張馨予 蘇建青 褚秀玲

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，聊城 252000)

黃酮類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化和抗炎活性，作為飼料添加劑可以提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值。Muqier等[1]研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)飼糧中添加11～33 mg/kg的黃酮類化合物對(duì)肉羊的生長性能和神經(jīng)內(nèi)分泌激素水平有顯著影響，且呈時(shí)間依賴性，飼喂30 d后效果尤為明顯。Yuan等[2]研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉黃酮可以緩解敵草快誘導(dǎo)引起的仔豬炎癥和氧化應(yīng)激，還可以改善腸道損傷。金絲桃苷(hyperoside，Hyp)是天然黃酮醇苷類化合物的一種，現(xiàn)代藥理研究表明，Hyp具有抗炎、抗氧化、抗血栓、抗纖維化和鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[3-5]，對(duì)心腦缺血、肝纖維化和心力衰竭等疾病有治療效果[6-7]。但目前并未有報(bào)道關(guān)于Hyp作為飼料添加劑用于畜禽生產(chǎn)及疾病預(yù)防等方面的研究。這可能是由于Hyp低水溶性、低滲透性和不穩(wěn)定性等特點(diǎn)極大程度地影響了其應(yīng)用[8]?，F(xiàn)階段通過包合等技術(shù)改善難溶藥物的溶解度、調(diào)節(jié)藥物的釋放是常用的解決方法，如共晶混合物[9]、微膠囊技術(shù)[10]、納米技術(shù)[11]等。其中，環(huán)糊精(cyclodextrins，CDs)包合是價(jià)格便宜、操作簡單、技術(shù)成熟、前景良好的方法[12-13]。

環(huán)糊精的分子結(jié)構(gòu)為具有疏水腔的截錐狀寡糖[14],能與眾多有機(jī)或無機(jī)分子通過多種非共價(jià)相互作用，如范德華力、氫鍵作用、疏水作用等形成水溶性的主-客體包合物；或組裝成復(fù)雜的超分子體系[15]，稱為水溶性環(huán)糊精包合物。研究表明，黃酮是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，其尺寸形狀與環(huán)糊精空腔大小的匹配程度以及二者間氫鍵形成的難易程度對(duì)于包合起著至關(guān)重要的作用[16]。因此，選用分子中帶有羥基的β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)或帶有氨基的環(huán)糊精衍生物進(jìn)行包合的效果較好[17]，更有利于二者之間氫鍵的形成。本研究選擇了3種天然或被修飾的環(huán)糊精。其中，β-CD應(yīng)用范圍比較廣，并且毒性小，是最為常用的一種[18]。甲基-β-環(huán)糊精(methyl-β-cyclodextrin，M-β-CD)的溶解度比不加修飾的β-CD溶解度大，環(huán)糊精甲基化之后，封閉了環(huán)糊精的分子內(nèi)羥基，提高了與藥物包合的穩(wěn)定性，對(duì)難溶性藥物有很好的增溶效果[19]。羥乙基-β-環(huán)糊精(hydroxyethyl-β-cyclodextrin，HE-β-CD)在醫(yī)藥中可以提高藥物溶解度和生物利用度，使藥劑的療效增加，還可以調(diào)整或控制藥物的釋放速度[20]。另外，藥物包合后不僅溶解度[21]、穩(wěn)定性及生物利用度[22]得到了顯著提高，其藥理活性也較未包合時(shí)增強(qiáng)[23-24]。Corina等[25]制備蘆丁與β-CD和羥丙基-β-環(huán)糊精的包合物，結(jié)果顯示，包合后的蘆丁包合物抗氧化活性增強(qiáng)。Arya等[26]以β-CD包合姜黃素，姜黃素包合物的水溶性和抗氧化活性均顯著提高，并發(fā)現(xiàn)β-CD包合物對(duì)姜黃素具有5 h的緩釋特性。Hsu等[27]將大黃的乙醇提取物與2-羥丙基-β-環(huán)糊精絡(luò)合，得到的包合物的水溶性和生物利用度明顯增加，進(jìn)而增強(qiáng)了對(duì)抗肝癌細(xì)胞的作用。目前，關(guān)于Hyp與環(huán)糊精包合的研究文獻(xiàn)較少?？讜札埖萚28]將Hyp與β-CD進(jìn)行包合，發(fā)現(xiàn)Hyp包合物的溶出速度顯著提高，但未對(duì)其進(jìn)行全面的表征分析及藥效評(píng)價(jià)。因此，本研究對(duì)Hyp包合物進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)估，以拓展其將來在畜禽養(yǎng)殖等方面的應(yīng)用。

