發(fā)揮其細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和對(duì)抗機(jī)械應(yīng)力的強(qiáng)大作用，以維持病變心臟的結(jié)構(gòu)和功能的完整性［3，8］。本研究以軟、硬基質(zhì)為培養(yǎng)條件，模擬體內(nèi)正常和病理狀態(tài)下心肌組織的應(yīng)力改變，并證實(shí)應(yīng)力改變是CFs轉(zhuǎn)分化為更為活躍MFBs亞型的關(guān)鍵性刺激因素，這一轉(zhuǎn)分化激活過(guò)程依賴于integrin αV/FAK/Akt 信號(hào)軸的激活。同時(shí)，此研究具有一定局限性。由于正常心臟組織和梗死區(qū)病理組織微環(huán)境較復(fù)雜，尤其是細(xì)胞以及膠原蛋白組成比例的劇烈改變，是普通聚苯乙烯材質(zhì)難以模擬的，后續(xù)研究可通過(guò)納米制造技術(shù)或膠原仿生技術(shù)構(gòu)建更為真實(shí)的模擬體內(nèi)病理和生理環(huán)境的細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境來(lái)進(jìn)行更為深入的探索［9］。

在正常心臟組織中，細(xì)胞組成和細(xì)胞外基質(zhì)的精密結(jié)構(gòu)使得其生物力學(xué)波動(dòng)最小化地影響到心臟的形態(tài)和結(jié)構(gòu)［10］。然而在病理性損傷（如心梗等）后的心臟中，除了心肌和血管的損傷外，細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白成分和比例的改變顯著影響了機(jī)械力學(xué)傳導(dǎo)特征，并且基質(zhì)中大量交聯(lián)的膠原蛋白更進(jìn)一步增加組織剛度，這些變化導(dǎo)致更強(qiáng)更頻繁的應(yīng)力刺激不斷作用于CFs，從而誘導(dǎo)其活化并轉(zhuǎn)分化為MFBs，主導(dǎo)心肌纖維化進(jìn)程［11］。以往的研究表明，正常心肌的楊氏模量為10 kPa，纖維化心臟達(dá)20～100 kPa，而體外培養(yǎng)CFs 的楊氏模量更高達(dá)GPa（1×106kPa）級(jí)別，商品化供應(yīng)的鼠尾膠可經(jīng)調(diào)整其膠原蛋白濃度制作為接近于生理狀態(tài)剛性的培養(yǎng)體系［12-14］。因此，本研究探索這兩種軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)體系的比較觀察實(shí)驗(yàn)，以明確不同剛度的培養(yǎng)環(huán)境對(duì)CFs 生物學(xué)行為的影響。與以往結(jié)果相似的是，硬基質(zhì)培養(yǎng)的CFs表面積明顯增大，伸出大量板狀偽足，同時(shí)其增殖能力和膠原合成能力也大幅提升，并表達(dá)高量MFBs標(biāo)志物α-SMA。這些結(jié)果充分證實(shí)相較于軟基質(zhì)中的靜止性CFs，硬基質(zhì)培養(yǎng)的CFs 發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)分化，成為高度活躍的MFBs，表明應(yīng)力刺激是促進(jìn)CFs活化的直接刺激因素。

Figure 4.Effects of soft and stiff matrix culture conditions on integrin αV/FAK/Akt signal pathway in cardiac fibroblasts（CFs）.A：integrin αV protein expression level；B：the levels of FAK，Akt and their phosphorylated proteins.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs soft group.圖4 軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)條件對(duì)CFs中integrin αV/FAK/Akt信號(hào)通路的影響

Figure 5.Down-regulation of integrin αV by siRNA transfection in cardiac fibroblasts（CFs）affected pseudopods and migration ability of CFs.A：the pseudopods of CFs were observed by inverted bright-field microscopy（×200）；B：original images and statistics of migration of CFs（×100）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs negative control（NC）group.圖5 siRNA轉(zhuǎn)染CFs下調(diào)integrin αV表達(dá)對(duì)CFs偽足和遷移能力的影響

Figure 6.Down-regulation of integrin αV by siRNA transfection in cardiac fibroblasts（CFs）affected secretion and transdifferentiation of CFs.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs negative control（NC）group.圖6 siRNA轉(zhuǎn)染CFs下調(diào)integrin αV表達(dá)對(duì)CFs分泌和轉(zhuǎn)分化的影響

