周昭彬 丁亞南 白心亮 宋澤和 賀 喜* 劉自逵*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；3.內(nèi)蒙古昶輝生物科技股份有限公司，通遼 028400)

自2020年起，我國禁止在畜禽飼料中添加抗生素，因此作為抗生素替代品的各種植物添加劑的開發(fā)變得愈加重要。水飛薊素是從水飛薊干燥成熟果實(shí)中提取得到的黃酮類天然化合物，其主要成分是水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊亭和水飛薊寧[1]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素具有保護(hù)肝臟[2]、調(diào)節(jié)免疫功能[3]、抗氧化[4]以及降血脂[5]等作用。近年來，水飛薊素在養(yǎng)殖業(yè)上的用途愈加廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加100 mg/kg水飛薊素能夠調(diào)節(jié)吉富羅非魚幼魚肝臟脂肪代謝和抗氧化功能[6]，飼糧中添加1 000 mg/kg水飛薊素能夠提高黃曲霉毒素攻毒肉雞平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和平均日增重(average daily gain，ADG)[7]。黃羽肉雞是我國優(yōu)質(zhì)肉雞品類，但目前缺少水飛薊素對(duì)黃羽肉雞的作用探索。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧中添加不同劑量水飛薊素對(duì)快大型黃羽肉雞生長性能、屠宰性能、脂質(zhì)代謝和膽汁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響，從而為水飛薊素作為快大型黃羽肉雞飼料添加劑提供理論參考和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的水飛薊素由內(nèi)蒙古某生物科技股份有限公司提供，其有效成分含量≥80%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取288羽1日齡體質(zhì)健康的快大型黃羽肉雞母雛，隨機(jī)分成4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只雞。對(duì)照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，低劑量組(S250組)、中劑量組(S500組)和高劑量組(S750組)分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加250、500和750 g/t水飛薊素的飼糧。試驗(yàn)期56 d，其中1～28日齡為試驗(yàn)前期，29～56日齡為試驗(yàn)后期。

1.3 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)所用基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，參照《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)進(jìn)行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)雞采用3層籠養(yǎng)。試驗(yàn)前對(duì)雞舍進(jìn)行充分沖洗和嚴(yán)格消毒，入雛前24 h將雞舍升溫至32～35 ℃，此后溫度每周降低2～3 ℃，直至保持在22～24 ℃為止。采用連續(xù)光照、自然通風(fēng)。試驗(yàn)期舍內(nèi)光照、相對(duì)濕度和溫度根據(jù)常規(guī)飼養(yǎng)管理要求進(jìn)行控制，雞只按正常免疫程序進(jìn)行免疫。整個(gè)試驗(yàn)期雞只自由采食和飲水。

1.5 樣品采集

分別于29和57日齡(空腹8 h)，每個(gè)重復(fù)選取體重相近的1只肉雞進(jìn)行屠宰取樣。采取頸靜脈血于促凝管中，室溫放置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液分裝于離心管中，-80 ℃冰箱中保存待測。采集適量肝臟于液氮中速凍后，-80 ℃冰箱中保存待測。

1.6 測定指標(biāo)及方法

1.6.1 生長性能

每天記錄各個(gè)重復(fù)的采食量和雞只健康狀況，在1、29和57日齡，對(duì)每個(gè)重復(fù)的所有肉雞進(jìn)行稱重，計(jì)算ADFI、ADG和料重比(feed to gain ratio, F/G)。

1.6.2 屠宰性能

分別于29和57日齡(空腹8 h)，每個(gè)重復(fù)選取體重相近的1只肉雞進(jìn)行屠宰，測定屠體重、半凈膛重、全凈膛重、腹脂重、胸肌重和腿肌重，計(jì)算屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腹脂率、胸肌率和腿肌率。

1.6.3 血清脂質(zhì)代謝

采用邁瑞B(yǎng)S-200全自動(dòng)生化分析儀測定血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)(氧化酶法)、甘油三酯(triglyceride,TG)(甘油磷酸氧化酶法)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density liptein cholesterol,HDL-C)(直接法)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)(直接法)含量，試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，所有指標(biāo)嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測定

將肝臟組織與TRIzol勻漿后，按照SteadyPure通用型RNA提取試劑盒(AG21022，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)說明書操作進(jìn)行肝臟RNA提取。得到RNA后，按照Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AG11706，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)說明書操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用SYBR Green(AG11701，購自湖南艾科瑞生物工程有限公司)嵌合熒光法進(jìn)行RT-qPCR檢測。引物序列見下表2，其中以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行計(jì)算分析。

表2 RT-qPCR引物序列

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞生長性能的影響

由表3可知，與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素可以顯著提高黃羽肉雞各階段的末重、ADG以及前期ADFI(P<0.05)，并顯著降低各階段F/G(P<0.05)，但對(duì)后期和全期ADFI無顯著影響(P>0.05)。

表3 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞生長性能的影響

2.2 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞屠宰性能的影響

由表4可知，與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素對(duì)黃羽肉雞屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率均無顯著影響(P>0.05)，但飼糧中添加中、高劑量水飛薊素能顯著降低肉雞腹脂率(P<0.05)。