包合物制備方法包括飽和溶液法、溶液攪拌法、研磨法、超聲波法和冷凍干燥法等。超聲波法利用超聲的機(jī)械效應(yīng)、空化作用和熱效應(yīng)，提高物質(zhì)的分子運(yùn)動(dòng)速度，增大介質(zhì)分子的穿透率；并且利用超聲波在液體中傳播時(shí)產(chǎn)生的沖擊波，釋放能量，促進(jìn)環(huán)糊精與Hyp包合過程的進(jìn)行[29]。因此，本研究選用超聲波法制備Hyp與3種環(huán)糊精(HE-β-CD、β-CD和M-β-CD)的包合物，并通過溶解度測(cè)定和物理化學(xué)表征，包括形貌觀察、熱重分析(thermogravimetric analysis，TGA)、薄層色譜及X-射線衍射(X-ray diffraction，XRD)等，綜合分析不同包合物的包合效果，并從中選擇增溶效果最好的包合物，通過抗氧化性試驗(yàn)評(píng)價(jià)包合作用對(duì)其抗氧化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Hyp(高效液相色譜級(jí))購自上海源葉生物技術(shù)有限公司。β-CD、M-β-CD、HE-β-CD均購自上海麥克林生化有限公司。2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)、2,2′氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。GF254硅膠板購自青島海洋化工有限公司。RAW 264.7細(xì)胞購于中國科學(xué)院干細(xì)胞庫。1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

主要儀器包括超顯微分光光度計(jì)(F-1100型，杭州遂真生物技術(shù)有限公司)、薄層色譜儀(SB-2型，天津市天分分析儀器廠)、熱重分析儀(Q-500型，美國TA公司)、差示掃描量熱儀(Q-20型，美國TA公司)、X射線衍射儀(D-8 Advance型，德國布魯克衍射熒光事業(yè)部)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)(JSM-840型，日本電子株式會(huì)社)。

1.2 化學(xué)計(jì)量(連續(xù)變分法)

Hyp含量測(cè)定根據(jù)Arya等[26]的方法略加調(diào)整后測(cè)定。制備濃度梯度為2.5、5.0、10.0、20.0和40.0 μg/mL的Hyp無水乙醇溶液，用紫外-可見分光光度法在360 nm波長下對(duì)制備的樣品進(jìn)行分析，通過Hyp溶液的吸光度值與其濃度作圖建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

運(yùn)用Job法[30]確定HyP分別與HE-β-CD、β-CD和M-β-CD形成包合物的化學(xué)計(jì)量比。維持Hyp和環(huán)糊精的總濃度不變(1 mmol/L)，配制一系列濃度的Hyp和環(huán)糊精混合液，使兩者的物質(zhì)的量之比在0.1～0.9，在25 ℃的條件下超聲包合60 min，在360 nm測(cè)定吸光度值。以有無環(huán)糊精時(shí)Hyp的吸光度差值(△ABS)為縱坐標(biāo)，并以Hyp在混合液中所占比例為橫坐標(biāo)作圖。

1.3 物理混合物和包合物的制備

每種物理混合物按主客體摩爾比1∶1混合，準(zhǔn)確稱取Hyp和3種環(huán)糊精，分別在陶瓷砂漿中充分混合均勻，室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)Job曲線結(jié)果，按摩爾比1∶1制備Hyp和環(huán)糊精的復(fù)合物。取Hyp 1.0 g，加適量無水乙醇微熱溶解，另取HE-β-CD 3.1 g，加水500 mL，攪拌溶解。將Hyp乙醇溶液逐滴加入攪拌中的HE-β-CD溶液中，在超聲波功率300 W，超聲溫度50 ℃的條件下混合1 h，并振搖72 h。放冷至室溫后，未溶解的固體通過0.2 μm纖維素膜過濾，濾液先在-80 ℃冰箱中冷凍，然后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中凍干，即得到呈黃色的Hyp-HE-β-CD包合物。其他包合物的制備與Hyp-HE-β-CD相似。以下所有的表征分析都使用凍干產(chǎn)品。

1.4 包合物的表征分析

1.4.1 SEM觀察形態(tài)差異

SEM觀察是測(cè)定材料表面形貌和結(jié)構(gòu)的常用手段。在SEM中，利用電子束掃描樣品表面，獲得三維空間信息[31]。將樣品粉末均勻地黏附在導(dǎo)電膠上并安裝至鋁柱上，并噴金鍍膜。在10 kV加速電壓和600倍、2 000倍或5 000倍放大率下通過SEM進(jìn)行成像。

1.4.2 熱重分析和差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)分析

使用熱重分析儀進(jìn)行熱重分析，在氮?dú)鈿夥障?流速為50 mL/min)，按升溫速率5 ℃/min從30 ℃升高到500 ℃，檢測(cè)過程在鉑皿中進(jìn)行。

用Dai等[32]描述的方法，用差示掃描量熱儀對(duì)Hyp和包合物進(jìn)行了DSC分析，并進(jìn)行了一些修改。將凍干樣品(約5.0 mg)裝入密封良好的鋁鍋中，然后在氮?dú)庀乱?0 ℃/min的速率從50 ℃加熱到300 ℃。

