孫麗慧，李 倩，陳建明，姜建湖，高令梅，郭建林

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室/浙江省魚類健康與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州 313001）

澳洲淡水龍蝦學(xué)名紅螯螯蝦(Cherax quadricari?natus)，又稱澳洲小青龍，屬于甲殼綱、十足目、長(zhǎng)尾亞目、擬河蝦科、光殼蝦屬，原產(chǎn)于澳大利亞北部的熱帶地區(qū)和新幾內(nèi)亞南部的溪流中，外形與克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)相似[1]，是世界名貴經(jīng)濟(jì)螯蝦類之一[2]。其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，可食率高，隨著人們生活水平的提高，該蝦產(chǎn)業(yè)規(guī)模也得以迅速擴(kuò)大，市場(chǎng)前景十分廣闊[3]。

澳洲淡水龍蝦為一年多次產(chǎn)卵類型，目前繁育主要采用親本自然孵化方式。由于其懷卵量較少，而且受精卵發(fā)育同步性較差，導(dǎo)致苗種規(guī)格差異大，出苗率不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。受精卵離體孵化技術(shù)是一種新型的生產(chǎn)蝦蟹類幼苗的技術(shù)，該技術(shù)主要解決蝦蟹類抱卵孵化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，孵化過(guò)程中存在水質(zhì)條件不穩(wěn)定等因素易導(dǎo)致出苗率偏低的問(wèn)題[4]。如克氏原螯蝦受精卵在卵Ⅱ期進(jìn)行離體孵化，其孵化率可達(dá)87.25%[5]；日本米蝦(Caridina japonica)胚胎發(fā)育至膜內(nèi)溞狀幼體期離體孵化可獲得80.7%的孵化率[6]；波紋龍蝦(Panulirus homarus)心跳期胚胎離體孵化率為80.0%[7]。近年來(lái)，有報(bào)道稱可采用ZISS孵化器(圖1)、Hemputin孵化設(shè)備等進(jìn)行澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化生產(chǎn)幼苗[8-13]，但關(guān)于其適宜的離體孵化條件研究較少[4]。本研究擬通過(guò)研究水溫、流量、發(fā)育時(shí)期和孵化密度對(duì)澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化的影響，以確定澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化的適宜條件，完善高效的澳洲淡水龍蝦離體孵化技術(shù)，為進(jìn)一步提高澳洲淡水龍蝦蝦苗規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用的澳洲淡水龍蝦受精卵均來(lái)自體質(zhì)健康的抱卵蝦，飼養(yǎng)于浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合試驗(yàn)基地。水溫、流量和孵化密度試驗(yàn)采用復(fù)眼色素形成初期蝦卵（產(chǎn)卵后20 d）（圖2），不同發(fā)育時(shí)期受精卵采用前無(wú)節(jié)幼體期（產(chǎn)卵后15 d）（圖3）、復(fù)眼色素形成初期和孵化準(zhǔn)備期（產(chǎn)卵后30 d）（圖4）受精卵。

圖2 澳洲淡水龍蝦復(fù)眼色素形成初期受精卵Figure 2 Fertilized egg at the early stage of compound eye pigment formation

圖3 澳洲淡水龍蝦前無(wú)節(jié)幼體時(shí)期受精卵Figure 3 Fertilized eggs at tthe egg-nauplius stage

圖4 澳洲淡水龍蝦孵化準(zhǔn)備期受精卵Figure 4 Fertilized eggs at the prepare-hatching stage

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水溫對(duì)澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率和有效積溫的影響

