姚志蘭，程李杰，沈留紅，曹隨忠，王紹熙，傅宏慶

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室/奶牛疾病研究中心，成都 611130；3.重慶市農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，重慶 401121）

夏季熱應(yīng)激期間，奶牛受高溫高濕環(huán)境影響，生理生化狀態(tài)易發(fā)生改變[1-2]，探究熱應(yīng)激對奶牛血液生化指標(biāo)的影響，可為改善熱應(yīng)激奶牛飼養(yǎng)管理和疾病預(yù)防提供理論數(shù)據(jù)支持。奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)，目前多使用溫濕指數(shù)（temperature-humidity index，THI）評估其熱應(yīng)激狀態(tài)，THI<71為熱舒適區(qū)，72～79為輕度熱應(yīng)激區(qū)間，80～90為中度熱應(yīng)激區(qū)間，THI>90為重度熱應(yīng)激區(qū)間[3]。熱應(yīng)激導(dǎo)致奶牛機體新陳代謝活動增強，代謝穩(wěn)態(tài)被打破，自由基的氧化和抗氧化失去平衡，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]，體內(nèi)應(yīng)激金指標(biāo)——熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、皮質(zhì)醇（cortisol，Cor）濃度改變，抗氧化酶系統(tǒng)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）等活性與抗氧化非酶系統(tǒng)維生素C、E和類胡蘿卜素等物質(zhì)含量發(fā)生改變[5-6]，過氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（total anti?oxidant capacity，T-AOC）等發(fā)生變化[7-8]。同時為應(yīng)對因采食量下降和維持產(chǎn)奶量、機體體熱平衡導(dǎo)致的能量負(fù)平衡狀態(tài)，奶牛加強脂肪動員和蛋白質(zhì)分解為機體供能[9]，當(dāng)機體代謝強度超過肝臟正常功能范圍時，將引發(fā)機體損傷，使脂代謝相關(guān)指標(biāo)游離脂肪酸（non-esterified fatty acid,NEFA）、急性時相反應(yīng)蛋白結(jié)合珠蛋白（haptoglobin，HP）和肝損傷特異性指標(biāo)谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydroge?nase，GDH）等健康相關(guān)指標(biāo)發(fā)生改變，影響動物正常代謝與免疫功能，使脂肪肝、酮病等代謝性疾病和乳房炎等潛在發(fā)病率上升[10-11]。目前關(guān)于熱應(yīng)激期對不同泌乳階段奶牛血液生化指標(biāo)的影響仍不清楚，而監(jiān)測熱應(yīng)激期奶牛生化指標(biāo)的改變有助于及時掌握機體新陳代謝活動、組織器官生理機能變化和奶牛健康狀況，為改善日常管理、提高奶牛福利和養(yǎng)殖收益提供可靠理論支持。本試驗旨在探究熱應(yīng)激期與非熱應(yīng)激期不同泌乳階段奶牛血清應(yīng)激指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)和肝功能相關(guān)指標(biāo)等的變化，了解熱應(yīng)激期奶牛血液生化指標(biāo)變化趨勢，為針對性改進夏季防暑降溫策略，改善奶牛福利和提高養(yǎng)殖收益提供可行的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗所有程序均嚴(yán)格按照科技部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》（第398號，2006年）執(zhí)行，并遵照《四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物福利》（2013—028號）照料、使用試驗?zāi)膛?。試驗地點為四川省資陽市某規(guī)模化奶牛場，屬亞熱帶季風(fēng)氣候。牛場熱應(yīng)激期共有泌乳牛856頭，非熱應(yīng)激期共有泌乳牛896頭。熱應(yīng)激期試驗時間為2018年7—8月，非熱應(yīng)激期試驗時間為2018年11—12月。

1.2 試驗動物與管理方案

按泌乳天數(shù)將全群泌乳牛分為新產(chǎn)（0～21 d）、泌乳前期（22～120 d）、泌乳中期（121～200 d）、泌乳后期（201～305 d）4個期，每次采集數(shù)據(jù)時在各期泌乳牛中隨機選擇體況相近、同一泌乳階段、泌乳天數(shù)相近的健康經(jīng)產(chǎn)奶牛（2～4胎次）10頭，共計80頭作為試驗?zāi)膛?。試驗?zāi)膛釕?yīng)激期和非熱應(yīng)激期管理方案和飼養(yǎng)方法按牧場日常運行方案進行管理，不進行其他人工干預(yù)。

1.3 試驗方法

1.3.1 溫濕指數(shù)的測定

在牛舍飼喂槽的前、中、后3個位置離地2.5 m安裝電子溫濕度計（博洋儀器，鄭州），每日08:00、14:00、20:00測定溫濕度數(shù)據(jù)，計算溫濕指數(shù)（temperature-humidity index，THI）。取3個時間點THI平均值作為試驗值，THI計算公式為:THI=（1.8×Td+32）-（0.55-0.0055×RH）×（1.8×Td-26）[12]，其中Td為攝氏溫度（℃），RH為相對濕度（%）。