1.4.3 薄層色譜分析

4種樣液(Hyp乙醇溶液、環(huán)糊精水溶液、包合物水溶液和物理混合物水溶液)分別點(diǎn)于硅膠板的同側(cè)，其下端浸入展開劑(乙酸乙酯/甲酸/水=30/3/2，體積比)中，當(dāng)展開劑距板的上端1 cm時(shí)取出。晾干后，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液顯影，并在紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.4.4 XRD分析

采用X射線衍射儀在銅激發(fā)α射線(Cu-Kα)輻射下，以5°/min的掃描速率獲得了Hyp、Hyp-HE-β-CD及其他包合物的XRD光譜。將粉末樣品安裝在玻璃樣品架上，掃描步長為2θ=0.02°，在5°～90°(θ～2θ)處獲得了衍射圖形。

1.5 溶解性研究

在25 °C、5 mL水中加入過量的Hyp(10 mg)或其包合物(250 mg)，每5 min對(duì)上清中Hyp含量進(jìn)行1次測(cè)定，持續(xù)到200 min做最后1次測(cè)量。每個(gè)樣品重復(fù)3次，繪制Hyp及其3種包合物隨時(shí)間的溶解度變化曲線。

1.6 溫度對(duì)Hyp/HE-β-CD絡(luò)合反應(yīng)的影響

參照Liu等[33]的方法，適當(dāng)調(diào)整后進(jìn)行溫度對(duì)溶解度影響的研究。配制體積為5 mL的一系列摩爾濃度(0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L)的HE-β-CD溶液，過量的Hyp(10 mg)加到以上溶液的離心管中。在300 W的功率下包合60 min，然后在恒溫振蕩器中振蕩72 h。混合物的平衡溫度分別為30、40和50 ℃。離心后取上清，再用0.2 μm親水性纖維素膜過濾器過濾，去除未溶解的Hyp。用超微分光光度計(jì)測(cè)定紫外-可見吸收光譜，得到Hyp-HE-β-CD包合物的紫外-可見光譜滴定圖。通過繪制Hyp溶解度隨環(huán)糊精濃度的變化曲線，得到在不同溫度、不同環(huán)糊精濃度下的Hyp溶解度圖。根據(jù)溶解度數(shù)據(jù)計(jì)算表觀穩(wěn)定常數(shù)(Ks)，并分析Hyp與HE-β-CD的相互作用熱力學(xué)，得到Ks的對(duì)數(shù)與溫度倒數(shù)的關(guān)系圖。所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次。Ks的公式如下：

Ks=slope/[S(1-slope)]。

式中：S指在不同溫度下無環(huán)糊精條件下Hyp的溶解度；slope為相溶解度圖對(duì)應(yīng)的斜率。

根據(jù)Van’t Hoff方程計(jì)算包合物的吉布斯自由能(ΔG)：

lnKs=-(ΔH/RT)+ΔS/R；ΔG=ΔH-TΔS。

式中：ΔH為焓變(kJ/mol)；R為通用氣體常數(shù)[J/(mol·K)]；T為絕對(duì)溫度(K)；ΔS為熵變[J/(mol·K)]。

1.7 抗氧化活性

以DPPH、ABTS、羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率和還原能力為指標(biāo)，比較Hyp包合前后的抗氧化能力。DPPH清除試驗(yàn)參考Andrade等[34]的方法，ABTS自由基清除試驗(yàn)參考Aarland等[35]的方法，羥基自由基清除試驗(yàn)參考Dai等[36]的方法，超氧陰離子清除率采用鄰苯三酚自氧化法[37]進(jìn)行測(cè)定，還原能力測(cè)定參考Chen等[38]的方法。試驗(yàn)使用蒸餾水和維生素C分別作空白對(duì)照和陽性對(duì)照[39]。

1.8 細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)

1.8.1 藥物安全性評(píng)價(jià)

采用CCK-8法進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)。將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/mL，以每孔200 μL接種于96孔板，待細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，棄上清，并使用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1遍。加入200 μL含有不同濃度(75、100、125、150、175、200 μg/mL)Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物的培養(yǎng)基，作用24 h后棄上清。每孔加入含有10% CCK-8溶液的1640培養(yǎng)基，37 ℃孵育30 min，使用酶標(biāo)儀在450 nm出測(cè)吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.8.2 過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型的建立

重復(fù)1.8.1的操作步驟，使用PBS清洗后，加入200 μL含有不同濃度H2O2(100、200、400、600、800、1 000 μmol/L)的無血清1640培養(yǎng)基，孵育2 h后計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.8.3 Hyp及其包合物對(duì)H2O2-RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