用密齒梳輕柔地剝下處于澳洲淡水龍蝦7對(duì)附肢間的復(fù)眼色素形成初期受精卵，采用ZISS孵化器（由容量為500 mL，內(nèi)徑80 mm，高250 mm的孵化桶、過(guò)濾海綿、硅膠管、橡膠、空氣控制閥、氣石和不銹鋼網(wǎng)片等組成。通過(guò)反氣舉方式，使受精卵在孵化桶內(nèi)均勻而輕柔地翻動(dòng)），分別于水溫24℃、26℃、28℃、30℃和32℃水體中進(jìn)行離體孵化，水溫由控溫棒控制，上下波動(dòng)不超過(guò)0.3℃，每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)孵化桶中放入200粒澳洲淡水龍蝦復(fù)眼色素形成初期受精卵。為避免水溫變化速度太快影響受精卵正常發(fā)育和試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，以受精卵剝離水溫為基點(diǎn)，采取逐漸升降溫的方法，使各試驗(yàn)組水溫較平緩達(dá)到試驗(yàn)水溫要求，以每10 min升高或降低2℃的速度達(dá)到預(yù)定的溫度后恒溫孵化[14-15]。試驗(yàn)期間孵化器中水質(zhì)指標(biāo)為：氨氮≤0.2 mg/L，亞硝酸氮≤0.1 mg/L，溶解氧≤5 mg/L。

試驗(yàn)過(guò)程中記錄孵化時(shí)間，孵化率以受精卵全部孵化為準(zhǔn)[16]，至仔蝦完全孵出，統(tǒng)計(jì)仔蝦個(gè)數(shù)，計(jì)算各孵化器孵化率。孵化率、平均有效積溫及各試驗(yàn)溫度下有效積溫通過(guò)以下公式計(jì)算[17-18]：

其中，Hr為澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率(%)；Ns為孵出仔蝦個(gè)數(shù)；Ne為放入受精卵個(gè)數(shù)；K為澳洲淡水龍蝦受精卵孵化的有效積溫(℃·h)；n為數(shù)據(jù)組數(shù)；v為受精卵發(fā)育速率，即發(fā)育時(shí)間的倒數(shù)(t-1)；T為發(fā)育期間平均水溫(℃)；C為澳洲淡水龍蝦受精卵發(fā)育的生物學(xué)零度(℃)；t為復(fù)眼色素形成初期受精卵至仔蝦孵出所需時(shí)間(h)。

1.2.2 流量對(duì)澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率的影響

采用方形塑料離體孵化裝置（參照蘭志祥[19]設(shè)計(jì)自主改造制作）（長(zhǎng)×寬×高為15 cm×9.7 cm×12 cm，保持水深（3.0±0.5）cm左右，體積約0.4 L）（圖5），分別在流量2 L/min、5 L/min和8 L/min條件下對(duì)澳洲淡水龍蝦復(fù)眼色素形成初期受精卵進(jìn)行離體孵化，每個(gè)流量設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放入400粒復(fù)眼色素形成初期受精卵。試驗(yàn)期間保持水溫（28±0.5）℃，其他水質(zhì)指標(biāo)及孵化率計(jì)算方法同1.2.1。

圖5 方形塑料孵化裝置Figure 5 Square plastic incubator

1.2.3 不同發(fā)育時(shí)期對(duì)澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率的影響

選取澳洲淡水龍蝦前無(wú)節(jié)幼體期、復(fù)眼色素形成初期和孵化準(zhǔn)備期3個(gè)時(shí)期受精卵各1 200粒，隨機(jī)放入9個(gè)方形孵化槽中，每個(gè)孵化槽放入400粒受精卵，每個(gè)發(fā)育時(shí)期設(shè)3個(gè)平行。試驗(yàn)期間水質(zhì)指標(biāo)及孵化率計(jì)算方法同1.2.2。

1.2.4 孵化密度對(duì)澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率的影響

選取3 600粒澳洲淡水龍蝦復(fù)眼色素形成初期受精卵，分別按照500粒/L、1 000粒/L和1 500粒/L的孵化密度放入方形塑料孵化裝置中（長(zhǎng)×寬×高為15 cm×9.7 cm×12 cm，保持水深（3±0.5）cm左右，體積約0.4 L，即孵化槽分別放入200粒、400粒和600粒受精卵），每個(gè)孵化密度設(shè)3個(gè)平行，試驗(yàn)期間水質(zhì)指標(biāo)及孵化率計(jì)算方法同1.2.2。

2 數(shù)據(jù)處理方法

將所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)處理得到的數(shù)據(jù)用單因素的ANOVA軟件分析，當(dāng)處理組之間有顯著差異（P<0.05）時(shí)，用Duncan檢驗(yàn)比較不同處理間的平均值，試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)（mean）表示。