1.3.2 直腸溫度的測定

每天08:00、15:00、20:00使用獸用電子溫度計（尚農(nóng)科技，綿陽）測定各階段泌乳牛直腸溫度，連續(xù)監(jiān)測20 d，分別取各泌乳階段奶牛測定結(jié)果的平均值作為試驗值。熱應(yīng)激和非熱應(yīng)激期采取相同測定方案。

1.3.3 血樣采集與血清制備

隨機選取熱應(yīng)激中期任一高溫高濕天氣和非熱應(yīng)激期任意一天，在16:00采集各試驗?zāi)膛Ｎ哺o脈血，6 000 r/min，離心5 min，分離血清，-20℃保存待檢。

1.3.4 血清生化指標(biāo)的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定HSP70、Cor、GDH和HPT；采用ABTS快速法測定T-AOC；采用WST-1法測定SOD；采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA；采用微板法測定NEFA。以上指標(biāo)采用試劑盒并按照試劑盒說明書在Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀（Thermo，美國）上測定，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件進行成對樣本T檢驗，所有統(tǒng)計結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean±SD）的形式表示。

2 分析與結(jié)果

2.1 各泌乳階段奶牛直腸溫度變化

試驗期間不同泌乳階段奶牛直腸溫度及舍內(nèi)溫濕指數(shù)如表1、表2所示。熱應(yīng)激期各泌乳階段奶牛直腸溫度較非熱應(yīng)激均具有極顯著差異（P<0.01），分別升高0.9、0.7、0.6和0.5 ℃。熱應(yīng)激期泌乳中、后期奶牛及直腸溫度無顯著性差異（P>0.05），其余各時期間均具有顯著差異（P<0.05），非熱應(yīng)激期各泌乳階段奶牛直腸溫度無顯著性差異（P>0.05）。熱應(yīng)激期牛舍內(nèi)溫濕指數(shù)處于中度熱應(yīng)激區(qū)間。

表1 各泌乳階段奶牛直腸溫度變化Table 1 Rectal temperature of cows at different lactation stages during test period

表2 試驗期間牛舍溫濕指數(shù)Table 2 Humidity-temperature index of cowshed during test period

2.2 熱應(yīng)激對不同泌乳階段奶牛血清應(yīng)激指標(biāo)的影響

熱應(yīng)激期與非熱應(yīng)激期不同泌乳階段奶牛血清應(yīng)激指標(biāo)如表3所示。與非熱應(yīng)激期比較，熱應(yīng)激期各泌乳階段奶牛血清應(yīng)激指標(biāo)HSP70蛋白均出現(xiàn)極顯著上升（P<0.01），以新產(chǎn)奶牛最高，且與泌乳后期奶牛間具有顯著差異（P<0.05）。熱應(yīng)激期各泌乳階段奶牛Cor均極顯著上升（P<0.01），以泌乳中期奶牛最高，新產(chǎn)、泌乳前期奶牛與泌乳中、后期奶牛間具有顯著性差異（P<0.05），非熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛、泌乳前期、中期奶牛與泌乳后期奶牛間具有顯著差異（P<0.05）。

表3 不同泌乳階段奶牛血清應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的差異Table 3 The difference of serum stress indexs in cows at different lactation stages

2.3 熱應(yīng)激對不同泌乳階段奶牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

熱應(yīng)激期和非熱應(yīng)激期不同泌乳階段奶牛血清抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果如表4所示。與非熱應(yīng)激期比較，熱應(yīng)激期各泌乳階段奶牛間血清SOD活性極顯著升高（P<0.01），而熱應(yīng)激期各泌乳階段奶牛間無顯著性差異（P>0.05）；非熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛與泌乳前期、中期、后期奶牛間具有顯著性差異（P<0.05）。熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛、泌乳前期奶牛血清T-AOC水平極顯著降低（P<0.01），泌乳中期奶牛顯著降低（P<0.05），泌乳后期奶牛無顯著性差異（P>0.05），新產(chǎn)奶牛、泌乳前期、中期奶牛與泌乳后期奶牛間具有顯著差異（P<0.05），非熱應(yīng)激期泌乳后期與新產(chǎn)奶牛、泌乳前期、中期奶牛有顯著差異（P<0.05）。熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛血清MDA濃度顯著升高（P<0.05），泌乳前期、中期奶牛極顯著升高（P<0.01），泌乳后期奶牛間無顯著性差異（P>0.05），新產(chǎn)奶牛與泌乳前期、中期奶牛間具有顯著性差異（P<0.05），與泌乳后期奶牛間無差異性，非熱應(yīng)激期各泌乳階段奶牛間差異不顯著（P>0.05）。