按1.8.1步驟進(jìn)行操作，并設(shè)立空白組、H2O2組、維生素C對(duì)照組(100 μg/mL)、Hyp組(100 μg/mL)和Hyp-HE-β-CD包合物組(50、100、150 μg/mL)。空白組和H2O2組以無血清1640培養(yǎng)基代替樣品。藥物作用24 h后去除培養(yǎng)基，清洗后再加入含有400 μmol/L H2O2的無血清1640培養(yǎng)基作用2 h，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.8.4 細(xì)胞內(nèi)MDA含量及SOD活性檢測(cè)

將6孔板中細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL，待密度達(dá)到80%～90%時(shí)，棄上清并使用PBS清洗1遍，參照1.8.3的方法進(jìn)行培養(yǎng)并分組。根據(jù)免疫沉淀(immunol precipitation,IP)裂解液說明書裂解細(xì)胞并收集上清液，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性。

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用OriginPro 9.1軟件進(jìn)行作圖，使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 絡(luò)合化學(xué)計(jì)量的測(cè)定

Hyp含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：y=0.037 3x+0.047 8(R2=0.996 6)。通過Job法[30]測(cè)定3種環(huán)糊精與Hyp之間的包合比。圖1為HE-β-CD、β-CD和M-β-CD與Hyp在乙醇與水的混合溶液中的Job曲線圖，圖中曲線的最高點(diǎn)在Hyp比例為0.5時(shí)出現(xiàn)，可以判斷出HE-β-CD與Hyp的最佳包合比為1∶1。β-CD和M-β-CD與Hyp進(jìn)行包合也得到類似結(jié)果，表明本研究中選擇的3種環(huán)糊精類型與Hyp之間均為1∶1包合。

Hyp：金絲桃苷 hyperoside；HE-β-CD：羥乙基-β-環(huán)糊精 hydroxyethyl-β-cyclodextrin；β-CD：β-環(huán)糊精 β-cyclodextrin；M-β-CD：甲基-β-環(huán)糊精 methyl-β-cyclodextrin。下圖同 the same as below。

2.2 表征分析結(jié)果

2.2.1 SEM分析結(jié)果

由Hyp、3種包合物及3種物理混合物的SEM圖和包合物的實(shí)物圖(圖2)可見，Hyp呈大小不同的塊狀晶體，HE-β-CD為中空球狀結(jié)構(gòu)，β-CD為小型塊狀結(jié)構(gòu)，M-β-CD雖結(jié)構(gòu)不完整但仍能看出其自身為球形，3種包合物都是表面附著一些疏松細(xì)小顆粒的塊狀晶體。但不同主體環(huán)糊精的包合物又具有不同的形貌特征，其中Hyp-HE-β-CD包合物中HE-β-CD本身的球狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全消失，呈不規(guī)則塊狀且光滑平面上嵌入類似細(xì)小晶體的形態(tài)，并呈現(xiàn)明顯主客體環(huán)抱形；Hyp-β-CD包合物的表面較為粗糙且有明顯裂痕；Hyp-M-β-CD包合物表面只觀察到少量客體嵌入且表面無裂痕。另外，各物理混合物仍保留其主客體自身的結(jié)構(gòu)特征，均可觀察到單獨(dú)的Hyp晶體和單獨(dú)的環(huán)糊精形態(tài)，因此不能將其理解為是一種新物質(zhì)的合成[40]。

圖2 Hyp(a)(2 000×和5 000×)、Hyp/HE-β-CD包合體系(b)Hyp/β-CD包合體系(c)Hyp/M-β-CD包合體系(d)的SEM及粉末圖

2.2.2 熱重分析和DSC分析結(jié)果

Hyp及其包合物的熱重分析見圖3-a。Hyp-HE-β-CD包合物有2個(gè)失重過程，分別對(duì)應(yīng)于空腔內(nèi)水分子的脫水和大環(huán)的分解。Hyp-HE-β-CD包合物在310 ℃下的降解損失了77.5%的重量[41]。Hyp在100、170、250和420 ℃分別發(fā)生了失重。

各包合物的DSC分析見圖3-b。HE-β-CD、β-CD和M-β-CD包合物分別在232、219和250 ℃出現(xiàn)明顯的峰，這些特征峰的出現(xiàn)可歸因于聚合物中結(jié)合水的蒸發(fā)。對(duì)Hyp的DSC分析結(jié)果顯示，在123和190 ℃有2個(gè)明顯的吸熱峰，在123 ℃時(shí)的吸熱峰可能是由于Hyp中水分的去除，而在190 ℃時(shí)的吸熱峰可能是由于Hyp晶體的熔化，說明Hyp以結(jié)晶狀態(tài)存在[42]。