3 結(jié)果

3.1 不同水溫澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率和有效積溫

由表1可知，水溫28℃時(shí)澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率顯著高于其他4組（P<0.05），水溫26℃和30℃時(shí)澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率則顯著高于24℃和32℃（P<0.05）。由圖6可見，隨著水溫升高，受精卵孵化時(shí)間減少。由式(2)和(3)計(jì)算得到澳洲淡水龍蝦復(fù)眼色素形成初期受精卵發(fā)育至初孵仔蝦的平均有效積溫為9 375℃·h。各溫度下受精卵發(fā)育歷時(shí)和有效積溫如表1所示。

圖6 水溫對(duì)澳洲淡水龍蝦受精卵發(fā)育時(shí)間的影響Figure 6 Effects of water temperature on development time of fertilized eggs

表1 不同水溫澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率和有效積溫Table 1 In vitro hatching rate and accumulative temperature of fertilized eggs of Australian freshwater lobster at different water temperatures

3.2 不同流量、發(fā)育時(shí)期以及孵化密度澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率

如表2所示，不同流量下澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率依次為5 L/min>2 L/min>8 L/min（P<0.05）；由表3可見，澳洲淡水龍蝦復(fù)眼色素形成初期和孵化準(zhǔn)備期受精卵孵化率顯著高于前無(wú)節(jié)幼體期受精卵（P<0.05），而復(fù)眼色素形成初期和孵化準(zhǔn)備期受精卵孵化率差異不顯著（P<0.05）；如表4所示，澳洲淡水龍蝦受精卵孵化密度為500粒/L和1 000粒/L時(shí)孵化率顯著高于1 500粒/L（P<0.05），但1 000粒/L和1 500粒/L的孵化密度下，澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率差異不顯著（P>0.05）。

表2 不同流量澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率Table 2 Effects of waterflow on in vitro hatching rate of fertilized eggs of Australian freshwater crayfish

表3 不同發(fā)育時(shí)期澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率Table 3 Effects of developmental stages on in vitro hatching rate of fertilized eggs of Australian freshwater crayfish

表4 不同孵化密度澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率Table 4 Effects of hatching density on in vitro hatching rate of fertilized eggs of Australian freshwater crayfish

4 討論與結(jié)論

4.1 不同溫度對(duì)澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率和有效積溫的影響

目前，有關(guān)水產(chǎn)動(dòng)物離體孵化方面的研究主要集中在有抱卵習(xí)性的蝦蟹類[6-7,20-24]。水溫是水產(chǎn)動(dòng)物胚胎離體發(fā)育的重要影響因子之一[18]。本試驗(yàn)中，澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率受溫度影響顯著，水溫在24℃和32℃時(shí)孵化率顯著降低，在28℃時(shí)孵化率最高，達(dá)84.04%，與C.M.Loughlin等[25]研究得出的澳洲淡水龍蝦親本抱卵孵化最佳孵化水溫27℃～29℃和李進(jìn)[26]研究得出的澳洲淡水龍蝦親本抱卵孵化最佳孵化水溫28℃相一致。當(dāng)水溫較低時(shí)，澳洲淡水龍蝦受精卵孵化期延長(zhǎng)，在孵化過(guò)程中往往容易感染水霉而導(dǎo)致受精卵死亡[27]，而過(guò)高的水溫則容易致使受精卵發(fā)育受到抑制，出現(xiàn)畸變甚至死亡，進(jìn)而造成孵化率降低[28]。李進(jìn)等[26]在對(duì)澳洲淡水龍蝦抱卵孵化研究中發(fā)現(xiàn)，隨著水溫從22℃上升到32℃，孵化時(shí)間從45 d縮短至20 d，本研究中，隨著水溫升高，澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化時(shí)間減少，這可能是由于在適當(dāng)?shù)臏囟确秶鷥?nèi)，溫度提高可以提高孵化酶活性，從而縮短孵化時(shí)間[29-32]，故在不影響孵化率的情況下，可適當(dāng)提高孵化溫度，縮短孵化時(shí)間。