表4 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞屠宰性能的影響

2.3 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞血清脂質(zhì)代謝的影響

由表5可知，與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素顯著提高黃羽肉雞28日齡血清HDL-C含量(P<0.05)(S750組除外)，顯著降低28和56日齡血清LDL-C含量(P<0.05)；飼糧中添加中劑量水飛薊素顯著提高黃羽肉雞28日齡血清TG含量(P<0.05)，飼糧中添加低、中劑量水飛薊素顯著降低56日齡血清TG含量(P<0.05)。

表5 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞血清脂質(zhì)代謝的影響

2.4 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞肝臟膽汁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表6可知，與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素可以顯著降低黃羽肉雞28日齡肝臟膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，顯著提高28日齡肝臟法尼酯X受體(FXR)、膽汁酸鹽輸出泵(BSEP)和多藥耐藥蛋白2(MRP2)(S250組除外)mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，且中、高劑量比低劑量提升效果更為顯著(P<0.05)；與CON組相比，飼糧中添加水飛薊素可以顯著提高黃羽肉雞56日齡肝臟BSEP和MRP2(S250組除外)mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，飼糧中添加中、高劑量水飛薊素能顯著降低56日齡肝臟CYP7A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，飼糧中添加低、高劑量水飛薊素能顯著提高56日齡肝臟FXRmRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)。

表6 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞肝臟膽汁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

3.1 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞生長性能的影響

水飛薊素在畜牧業(yè)上的應(yīng)用逐漸廣泛，有研究表明飼糧中添加水飛薊素可以改善畜禽生長性能。何玉華等[8]在飼糧中添加20%固態(tài)發(fā)酵的水飛薊殘?jiān)嵘穗u只營養(yǎng)物質(zhì)消化率，改善了生長性能。Jahanian等[7]在飼糧中添加1 000 g/t水飛薊素改善了黃曲霉毒素攻毒肉雞腸道形態(tài)，提高了肉雞ADFI和ADG。Ahmad等[9]通過在飼糧中添加15 g/kg水飛薊緩解了夏季肉雞應(yīng)激，提高了肉雞ADFI和ADG。本試驗(yàn)中，飼糧中添加水飛薊素顯著提高了黃羽肉雞ADG，顯著降低了F/G，與前人研究結(jié)果一致，表明飼糧中添加水飛薊素可以提高黃羽肉雞生長性能。

3.2 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞屠宰性能的影響

屠宰性能是肉雞生產(chǎn)中的重要指標(biāo)，能衡量肉雞凈肉生產(chǎn)能力，也是用于評(píng)估肉類生產(chǎn)性能和動(dòng)物飼養(yǎng)效果的參數(shù)[10]。研究表明，屠宰率在80%以上、全凈膛率在60%以上，則表明肉雞凈肉生產(chǎn)率高[11-12]。本試驗(yàn)中，各組黃羽肉雞屠宰率均在88%以上，全凈膛率均在60%以上，且飼糧中添加低、中劑量水飛薊素肉雞屠宰率高達(dá)91%，低、中和高劑量水飛薊素組全凈膛率也分別比對(duì)照組提高了7.02%、4.07%和2.32%，結(jié)果表明，飼糧中添加水飛薊素可在一定程度上提高肉雞屠宰率和全凈膛率，這與王英偉[13]的研究結(jié)果類似，其在豬飼糧中添加水飛薊殘?jiān)笸涝茁侍岣吡?.38%。水飛薊素是黃酮類化合物，尤明珍[14]研究表明，大豆異黃酮主要通過降脂作用提高谷鴨屠宰率；李垚等[15]也研究表明，飼糧中添加0.2%沙棘黃酮能升高肉雞屠宰率，并且沙棘黃酮也降低了肉雞腹脂率和血清TG含量。以上研究表明，水飛薊素或是通過減少脂肪含量以提升肉雞屠宰率和全凈膛率。呂夢云[16]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加葛藤黃酮能抑制肉雞脂肪蓄積；周萍芳[17]的研究也表明，飼糧中添加苜蓿黃酮可以減少肉雞胸肌及腿肌中的脂肪積聚。與上述研究結(jié)果類似，本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加中、高劑量水飛薊素可顯著降低黃羽肉雞腹脂率。Li等[18]通過給肉雞飼喂微生物發(fā)酵水飛薊素工業(yè)生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢料證實(shí)，水飛薊素可以降低肉雞腹脂率。因此，飼糧中添加水飛薊素能降低肉雞腹脂率，改善屠宰性能，其機(jī)理可能與脂質(zhì)代謝的改善相關(guān)。