圖3 Hyp和3種包合物的熱重分析和DSC分析

2.2.3 薄層色譜分析結(jié)果

薄層色譜是一種用于分離混合物的色譜技術(shù)。由于對(duì)固定相的吸引力和在溶劑中的溶解度不同，樣品混合物中的不同化合物以不同的移動(dòng)速率移動(dòng)。Hyp、HE-β-CD、β-CD、M-β-CD及它們的包合物和物理混合物的薄層色譜結(jié)果在紫外光下的可視化如圖4所示。因?yàn)榄h(huán)糊精沒有熒光部分，在紫外光照射下均沒有觀察到斑點(diǎn)，而3種包合物和物理混合物均顯示了來自Hyp的熒光點(diǎn)。其中，Hyp和Hyp-HE-β-CD物理混合物與Hyp-HE-β-CD包合物相比有較快的速度移動(dòng)(圖4-a)，類似現(xiàn)象也出現(xiàn)在Hyp-β-CD包合體系中(圖4-b)。Hyp-HE-β-CD物理混合物和Hyp-β-CD包合物的移動(dòng)速度略慢于Hyp，而Hyp-M-β-CD包合物與Hyp的移動(dòng)速度相近(圖4-c)。

圖4 在紫外光下Hyp、環(huán)糊精及其包合物和物理混合物的薄層色譜圖

2.2.4 XRD分析結(jié)果

特征峰在光譜中出現(xiàn)、特征峰的升高或降低都是包合物形成的證據(jù)[43]。Hyp及Hyp-HE-β-CD、Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物的XRD分析結(jié)果如圖5所示。Hyp在10°～40°具有特征性的高能衍射峰，說明藥物具有典型的晶體結(jié)構(gòu)特征。Hyp-HE-β-CD包合物的衍射圖可以看到Hyp的某些衍射峰減弱，并在30°～45°處出現(xiàn)了一些寬的衍射峰，這些峰的變化說明Hyp被包合到環(huán)糊精中[40,44]。Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物的衍射圖仍具有Hyp客體結(jié)晶型的特征衍生峰，但強(qiáng)度和數(shù)目明顯減少。

圖5 Hyp及Hyp-HE-β-CD、Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物的XRD分析

2.3 溶解度試驗(yàn)

藥物與環(huán)糊精絡(luò)合后，包合物的水溶性較包合前普遍有不同程度的提高，尤其對(duì)自身難溶于水甚至不溶于水的物質(zhì)[45]。如圖6所示，Hyp在水中的溶解速率極為緩慢，溶解60 min后速溶解率趨于平緩；3種包合物均表現(xiàn)出良好的水溶性，其中Hyp-HE-β-CD包合物在前15 min內(nèi)迅速溶解，隨后溶解速率降低趨于穩(wěn)定，15 min時(shí)其溶解度約占飽和狀態(tài)下總?cè)芙舛鹊?4.51%，而Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物的溶解度分別約占飽和狀態(tài)下總?cè)芙舛鹊?0.70%和84.06%，故Hyp-HE-β-CD包合物比其他2種包合物具有更快的溶解速率。HE-β-CD、β-CD和M-β-CD包合物的增溶作用使Hyp的水溶性分別提高到1 255.62、1 138.01和1 040.42 μg/mL，顯著高于Hyp單體(約153.09 μg/mL)。其中Hyp-HE-β-CD包合物的增溶效果最佳，可達(dá)8.2倍。

圖6 Hyp及Hyp-HE-β-CD、Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物在水中的溶解度特性

2.4 溫度對(duì)Hyp與Hyp-HE-β-CD絡(luò)合反應(yīng)的影響

如圖7所示，隨著主體HE-β-CD濃度不斷增加，Hyp的吸光值不斷增大，肉眼可見形成的包合物顏色逐漸加深。此外，隨著HE-β-CD濃度的增加，Hyp的溶解度呈線性增加，再次驗(yàn)證了Hyp與HE-β-CD在溶液中形成了包合物且兩者摩爾比為1∶1。

a～g：HE-β-CD濃度分別為0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mmol/L。

表1為不同溫度下Hyp和HE-β-CD溶解度直線圖的截距、斜率和Ks。溫度越高，線性曲線的截距越大，表明Hyp溶解度隨溫度的升高而增大。另外Ks隨溫度升高而顯著降低，意味著Hyp加入HE-β-CD后伴隨著放熱。

表1 從Hyp和HE-β-CD溶解度圖中得到的不同溫度下的截距、斜率和Ks

通過對(duì)不同溫度下溶解度的研究，可以計(jì)算出焓值和熵值的變化。Hyp-HE-β-CD包合物形成的Van’t Hoff圖如圖8所示，Ks與絕對(duì)溫度的倒數(shù)(1/T)呈線性關(guān)系(R2=0.992)。根據(jù)這條線性曲線的斜率和截距可以計(jì)算出熱力學(xué)參數(shù)：焓變=-67.55 kJ/mol和熵變=-172.52 J/(mol·K)。進(jìn)一步計(jì)算出絡(luò)合相互作用的不同溫度下的ΔG的變化，ΔG30 ℃=-15.28 kJ/mol，ΔG40 ℃=-13.55 kJ/mol，ΔG50 ℃=-11.83 kJ/mol。

