吳小燕 ，周仙莉 ，張紅巖 ，彭小星 ，范惠玲 ，滕長才 ，劉玉皎 ，3*

（1.青海大學農(nóng)牧學院，西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學院，西寧 810016；3.青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，西寧 810016）

蠶豆(Vicia fabaL.)，又稱羅漢豆、佛豆和胡豆等，屬豆科巢菜屬，一年生或越年生草本植物，是人類最早栽培種植的豆科類作物之一。蠶豆富含豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等，在食品、飼料以及綠肥等方面廣泛應用[1]。蠶豆還具有較高的藥用價值，它的莖、葉、花和莢殼等都可入藥，其根部的固氮能力可改善土壤結(jié)構(gòu)與土壤營養(yǎng)狀況[2]。目前，國內(nèi)外蠶豆育種主要集中在產(chǎn)量、品質(zhì)與抗性育種等方面[3]。機械化生產(chǎn)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的總體趨勢，也是制約蠶豆生產(chǎn)的因素之一。近年來，由于蠶豆難以適應機械化，生產(chǎn)效率低，生產(chǎn)成本不斷增加，導致其種植面積減少[4]。始莢節(jié)位與始莢高度是蠶豆重要的農(nóng)藝性狀，是實現(xiàn)蠶豆規(guī)?；瘷C械生產(chǎn)的關(guān)鍵性狀，因此，選育始莢節(jié)位與高度適宜且結(jié)莢比較集中、適合機械收獲的蠶豆品種，是解決近年來制約蠶豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的機械化收獲問題的有效方式。蠶豆基因組巨大，約為13 Gb，其基因組學與遺傳學研究進展相比于其他豆類較為緩慢[5]，基因組學研究僅局限于分子標記及QTLs層面。目前，關(guān)于始莢高度性狀基因定位的研究主要是在大豆上[6-10]，還未見關(guān)于蠶豆的相關(guān)報道。本研究以青蠶19號/青海13號構(gòu)建的F2群體為材料，對蠶豆的始莢節(jié)位、始莢高度性狀的遺傳進行分析，明確其遺傳規(guī)律，定位與蠶豆始莢節(jié)位、始莢高度性狀相關(guān)的QTLs，為應用分子標記輔助選擇育種技術(shù)定向選育適宜始莢高度與始莢節(jié)位的優(yōu)良品種選育提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

青蠶19號，始莢節(jié)位、始莢高度高，晚熟；青海13號，始莢節(jié)位、始莢高度低，早熟；以上材料均由青海大學農(nóng)林科學院作物栽培研究所蠶豆課題組提供，種植于青海省農(nóng)林科學院試驗地(36°43′N，101°45′E)。

1.2 試驗方法

1.2.1 群體構(gòu)建及性狀調(diào)查

以始莢節(jié)位、始莢高度較高的青蠶19號為母本，以始莢節(jié)位、始莢高度低的青海13號為父本，于2019年6—7月組配雜交組合，于8月份收獲雜交種；2020年4月種植F1群體，于8月份收獲F1單株；2021年4月種植F2群體。田間管理按常規(guī)方法進行。待成熟時，分別測定F2群體中各單株的始莢節(jié)位、始莢高度等性狀，利用SPSS統(tǒng)計軟件對F2群體的表型數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用植物數(shù)量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型[11]對親本和F2群體單株始莢節(jié)位與始莢高度進行遺傳分析。

1.2.2 引物篩選

DNA提?。涸谟酌缙谌∮H本及F2群體的幼嫩葉片，采用改良CTAB法[12]提取DNA。利用IMPLEN GMBH的超微量核酸蛋白測定儀與1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的蠶豆基因組DNA進行質(zhì)量檢測。

PCR擴增及產(chǎn)物的檢測：配置PCR反應體系，依次加入4 μL 2× San Taq PCR mix預混液體系、上下游SSR引物各0.5 μL、1.5 μL DNA模板及3.5 μL ddH2O，共10 μL。PCR儀擴增程序：94 ℃預變性5 min；94℃變性30 s，50℃～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，緩沖液為1×TBE，220 V恒壓電泳1.2 h左右，電泳結(jié)束后進行銀染和顯影，然后統(tǒng)計在親本材料間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物。

1.2.3 基因分型

利用篩選出來的具有多態(tài)性的SSR引物，對F2群體進行基因分型，與青蠶19號帶型一致的帶型記為1，與青海13號帶型一致記為2，雜合帶型記為0，缺失帶型記為3。