生物的發(fā)育過(guò)程需要溫度和時(shí)間的結(jié)合，即需要一定的總熱量才能完成某一階段的發(fā)育，這就是有效積溫法則，此法則是溫度與發(fā)育關(guān)系的直觀體現(xiàn)[33]，有效積溫是甲殼動(dòng)物的重要生物學(xué)指標(biāo)，不僅可以衡量水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)環(huán)境溫度變化的響應(yīng)，而且可為水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物人工育苗的溫度調(diào)控、發(fā)育歷期提供重要參考[34]。水生變溫動(dòng)物的有效積溫研究通常根據(jù)對(duì)象、環(huán)境、用途的不同，設(shè)計(jì)研究周期、范圍并選擇生活史中單獨(dú)或者相鄰階段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[34]，如王璞等[34]研究了中華絨螯蟹(Erio?cheir sinensis)Ⅰ期溞狀幼體至大眼幼體發(fā)育階段，夏長(zhǎng)革等[35]研究了光棘球海膽(Strongylocentrotus nudus)的受精卵至棱柱幼體發(fā)育階段，胡宏輝等[36]研究了體外培養(yǎng)條件下三角帆蚌(Hyriopsis cumin?gii)受精卵至成熟鉤介幼蟲發(fā)育階段，薛素燕等[37]研究了中華原鉤蝦(Eogammarus possjeticus)受精卵至初孵幼體發(fā)育階段。本試驗(yàn)則研究了澳洲淡水龍蝦復(fù)眼色素形成初期受精卵至初孵仔蝦的發(fā)育階段，結(jié)果顯示此發(fā)育階段的有效積溫為9 375℃·h。不同種類水產(chǎn)動(dòng)物胚胎發(fā)育的有效積溫不盡相同，如絨螯近方蟹(Hemigrapsus penicillatus)在5～9月高溫季節(jié)繁殖旺盛，其溞狀幼體發(fā)育有效積溫為226.35℃·d[38]，斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodonFabricius)溞狀幼體發(fā)育的有效積溫為1 665.55℃·h[39]，中華原鉤蝦胚胎發(fā)育的有效積溫為137.30℃·d[37]，光棘球海膽受精卵發(fā)育的有效積溫為482℃·h[35]。以上水產(chǎn)動(dòng)物胚胎發(fā)育的有效積溫差異的原因除物種不同外，還與胚胎發(fā)育所處的環(huán)境溫度、階段及生理狀態(tài)有關(guān)[40]。也有學(xué)者認(rèn)為，有效積溫法則僅考慮到溫度這一單項(xiàng)作為主要影響因子，忽略其他生態(tài)因子的共同作用，故存在一定的局限性[17]。因此，可根據(jù)該法則預(yù)測(cè)不同溫度下澳洲淡水龍蝦受精卵某一階段發(fā)育歷期，而不能將胚胎發(fā)育的有效積溫當(dāng)成絕對(duì)的唯一指標(biāo)。

4.2 不同流量、發(fā)育時(shí)期以及孵化密度對(duì)澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率的影響

目前，有關(guān)流量對(duì)蝦類受精卵孵化影響方面的研究鮮見報(bào)道，可能與自然條件下蝦類為抱卵孵化，受流量影響較小有關(guān)。水流量、流速對(duì)胚胎發(fā)育影響的研究主要集中在魚類。已有研究表明，靜水孵化時(shí)，胚胎的死亡率和畸形率遠(yuǎn)高于流水孵化[41-42]，原因可能是流水孵化對(duì)受精卵的刺激有利于提高胚胎發(fā)育的質(zhì)量[43]。另外，相對(duì)于靜水孵化，流水可以提高水體中溶解氧含量，對(duì)受精卵發(fā)育起到促進(jìn)作用[44]。李卿青等[44]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)水流量從0 L/h增加到70 L/h時(shí)，中華倒刺鲃(Spinibarbus sinensis)胚胎孵化率從28.0%提高到88.0%，而本研究中，澳洲淡水龍蝦受精卵隨水流量從2 L/min增加到5 L/min時(shí)，離體孵化率則從65.58%提高到85.00%，繼續(xù)增加水流量，受精卵離體孵化率顯著降低，可見，流量過(guò)低或過(guò)高都不利于澳洲淡水龍蝦受精卵孵化。流量過(guò)低容易導(dǎo)致受精卵交疊在一起，從而引起部分受精卵缺氧，最終導(dǎo)致胚胎死亡。而流量過(guò)高則容易造成受精卵翻滾激烈，增加受精卵之間、受精卵與孵化槽內(nèi)壁之間的碰撞，從而導(dǎo)致受精卵卵膜損傷而感染霉菌，造成孵化率降低。