圖8 Hyp-HE-β-CD包合物的Van’t Hoff圖

2.5 抗氧化活性的測(cè)定結(jié)果

目前基于化學(xué)氧化還原反應(yīng)已經(jīng)開發(fā)出多種檢測(cè)方法用于評(píng)估中藥中黃酮類成分的抗氧化活性，這些檢測(cè)方法按照機(jī)理大致可以分為2類：通過單電子轉(zhuǎn)移或氫原子轉(zhuǎn)移達(dá)到抗氧化的目的[46]。本研究中采用的5種檢測(cè)方法的反應(yīng)原理有差異，基于氫原子轉(zhuǎn)移的DPPH方法是通過檢測(cè)抗氧化劑提供1個(gè)氫原子淬滅自由基的能力[47]，ABTS、還原力、羥基自由基和超氧陰離子清除試驗(yàn)則是通過檢測(cè)抗氧化劑轉(zhuǎn)移1個(gè)電子以減少自由基或金屬離子的氧化性[48]。另外，本試驗(yàn)既檢測(cè)疏水化合物的清除能力(DPPH法)，又檢測(cè)親水化合物的清除能力(ABTS法)，多種測(cè)定方法相輔相成，可以充分評(píng)價(jià)包合前后Hyp的抗氧化能力。

DPPH試驗(yàn)結(jié)果表明(圖9-a)，在2.5～15.0 μg/mL的樣品濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率隨著Hyp、Hyp-HE-β-CD包合物和維生素C濃度的增加均增加，并表現(xiàn)出濃度依賴性。當(dāng)樣品濃度增加到20 μg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率分別達(dá)到91.14%、92.05%和94.05%；然而隨樣品濃度繼續(xù)增加，DPPH自由基清除率均趨于平緩。Hyp、Hyp-HE-β-CD包合物和維生素C的半抑制濃度(IC50)分別為7.136、6.500和8.194 μg/mL?？偟膩碚f，Hyp-HE-β-CD包合物的DPPH清除能力強(qiáng)于未被包合的Hyp，這可能是由于Hyp-HE-β-CD包合物在水中能釋放出更多與DPPH自由基結(jié)合的氫原子，導(dǎo)致DPPH自由基的還原激進(jìn)[49]。

在ABTS清除試驗(yàn)中(圖9-b)，Hyp、Hyp-HE-β-CD包合物和維生素C的IC50分別為8.251、6.362和7.495 μg/mL。隨著樣本濃度增大，Hyp-HE-β-CD包合物和Hyp對(duì)ABTS自由基清除能力隨之提高，并且前者始終優(yōu)于后者。當(dāng)濃度為25 μg/mL時(shí)，Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物對(duì)ABTS自由基的最大清除率分別達(dá)到82.68%和88.67%。

考慮到羥基自由基作為生物體內(nèi)最活躍的氧物質(zhì)容易與其他如脂質(zhì)或蛋白質(zhì)等分子反應(yīng)進(jìn)而引起病變[50]，因此評(píng)價(jià)藥物對(duì)羥基自由基清除能力至關(guān)重要。由于Hyp在水中的溶解度僅能達(dá)到50 μg/mL，因此本研究僅對(duì)此濃度范圍內(nèi)的Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物的羥基自由基清除能力進(jìn)行比較，結(jié)果如圖9-c所示。雖然在最高樣本濃度下，Hyp-HE-β-CD包合物和Hyp的羥基自由基清除率僅為28.01%和19.41%，但Hyp-HE-β-CD包合物對(duì)羥基自由基清除率明顯強(qiáng)于未包合的Hyp。

從圖9-d可以看出，3種樣品對(duì)超氧陰離子均具有一定的清除作用，且作用效果均與樣品濃度呈正相關(guān)。在最大濃度500 μg/mL時(shí)，Hyp-HE-β-CD包合物的超氧陰離子清除率雖不及維生素C，但明顯高于Hyp；Hyp-HE-β-CD包合物、維生素C和Hyp對(duì)超氧陰離子清除率清除率分別為57.27%、98.47%和41.46%。

另外，通過檢測(cè)鐵氰化鉀中三價(jià)鐵離子(Fe3+)被還原為二價(jià)鐵離子(Fe2+)的含量來評(píng)估藥物的另一個(gè)衡量抗氧化能力的潛在指標(biāo)——還原能力[51]，結(jié)果表示吸光值越高其還原能力越強(qiáng)。從圖9-e可以看出，Hyp-HE-β-CD包合物和Hyp的還原能力均略低于維生素C，雖然Hyp-HE-β-CD包合物比未包合的Hyp表現(xiàn)出更強(qiáng)的還原能力，但包合前后對(duì)該指標(biāo)的影響不大。