3.3 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞血清脂質(zhì)代謝的影響

血清中TG和TC含量可以反映肉雞的脂肪合成強(qiáng)度[19]。研究表明，水飛薊素及其他黃酮類化合物具有調(diào)節(jié)動(dòng)物機(jī)體脂質(zhì)代謝的作用[20-21]。本試驗(yàn)中，飼糧中添加低、中劑量水飛薊素顯著降低黃羽肉雞56日齡血清TG含量，這與Kheiripour等[22]的研究結(jié)果具有相似性，其通過建立糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn)水飛薊素能降低肝臟TG含量。蕭培珍[23]進(jìn)一步研究表明，水飛薊素通過抑制肝細(xì)胞脂肪酸合成酶(FAS)和固醇輔酶A去飽和酶1(SCD1)基因的表達(dá)以降低TG含量。此外，本試驗(yàn)中，飼糧中添加中劑量水飛薊素顯著提高黃羽肉雞28日齡血清TG含量，可能是由于前期飼養(yǎng)環(huán)境溫度偏低，水飛薊素加快脂質(zhì)代謝造成機(jī)體TG積累。HDL-C含量提高和LDL-C含量降低是拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素[24]。高潔麗[25]研究表明，水飛薊賓可提高大鼠血清HDL-C含量，降低血清LDL-C含量。Jiang等[26]也通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可降低LDL-C含量。水飛薊素可能是通過促進(jìn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)繼而調(diào)節(jié)脂蛋白含量，Vecera等[27]通過高甘油三酯血癥大鼠的代謝綜合征模型證實(shí)了這一點(diǎn)。與高潔麗[25]、Jiang等[26]的研究結(jié)果類似，本試驗(yàn)中，飼糧中添加低、中劑量水飛薊素能顯著提高黃羽肉雞28日齡血清HDL-C含量，添加3種不同劑量的水飛薊素能顯著降低28和56日齡血清LDL-C含量。因此，飼糧中添加水飛薊素能提高黃羽肉雞血清HDL-C含量，降低血清TG、LDL-C含量，改善脂質(zhì)代謝，這也證實(shí)水飛薊素能通過改善脂質(zhì)代謝繼而提升肉雞屠宰性能。

3.4 水飛薊素對(duì)黃羽肉雞肝臟膽汁酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

膽汁酸在肝臟細(xì)胞中由膽固醇合成而來，CYP7A1是其合成的關(guān)鍵限速酶[28]，F(xiàn)XR可以通過活化下游微小異源二聚體伙伴(SHP)基因負(fù)調(diào)控CYP7A1的表達(dá)[27,29]。Gu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可以激活HepG2細(xì)胞FXR，并下調(diào)其下游基因CYP7A1的表達(dá)；Suguro等[31]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓能下調(diào)非酒精性脂肪肝炎模型小鼠肝臟中CYP7A1表達(dá)；但Xiao等[32]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加100 g/t水飛薊素上調(diào)了草魚肝臟中CYP7A1 mRNA表達(dá)。以上研究表明水飛薊素調(diào)節(jié)動(dòng)物體肝臟中FXR、CYP7A1表達(dá)的作用具有物種差異。本試驗(yàn)中，飼糧中添加水飛薊素提升了黃羽肉雞28和56日齡肝臟中FXRmRNA相對(duì)表達(dá)量，降低了肝臟中CYP7A1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，表明水飛薊素可能通過調(diào)節(jié)肉雞肝臟中FXR、CYP7A1的表達(dá)以減少肝臟膽汁酸合成，而肝臟膽汁酸合成的減少可能與肝-腸循環(huán)回流至肝臟的膽汁酸含量升高有關(guān)。BSEP能將肝臟中合成的膽汁酸逆濃度梯度泵入毛細(xì)膽管[33]；MRP2是肝臟重要的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能促進(jìn)膽汁酸排泄進(jìn)腸道[34]。本試驗(yàn)中，飼糧中添加水飛薊素提升了黃羽肉雞28和56日齡肝臟中BSEP和MRP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。有研究表明，水飛薊素能恢復(fù)膽汁淤積劑造成的BSEP損傷[35]，MRP2是參與膽汁排泄水飛薊素-黃酮醇結(jié)合物的主要小管轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[36]。與前人研究一致，本試驗(yàn)中，飼糧中添加水飛薊素可以通過上調(diào)肉雞肝臟中BSEP和MRP2 mRNA表達(dá)以促進(jìn)膽汁酸排泄至腸道，這也證明本研究中添加水飛薊素使得肝臟膽汁酸合成減少，可能是由于腸道回流至肝臟的膽汁酸含量增加所致。膽汁酸代謝可對(duì)機(jī)體脂質(zhì)代謝產(chǎn)生重要影響[37]。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)代謝始終處于動(dòng)態(tài)平衡之中，脂肪組織、血清和肝臟中的脂質(zhì)水平是相互影響的[38]。本試驗(yàn)中，飼糧中添加水飛薊素能促進(jìn)肝臟膽汁酸排泄繼而減少肝臟膽汁酸合成，從而調(diào)節(jié)血清HDL-C、LDL-C和TG含量，降低腹脂率，減少肌肉中脂肪蓄積以提高肉雞屠宰率和全凈膛率。

4 結(jié) 論

飼糧中添加水飛薊素可以通過調(diào)節(jié)肝臟膽汁酸合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，改善脂質(zhì)代謝，進(jìn)而降低肉雞腹脂率并提高屠宰率和全凈膛率，并提升肉雞生長性能，其中以前期(1～28日齡)添加高劑量(750 g/t)、后期(29～56日齡)添加中劑量(500 g/t)為宜。