陳文虎等[45]在研究河蟹(Eriocheir sinensis)離體卵發(fā)育不同時(shí)期出苗率時(shí)發(fā)現(xiàn)，眼點(diǎn)期及眼點(diǎn)前期之前出苗率不高，眼點(diǎn)期之后，心律在150次/min左右是孵化布幼的最佳時(shí)期。王吉橋等[21]則發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹胚胎發(fā)育至原腸期后，即眼點(diǎn)期，再進(jìn)行離體孵化，其離體的胚胎離體孵化率可達(dá)68.95%，極顯著高于卵裂期的48.53%和囊胚期的47.84%。本研究也表明，澳洲淡水龍蝦受精卵發(fā)育至孵化準(zhǔn)備期離體孵化率較高，達(dá)89.58%，但與復(fù)眼色素形成期離體孵化率無(wú)顯著性差異，前無(wú)節(jié)幼體期受精卵進(jìn)離體孵化率較低，僅為73.74%，原因可能是隨著離體孵化時(shí)間延長(zhǎng)，增加受精卵感染霉菌的幾率，易導(dǎo)致受精卵死亡，造成孵化率偏低。孵化準(zhǔn)備期受精卵離體孵化率高可能是此階段受精卵即將破膜而出成為初孵仔蝦，孵化過(guò)程較短，大大減少感染霉菌幾率，另外，受精卵發(fā)育至孵化準(zhǔn)備期形態(tài)已初具仔蝦形態(tài)，有明顯外殼，起到對(duì)受精卵的保護(hù)作用，可減少因碰撞或感染而導(dǎo)致的受精卵死亡。

孵化密度是影響水產(chǎn)動(dòng)物胚胎發(fā)育的重要因素之一[46-48]。當(dāng)孵化密度過(guò)大，水中氧氣不足易導(dǎo)致胚胎發(fā)育受阻、孵化率下降等現(xiàn)象。彭瑞冰等[48]研究表明，隨著孵化密度增加，擬目烏賊(Sepia lyci?das)胚胎的孵化率下降，孵化密度為3～9個(gè)/L，孵化率可達(dá)95.57%～96.67%，適宜擬目烏賊胚胎孵化；李卿青等[44]研究發(fā)現(xiàn)中華倒刺鲃的胚胎孵化率從孵化密度30粒/L增加到60粒/L時(shí)并無(wú)顯著性變化，當(dāng)繼續(xù)增加孵化密度，孵化率顯著降低；本研究中得出與以上研究類似的結(jié)果，即隨著孵化密度升高，澳洲淡水龍蝦受精卵離體孵化率顯著降低，其原因一是過(guò)大的孵化密度會(huì)導(dǎo)致胚胎在發(fā)育過(guò)程中缺氧，二是孵化密度過(guò)高時(shí)，胚胎新陳代謝產(chǎn)生大量二氧化碳，使得水體pH低于孵化密度較小的水體，水體pH偏低會(huì)影響胚胎對(duì)鈣離子的吸收，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形[49]，同時(shí)，水體pH降低也可能是造畸形率和死亡率升高的重要原因[50]，再者，澳洲淡水龍蝦受精卵為沉性卵，孵化密度過(guò)高，容易導(dǎo)致蝦卵堆積，使得內(nèi)部受精卵缺氧或滋生霉菌，從而降低受精卵孵化率。

5 小結(jié)

綜上所述，考慮到澳洲淡水龍蝦受精卵孵化率和經(jīng)濟(jì)效益，其適宜離體孵化條件應(yīng)為：水溫28℃±0.5℃、流量5 L/min、孵化密度1 000粒/L以及孵化期為復(fù)眼色素形成初期。