1.2.4 圖譜構(gòu)建

采用QTL Icimapping v.4.2軟件的構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，對SSR標記進行分組排列，計算標記間的連鎖距離。

1.2.5 基因初步定位

根據(jù)F2單株始莢節(jié)位與始莢高度性狀表型數(shù)據(jù)，應用QTL Icimapping v.4.2軟件的復合區(qū)間作圖法對表型數(shù)據(jù)和分子標記數(shù)據(jù)進行連鎖分析，掃描步長為1.00 cM，逐步回歸分析中標記進入的最大P值（PIN）為0.001，LOD閾值為2.2，初步定位始莢節(jié)位與始莢高度性狀相關(guān)QTLs。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳規(guī)律分析

F2群體中始莢節(jié)位與始莢高度兩個性狀呈現(xiàn)連續(xù)性分布（圖2），符合數(shù)量性狀的特征。F2群體始莢節(jié)位與始莢高度性狀的分離情況（表1）表明，始莢節(jié)位性狀的偏度值與峰度值的絕對值都小于3，說明該性狀由主效基因控制，始莢高度性狀的偏度值的絕對值小于3，但峰度值的絕對值大于3，說明該性狀受主基因控制的同時可能還受多個微效基因控制。始莢節(jié)位與始莢高度的變異系數(shù)都大于15%，說明這兩個性狀的變異豐富，始莢節(jié)位的變異系數(shù)33.4%，小于始莢高度的變異系數(shù)49.2%，表明后者比前者在形態(tài)變異上更豐富，更突出。這兩個性狀的變異系數(shù)都小于1，說明存在超親分離現(xiàn)象。通過相關(guān)性分析，結(jié)果表明始莢節(jié)位與始莢高度性狀之間呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)高達0.594（表2）。

圖2 始莢節(jié)位與始莢高度頻率分布直方圖Figure 2 Frequency distribution histogram of initial pod node position and initial pod height

表1 F2群體分離情況Table 1 Segregation of F2population

表2 始莢節(jié)位與始莢高度性狀的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between the position of the first pod node and the height of the first pod

2.2 始莢節(jié)位與高度性狀的遺傳模型和遺傳效應分析

采用植物數(shù)量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型對親本和F2群體單株始莢節(jié)位與始莢高度進行分析，根據(jù)AIC值最小法則選擇AIC值最小的一組作為備選模型（表3），對備選模型進行一組適合性檢驗（表4），選擇AIC值最小且統(tǒng)計量達到顯著水平個數(shù)較少的模型作為最優(yōu)模型，備選模型的統(tǒng)計量達到顯著水平的個數(shù)均為0，根據(jù)AIC準則進行篩選，即蠶豆始莢高度性狀符合2對加性-顯性主基因模型（2MG-AD）遺傳模型，蠶豆始莢節(jié)位性狀符合2對加性-顯性-上位性主基因模型（2MG-ADI）遺傳模型。根據(jù)選擇的最優(yōu)遺傳模型估計最優(yōu)遺傳模型的一階、二階遺傳參數(shù)，并求得了相關(guān)二階遺傳參數(shù)（表5、6），結(jié)果表明始莢節(jié)位性狀由2對主基因控制，主基因的遺傳率為44.6%，該性狀受環(huán)境因素的影響較大；2對主基因的加性效應值da(d)、db分別為1.134 9、1.060 5，具有正向遺傳效應，顯性效應值 ha(h)、hb 分別為-1.649 9、-0.921 5，均表現(xiàn)為負向遺傳效應。加性×加性互作效應值i為1.051 4，表現(xiàn)為正向效應，加性×顯性互作jab和顯性×加性互作jba的效應值分別為-0.920 3和-0.464 1，表現(xiàn)為較低的負向遺傳效應；顯性與顯性互作效應值l為1.481 6，表現(xiàn)為正向效應。始莢高度性狀由2對主基因控制，主基因的遺傳率較高，達到了83%。2對主基因的加性效應值da(d)、db分別為11.231、8.705 9，具有較高的正向遺傳效應，其顯性效應值ha(h)、hb分別為-15.806 6、-4.962 3，均表現(xiàn)為負向遺傳效應，尤其前者的負向遺傳效應更為突出。

表3 F2群體始莢節(jié)位與始莢高度性狀的遺傳模型Table 3 Genetic model of the characters of initial pod node position and initial pod height in F2population

表4 F2群體始莢節(jié)位與高度性狀的適合性檢驗Table 4 Fitness test of initial pod position and height traits in F2population

表5 F2群體始莢節(jié)位性狀遺傳參數(shù)估計值Table 5 Estimation of genetic parameters of the first pod node traits in F2population