表4 不同泌乳階段奶牛血清抗氧化相關(guān)指標(biāo)的差異Table 4 The difference of serum antioxidant indexs of cows at different lactation stages

2.4 熱應(yīng)激對不同泌乳階段奶牛肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響

熱應(yīng)激期和非熱應(yīng)激期不同泌乳階段奶牛肝功能相關(guān)指標(biāo)如表5所示。熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛、泌乳前期奶牛血清NEFA濃度較非熱應(yīng)激期極顯著上升（P<0.01），泌乳中期奶牛NEFA濃度顯著上升（P<0.05），泌乳后期奶牛間無顯著性差異（P>0.05），熱應(yīng)激期泌乳中期、后期奶牛間無顯著性差異（P>0.05）；熱應(yīng)激期各期泌乳牛之間血清GDH濃度極顯著升高（P<0.01），組內(nèi)無顯著性差異，非熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛、泌乳前期奶牛與泌乳中期、后期奶牛間差異顯著（P<0.05）；熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛、泌乳前期和中期奶牛血清HP濃度極顯著升高（P<0.01），泌乳后期奶牛無顯著性差異（P>0.05），新產(chǎn)奶牛、泌乳前期、中期奶牛與泌乳后期奶牛間具有顯著性差異（P<0.05），非熱應(yīng)激期無組內(nèi)差異（P>0.05）。

表5 不同泌乳階段奶牛肝功能相關(guān)指標(biāo)的差異Table 5 The difference of liver function indexes of cows at different lactation stages

3 討論與結(jié)論

3.1 熱應(yīng)激對不同泌乳階段奶牛血清應(yīng)激指標(biāo)的影響

HSP70是分子量約70 kD的熱休克蛋白，正常情況下位于胞漿內(nèi)，表達水平較低，而在高溫或各種有害應(yīng)激狀態(tài)下，HSP70合成速度顯著增加，一般數(shù)分鐘內(nèi)即可達到最高水平，提高生物體抗應(yīng)激能力，從而保護機體或細(xì)胞的功能。本試驗中熱應(yīng)激期各泌乳階段奶牛HSP70均極顯著高于非熱應(yīng)激期（P<0.01），與de Fátima Bretanha Rocha等[13]研究結(jié)果一致。另外，本試驗中HSP70新產(chǎn)奶牛最高，表明新產(chǎn)奶牛受熱應(yīng)激侵害程度最為嚴(yán)重。泌乳前期、中期奶牛血清HSP70含量較泌乳后期奶牛高，表明泌乳前期、中期奶牛受熱應(yīng)激侵害程度高于泌乳后期奶牛。

Cor作為糖皮質(zhì)激素之一，對體內(nèi)糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝均有調(diào)節(jié)作用，可促進糖原異生及蛋白質(zhì)和脂肪的分解，增強機體代謝能力，加速分解脂肪、蛋白質(zhì)、糖類應(yīng)對應(yīng)激刺激，被視為機體應(yīng)激金指標(biāo)[14]。本試驗中熱應(yīng)激期各泌乳階段血清Cor濃度極顯著上升（P<0.01），表明各期奶牛均受到熱應(yīng)激影響，機體代謝活動增強，與宋代軍等[5]研究結(jié)果一致。泌乳前期、中期奶牛較泌乳后期奶牛血清Cor濃度上升幅度更大，表明泌乳前期、中期奶牛受熱應(yīng)激影響更大，其能量需求更高，代謝活動更強。

3.2 熱應(yīng)激對不同泌乳階段奶牛血清抗氧化能力的影響

動物處于熱應(yīng)激狀態(tài)時，機體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，引發(fā)氧化應(yīng)激，造成機體氧化損傷[15]。SOD活性可反映機體清除氧自由基的能力，本試驗中，熱應(yīng)激期不同泌乳階段奶牛SOD活性極顯著上升（P<0.01），與王換換等[16]和王菲等[17]對熱應(yīng)激奶牛、小鼠肝臟SOD指標(biāo)的研究結(jié)果相一致，其原因可能是機體在高溫脅迫下出現(xiàn)代償反應(yīng)。兩個試驗時期中各時期新產(chǎn)奶牛血清SOD和T-AOC水平最低，這可能是導(dǎo)致熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛產(chǎn)后疾病多發(fā)的重要原因之一。