圖9 Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.6 Hyp-HE-β-CD包合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響見圖10-a，兩者分別在50～125 μg/mL和50～150 Μg/mL區(qū)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，且隨濃度升高促增殖效果呈先增大后減小的趨勢(shì)；當(dāng)Hyp濃度達(dá)到150 μg/mL，細(xì)胞存活率顯著低于空白組(P<0.05)；而Hyp-HE-β-CD包合物濃度達(dá)175 μg/mL，細(xì)胞存活率才顯著低于空白組(P<0.05)。因此，選擇Hyp-HE-β-CD包合物的低、中、高濃度(50、100、150 μg/mL)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并與促增殖效果最強(qiáng)的100 μg/mL Hyp做對(duì)比。

H2O2刺激對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率的影響見圖10-b，隨著H2O2濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到1 000 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率僅為15.61%，獲得IC50為493.21 μmol/L。

Hyp和Hyp-HE-β-CD包合物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用見圖10-c，50 μg/mL Hyp-HE-β-CD包合物組的細(xì)胞存活率極顯著高于100 μg/mL Hyp組(P<0.01)，意味著Hyp被HE-β-CD包和后對(duì)H2O2刺激RAW264.7細(xì)胞具有更高的保護(hù)效果。另外，100 μg/mL Hyp-HE-β-CD包合物組的存活率極顯著高于空白組(P<0.01)，進(jìn)一步肯定了包合作用的重要意義。

MDA由多不飽和脂肪酸被氧代謝產(chǎn)生的活性自由基降解而形成，是細(xì)胞中氧化應(yīng)激的指標(biāo)[52]。SOD可催化有毒的超氧陰離子(·O2-)分解為氧氣(O2)和H2O2，防止超氧陰離子的毒性作用對(duì)細(xì)胞造成損傷[53]，是氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)中一種重要的抗氧化酶。由圖10-d可知，空白組細(xì)胞MDA含量與模型組有極顯著差異(P<0.01)，表明模型組細(xì)胞受到刺激后出現(xiàn)嚴(yán)重脂質(zhì)過氧化；維生素C組細(xì)胞MDA含量極顯著低于模型組(P<0.01)，而與Hyp組和Hyp-HE-β-CD包合物組無顯著差異(P>0.05)，說明Hyp與維生素C具有類似的治療效果；與Hyp組相比，中濃度Hyp-HE-β-CD包合物組細(xì)胞MDA含量極顯著降低(P<0.01)。另外，由圖10-e可知，模型組細(xì)胞SOD活性極顯著低于其他各組(P<0.01)，中濃度Hyp-HE-β-CD包合物組細(xì)胞SOD活性顯著高于Hyp組(P<0.05)，且低濃度Hyp-HE-β-CD包合物組細(xì)胞SOD活性顯著高于空白組(P<0.05)。

圖a、b中，與空白組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。圖c、d、e中，2組間比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；與模型組比較，##表示差異極顯著(P<0.01)。

3 討 論

將Hyp和HE-β-CD、β-CD、M-β-CD均按最佳包合比1∶1包合后干燥，得到淡黃色粉末。在各包合物SEM圖中可以看出新物質(zhì)體積明顯大于包合前的單體，且其中Hyp的特殊形態(tài)特征已不存在，這些明顯的變化說明了Hyp和HE-β-CD、β-CD和M-β-CD均有效形成了包合物，并且形成包合物后，其表面晶形結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化，而物理混合物不具備以上特征。根據(jù)熱重分析結(jié)果，各包合物均比Hyp發(fā)生失重的溫度更晚，因此包合物的熱穩(wěn)定性更高。DSC分析結(jié)果中Hyp-HE-β-CD、Hyp-M-β-CD和Hyp-β-CD包合物的吸熱峰消失，表明包合的Hyp以無定型存在于環(huán)糊精中，與晶體分子不同，無定型分子的溶解不需要任何能量來打破晶體，因此它們能夠作為聚合物基質(zhì)的易擴(kuò)散體，從而使封裝的Hyp有可能持續(xù)釋放。薄層色譜結(jié)果中，Hyp與包合物(Hyp-HE-β-CD和Hyp-β-CD包合物)和物理混合物的移動(dòng)速度差異表明，Hyp被包封在環(huán)糊精腔內(nèi)，包合物中的Hyp與固定相和展開溶劑的相互作用與未被包合的Hyp不同，而物理混合物中Hyp沒有很好的被環(huán)糊精包封，并且Hyp-M-β-CD包合物中Hyp和M-β-CD的包合作用相對(duì)較弱。XRD結(jié)果的差異均是因?yàn)榘衔锏闹苽溥^程使Hyp進(jìn)入環(huán)糊精中，表現(xiàn)出非晶型或以無定型的形式存在[54]。Zheng等[55]在對(duì)α-硫辛酸與2-羥丙基-β-CD形成的包合物研究中得出了相似的結(jié)論。