表6 F2群體始莢高度性狀遺傳參數(shù)估計值Table 6 Estimation of genetic parameters for the traits of initial pod height in F2population

2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

2.3.1 多態(tài)性引物篩選

利用1 596對蠶豆SSR引物在親本青蠶19號和青海13號之間進行多態(tài)性引物的篩選，共篩選出202個在親本間具有多態(tài)性的標記，多態(tài)性比率為12.7%。

2.3.2 基因分型與偏分離分析

利用202對多態(tài)性引物對（青蠶19號×青海13號）F2群體進行基因分型，其中132個標記的帶型清晰且易識別，用于構(gòu)建遺傳圖譜。利用QTL Ici?mapping v.4.2軟件對每個SSR標記位點在作圖群體中的分布情況進行測驗，在P<0.05的顯著水平上，判斷某標記位點是否存在偏分離現(xiàn)象。結(jié)果表明132個標記中，53個標記表現(xiàn)出明顯的偏分離現(xiàn)象，占標記數(shù)量的40.15%，后期構(gòu)建遺傳圖譜時將這些偏分離標記剔除。

2.3.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用QTL Icimapping v.4.2軟件對79個多態(tài)性標記的基因分型數(shù)據(jù)進行連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。當LOD值為2.2時，圖譜共包含6個連鎖群，圖譜總長度為1 804.59 cM，標記間平均距離為22.84 cM，各連鎖群長度介于26.34～1 389.89 cM之間，SSR標記在各個連鎖群上分布不均勻，連鎖群的標記數(shù)量介于2～54個，其中LG1覆蓋長度最長，標記數(shù)量最多為54個，LG6覆蓋長度最短，含標記數(shù)量最少為2個，LG4標記間平均距離最小為7.47 cM，LG5標記間平均距離最大為28.12 cM。

2.3.4 始莢節(jié)位與始莢高度性狀基因的初步定位

利用QTL Icimapping v.4.2軟件對分子標記與始莢節(jié)位和始莢高度表型數(shù)據(jù)進行完備區(qū)間作圖法(inclusive composite interval mapping，ICIM)作圖，以LOD≥2.5為判定QTL是否顯著的標準，定位到了5個與始莢節(jié)位相關(guān)的QTLs（圖3），分別為qPs-2-1、qPs-2-2、qPs-2-3、qPs-2-4和 qPs-2-5，分別位于LG2上的482.00 cM、1018.00 cM、1183.00 cM、1 243.00 cM和1 354.00 cM處，LOD值分別為6.512 6、3.070 4、6.618 4、2.907 6和 2.618 0，加性效應分別為 0.512 6、1.173 7、1.270 4、0.408 9和-0.451 8，分別解釋了1.2213%、5.8434%、5.1660%、0.614 6%和0.663 0%的表型變異。定位到8個與始莢高度相關(guān)QTL（圖2），分別命名為qPh-2-1、qPh-2-2、qPh-2-3、qPh-2-4 qPh-2-5、qPh-2-6、qPh-3-1和qPh-3-2，他們分別位于LG2上的262.00 cM、484.00 cM、505.00 cM、697.00 cM、1 181.00 cM以及1 238.00 cM處和LG3上的48.00 cM以及187.00 cM處，LOD值分別為9.607 5、4.263 1、4.331 1、2.831 3、10.772 5、6.235 8、5.246 9和3.046 4，加性效應分別為9.506 7、2.386 1、3.817 5、2.347 5、9.144 9、4.030 3、9.183 1和 7.944 1，分別解釋了4.759 4%、0.548 2%、1.125 9%、0.386 8%、4.613 5%、0.781 5%、4.425 2%和3.225 9%的表型變異。

圖3 遺傳連鎖圖譜Figure 3 Genetic linkage map

3 討論

蠶豆作為我國種植面積最廣的食用豆品種，它可以調(diào)整種植結(jié)構(gòu)，增加農(nóng)民的收入，但是在生產(chǎn)過程中所需勞動強度大，生產(chǎn)成本高，效率低，影響了自身優(yōu)勢作用的發(fā)揮[13]。始莢高度是蠶豆實現(xiàn)機械化生產(chǎn)的重要性狀，明確該性狀的遺傳規(guī)律，定位相關(guān)的QTLs，為適宜始莢高度與始莢節(jié)位的優(yōu)良品種選育及分子輔助選擇育種提供依據(jù)。研究結(jié)果表明始莢節(jié)位與始莢高度都是數(shù)量性狀，并且這兩個性狀都由2對主基因所控制，始莢節(jié)位主基因的遺傳力為44.6%，該性狀表型的變異容易受環(huán)境因子的影響；始莢高度主基因的遺傳力為83%，說明該表型變異是由遺傳因子決定的，這與大豆始莢高度遺傳研究所得到的結(jié)論相一致[7,14-15]。當遺傳力較大時，在早代進行選擇比較適宜，遺傳力較低時在晚代進行選擇[16]，因此若要在后代群體中進行選擇，需在早代選擇。根據(jù)相關(guān)性分析可知，始莢節(jié)位與始莢高度之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達0.594，這說明兩個性狀之間存在緊密聯(lián)系。