CFs 通過(guò)其胞膜上的感受器（如integrins、離子通道、G 蛋白偶聯(lián)受體和生長(zhǎng)激素受體等）感受其局部微環(huán)境的應(yīng)力變化，并通過(guò)這些感受器下游的多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)生一系列應(yīng)對(duì)性生物學(xué)行為改變，參與組織纖維化進(jìn)程［15-16］。其中integrins 外接基質(zhì)中的fibronectin 等蛋白結(jié)構(gòu)，內(nèi)連細(xì)胞內(nèi)talin 和paxillin 等接頭蛋白，從而將外界力學(xué)改變傳導(dǎo)至肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架［17］，已知的24種integrin 分子中，CFs表 達(dá)α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α11β1/β3、αVβ1、αVβ3 和αVβ5 等亞型［6］。而在整體實(shí)驗(yàn)中的研究證實(shí)，integrin αV 與基質(zhì)纖維化密切相關(guān)，并可能通過(guò)激活潛伏型TGF-β 的直接釋放而發(fā)揮其生物學(xué)作用的［7，18］。鑒于integrins 的復(fù)雜性和多樣性以及以往的研究基礎(chǔ)，本研究主要集中于integrin αV 展開(kāi)，我們的研究發(fā)現(xiàn)軟、硬基質(zhì)培養(yǎng)CFs的integrin αV本底表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，但其功能性有顯著差異，并通過(guò)結(jié)合于細(xì)胞外基質(zhì)中的fibronectin 發(fā)揮其生物學(xué)作用，這一發(fā)現(xiàn)表明局部微環(huán)境中的剛性改變可能通過(guò)fibronectin-integrin αV 之間的分子聯(lián)系進(jìn)行由外向內(nèi)的傳遞。

同時(shí)，integrins 所傳導(dǎo)的機(jī)械信號(hào)除了直接作用于細(xì)胞骨架蛋白外，更可通過(guò)上述接頭蛋白募集具有酪氨酸蛋白激酶活性的FAK 分子，并以此為基礎(chǔ)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活作用，使細(xì)胞發(fā)生一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活和轉(zhuǎn)錄激活，從而實(shí)現(xiàn)其諸如增殖、遷移、分泌等細(xì)胞行為學(xué)和功能學(xué)的巨大轉(zhuǎn)變［5-7］。Akt以Akt1、Akt2和Akt3三種亞型存在，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)分化、誘導(dǎo)和凋亡等多種細(xì)胞因子功能，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶［19］。以往的研究表明FAK/Akt 信號(hào)通路在腫瘤中能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲［20-22］；同樣在肝臟和腎臟纖維化中，該條通路也有相關(guān)研究［23-24］。然而其在心肌纖維化中的研究仍待探索。因此本研究進(jìn)一步探索了硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下CFs 生物學(xué)行為的改變與integrin αV/FAK/Akt信號(hào)通路的關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示硬基質(zhì)培養(yǎng)的CFs 中，伴隨integrin αV 的上調(diào)表達(dá)，其下游FAK/Akt信號(hào)通路發(fā)生磷酸化激活，而通過(guò)siRNA 技術(shù)靶向下調(diào)integrin αV 則可顯著抑制FAK/Akt 信號(hào)通路的激活，與此同時(shí)，細(xì)胞表現(xiàn)為板狀偽足回縮，Col I和Col III 合成功能與遷移能力顯著下降。這些結(jié)果表明integrin αV/FAK/Akt 信號(hào)通路在應(yīng)力刺激CFs激活中的關(guān)鍵性作用。

綜上所述，應(yīng)力刺激是CFs 活化的關(guān)鍵性促進(jìn)因素之一；這種應(yīng)力刺激與integrin αV/FAK/Akt信號(hào)通路的激活直接相關(guān)；靶向integrin αV 分子的干預(yù)調(diào)節(jié)作用可顯著抑制這種應(yīng)力刺激介導(dǎo)的CFs 遷移和膠原分泌功能，從而降低其生物活性，因此針對(duì)integrin αV 分子的靶向性調(diào)節(jié)可為開(kāi)發(fā)心肌纖維化相關(guān)心臟疾病的臨床藥物提供全新的策略方向。