Hyp-HE-β-CD包合物的增溶效果優(yōu)于其他2種包合物，其水溶性是Hyp的8.2倍，這可能與HE-β-CD的自身性質(zhì)有關(guān)，其內(nèi)疏水、外親水的特性能使難溶性藥物分子進(jìn)入其內(nèi)腔而形成包合物，從而極大地提高Hyp在水中的溶解度，有研究也證實(shí)了該環(huán)糊精是一種極具應(yīng)用潛力的難溶性藥物的增溶劑[56]。為實(shí)現(xiàn)在臨床醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛價(jià)值，故選擇增溶效果最佳的Hyp-HE-β-CD包合物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并探究了溫度對(duì)兩者包合作用的影響。隨著溫度升高，Hyp-HE-β-CD包合物的溶解度直線的截距增大且Ks降低，說明該絡(luò)合過程伴隨放熱。其他絡(luò)合物也表現(xiàn)出類似的性質(zhì)，Mazzobre等[57]采用共同沉淀法制備了α-松油醇與β-CD的包合物，Mourtzinos等[58]將百里香酚和香葉醇分別與β-CD包合，溶解度研究結(jié)果均顯示以上絡(luò)合過程均是自發(fā)放熱的。由于焓變?yōu)樨?fù)值，也說明Hyp與HE-β-CD絡(luò)合為放熱過程，并且該絡(luò)合作用為低能型。Liu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，這些絡(luò)合作用的發(fā)生主要取決于黃酮的空間效應(yīng)和疏水性，可能為絡(luò)合時(shí)疏水性更強(qiáng)的黃酮分子將環(huán)糊精空腔中的水分子替代，同時(shí)與腔內(nèi)的側(cè)基形成氫鍵，從而進(jìn)一步穩(wěn)定包合結(jié)構(gòu)。另外，熵變?yōu)樨?fù)值表明由于絡(luò)合分子的平動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)自由度比自由分子的低，使系統(tǒng)變得更加穩(wěn)定[58]。ΔG均為負(fù)值表示Hyp與HE-β-CD的絡(luò)合作用是自發(fā)進(jìn)行的。

通過檢測(cè)抗氧化試驗(yàn)中5項(xiàng)抗氧化指標(biāo)可以得到結(jié)論，三者的抗氧化能力順序?yàn)榫S生素C>Hyp-HE-β-CD包合物>Hyp。因此，被HE-β-CD包和后的Hyp比包合前的Hyp具有更好的抗氧化性能，為其在細(xì)胞水平上的抗氧化活性探究奠定基礎(chǔ)。另外，在應(yīng)對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激中，中濃度Hyp-HE-β-CD包合物組表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用，在降低MDA含量和提高SOD活性方面的作用效果顯著強(qiáng)于Hyp。由此再次說明Hyp被HE-β-CD包合后，其抗氧化性能有較大程度地提高，可以更好地提高RAW264.7細(xì)胞中抗氧化酶的活性，從而抑制H2O2累積造成的脂質(zhì)過氧化，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激，更有利于維持和改善細(xì)胞生理活性。這可能是由于環(huán)糊精具有特殊的分子結(jié)構(gòu)、良好的穩(wěn)定性和易于化學(xué)修飾等特性，在藥物遞送中表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢(shì)，HE-β-CD與Hyp形成的主-客體復(fù)合結(jié)構(gòu)對(duì)內(nèi)部的Hyp起一定保護(hù)作用，保證其溶于水后可以更好地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。該試驗(yàn)結(jié)果對(duì)制備Hyp的環(huán)糊精包合物具有肯定和推動(dòng)作用。

4 結(jié) 論

Hyp具有一系列的藥理活性，但由于其水溶性差、生物利用度低而限制了其應(yīng)用。本文采用1∶1的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法成功制備了Hyp和環(huán)糊精的包合物。與Hyp-β-CD和Hyp-M-β-CD包合物相比，Hyp-HE-β-CD包合物具有更高的水溶性。熱力學(xué)研究表明，3種包合物的熱穩(wěn)定性均明顯強(qiáng)于Hyp，并且Hyp分子進(jìn)入HE-β-CD內(nèi)部是一個(gè)自發(fā)放熱過程。根據(jù)SEM圖像，Hyp分子被插入到HE-β-CD空腔中形成絡(luò)合物結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能保護(hù)內(nèi)部Hyp分子更好地發(fā)揮抗氧化作用。本研究對(duì)于擴(kuò)大Hyp在醫(yī)藥產(chǎn)品、飼料添加劑等領(lǐng)域中的應(yīng)用具有重大意義。