構(gòu)建高密度的遺傳圖譜是蠶豆基因組研究的基礎(chǔ)和主要手段，在基因定位、克隆和關(guān)聯(lián)分析等方面發(fā)揮了重要的作用[17]；在構(gòu)建遺傳圖譜時，得到的連鎖群數(shù)目應與所研究對象染色體對數(shù)目是一一對應的[18]；如已有研究證實水稻的12對染色體與其連鎖群之間是完全對應的[19]；大豆有20對染色體，構(gòu)建的連鎖圖譜中含20個連鎖群[20]；玉米含有10對染色體，其連鎖群個數(shù)也為10[21]；還有馬鈴薯[22]、番茄[23]、綠豆[24]、菜豆[25]以及冬瓜[26]等它們的遺傳連鎖群個數(shù)均與單倍染色體個數(shù)相等。本試驗所構(gòu)建的遺傳圖譜包含6個連鎖群，與蠶豆的單倍染色體數(shù)目相等。與前人在研究中構(gòu)建的蠶豆遺傳圖譜相比[27]，該遺傳圖譜密度較小，連鎖群上所分布的標記不均勻，大多數(shù)標記都分布在LG02上，LG01和LG06上分別僅有3個和2個標記，主要是因為蠶豆基因組大而構(gòu)建圖譜所用的標記少，覆蓋率小導致的，后期需繼續(xù)篩選引物標記來加密已構(gòu)建遺傳圖譜。在構(gòu)建遺傳圖譜時存在一些偏分離標記，偏分離的概率達到了40.15%。前人[28-29]在研究中表明，構(gòu)建遺傳圖譜時偏分離是一種普遍現(xiàn)象，引起偏分離的原因有很多，如染色體丟失、重排、環(huán)境因素以及試驗過程中的誤差等，本試驗中偏分離存在的原因有待進一步研究。本試驗共定位到了5個與始莢節(jié)位相關(guān)的QTLs和8個與始莢高度相關(guān)的QTLs，兩個性狀各QTL位點貢獻率在0.61%～5.84%、0.39%～4.76%之間，小于10%，貢獻率較低。影響貢獻率的因素為遺傳方差和表型方差，本試驗在進行QTL作圖時，對每個SSR標記位點在作圖群體中的分布情況進行檢測，在P>0.05的顯著水平上，去除奇異分離的標記后進行QTL作圖，因此，遺傳因素對貢獻率的影響可以忽略。表型方差是導致低貢獻率的原因，本試驗未設多年多點，作圖群體為F2群體，變異系數(shù)大，表型變異豐富，此外調(diào)查表型性狀時還存在人為誤差，基因和環(huán)境互作也對貢獻率有一定的影響。在后期試驗中，應選用次級作圖群體或設多年多點試驗，減小試驗中的隨機誤差，提高所定位的QTL的質(zhì)量。有研究表明，在QTL作圖結(jié)果中，遺傳效應大、PVE低屬于正?，F(xiàn)象[30]。檢測到QTLs的準確性還需進一步驗證，可采用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的方法來提高QTL定位結(jié)果的準確性。

4 結(jié)論

蠶豆的始莢節(jié)位與始莢高度均是數(shù)量性狀，兩者之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，這兩個性狀均由2對主基因控制，無多基因；始莢節(jié)位性狀遺傳力較小，容易受環(huán)境因素影響，始莢高度性狀遺傳力較大，表型變異主要由遺傳因子決定，受環(huán)境影響較小。經(jīng)過SSR標記連鎖分析，定位到了5個始莢節(jié)位相關(guān)的QTLs和8個始莢高度相關(guān)的QTLs，貢獻率分別在0.61%～5.84%、0.39%～4.76%之間。這一研究結(jié)合分子標記輔助選擇育種技術(shù)為定向選育適宜始莢高度與始莢節(jié)位的優(yōu)良品種選育提供依據(jù)。