T-AOC是反映機體抗氧化機能的綜合性指標(biāo)，MDA為機體過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，高強度的代謝與應(yīng)激都會導(dǎo)致其含量增加，可間接反映機體脂質(zhì)過氧化程度[18-19]。本試驗中熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛、泌乳前期、中期奶牛T-AOC較非熱應(yīng)激期出現(xiàn)不同程度降低，且兩試驗時期中各泌乳階段奶牛和泌乳后期奶牛間均出現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），以新產(chǎn)奶牛TAOC最低，泌乳后期奶牛最高。新產(chǎn)奶牛、泌乳前期、中期奶牛MDA含量較非熱應(yīng)激期不同程度升高，表明以上泌乳階段奶牛脂質(zhì)過氧化程度加劇，機體總抗氧化能力下降，其中以泌乳前期、中期奶牛脂質(zhì)過氧化程度最高，泌乳后期奶牛較低。I.Politis等[20]的研究表明氧化應(yīng)激水平與奶牛乳房炎發(fā)病率呈正相關(guān)，本試驗結(jié)果提示不同泌乳階段奶牛血清抗氧化指標(biāo)的變化可能是造成新產(chǎn)奶牛與泌乳前期、中期奶牛熱應(yīng)激期疾病多發(fā)的原因之一。

3.3 熱應(yīng)激對不同泌乳階段奶牛肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響

熱應(yīng)激期奶牛采食量下降，機體處于能量負(fù)平衡狀態(tài)，為滿足能量需求脂肪動員提高，導(dǎo)致NEFA在肝臟中大量儲存、轉(zhuǎn)化，甘油三酯、酮體等代謝產(chǎn)物大量積聚，最終導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生酮病、脂肪肝等代謝性疾病[21]。本試驗中不同泌乳階段奶牛熱應(yīng)激期血清NEFA濃度較非熱應(yīng)激期極顯著提高（P<0.01），表明泌乳牛體內(nèi)脂肪動員程度極顯著提高，新產(chǎn)、泌乳前期奶牛血清NEFA濃度更高，較泌乳中期、后期奶牛呈現(xiàn)顯著性差異（P<0.05），說明新產(chǎn)、泌乳前期奶牛能量需求更大，脂肪動員更多，由此導(dǎo)致的潛在機體損傷也更加嚴(yán)重。

GDH為細(xì)胞線粒體酶，血清GDH濃度可較特異地反映肝細(xì)胞損傷及損傷程度，可作為診斷肝損傷重要指標(biāo)[21-22]。本試驗中，各泌乳階段奶牛熱應(yīng)激期血清GDH濃度較非熱應(yīng)激期極顯著升高，血清GDH濃度以新產(chǎn)奶牛、泌乳前期、中期和后期奶牛為序依次降低，無組內(nèi)差異性（P>0.05），提示各泌乳階段奶牛均存在一定程度的肝損傷，以新產(chǎn)奶牛最為嚴(yán)重，泌乳前期、中期奶牛肝損傷程度高于泌乳后期奶牛，機體健康狀態(tài)更低。非熱應(yīng)激期存在組內(nèi)差異性（P<0.05），表明經(jīng)過長時間代謝累計，泌乳時間越長，泌乳牛肝臟損傷程度越大。

奶牛在應(yīng)激狀態(tài)下，刺激機體產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和糖皮質(zhì)激素，誘導(dǎo)肝臟合成急性期反應(yīng)蛋白HPT[23]，此外熱應(yīng)激期奶牛發(fā)病率上升，酮病、脂肪肝等疾病都會損傷肝細(xì)胞，使外周血清HPT含量上升[24]，同時奶牛乳房炎的發(fā)生也會導(dǎo)致HPT濃度增加，其濃度與炎癥程度呈正相關(guān)。本試驗中，熱應(yīng)激期新產(chǎn)奶牛、泌乳前期和中期奶牛血清HPT濃度出現(xiàn)不同程度上升，泌乳后期奶牛無顯著性變化，3個泌乳階段奶牛與泌乳后期奶牛間呈顯著性差異（P<0.05），而非熱應(yīng)激期間各泌乳階段奶牛間無組內(nèi)差異（P>0.05），表明受熱應(yīng)激影響，機體損傷以新產(chǎn)奶牛、泌乳前期和中期奶牛更為嚴(yán)重，酮病、脂肪肝和乳房炎等疾病的潛在發(fā)病率也可能相應(yīng)提高。

綜上，各泌乳階段奶牛在熱應(yīng)激期間產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，機體代償性增加抗氧化酶活力，但脂質(zhì)過氧化程度仍出現(xiàn)加劇情況，總抗氧化能力下降，機體健康狀態(tài)出現(xiàn)不同程度的下降。因此，熱應(yīng)激期間應(yīng)針對不同泌乳階段奶牛血清指標(biāo)變化，改善日糧結(jié)構(gòu)，添加高效抗氧化劑，同時給予全群泌乳牛更多防暑降溫措施，對新產(chǎn)奶牛、泌乳前期和泌乳中期奶牛進行更多健康監(jiān)控，預(yù)防并及時發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激期間疾病的發(fā)生。