劉孟晨 孫貽安 李靜蔚

乳腺癌是以乳房組織中乳腺上皮細(xì)胞的增殖失控為主要表現(xiàn)的惡行異質(zhì)性疾病。有統(tǒng)計(jì)表明，僅2018年在全球范圍內(nèi)便有60多萬(wàn)人死于乳腺癌[1]，且存活的人也因焦慮[2]、放療[3]、乳房切除[4]等因素極易誘發(fā)抑郁癥等精神類疾病。因此，乳腺癌對(duì)女性群體的生命及身心健康產(chǎn)生了極大的威脅。值得注意的是，乳腺癌患者的死亡原因大多可歸咎于轉(zhuǎn)移及相關(guān)并發(fā)癥[5]。在轉(zhuǎn)移的過(guò)程，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤脫離并進(jìn)入血流[6]。這些循環(huán)腫瘤細(xì)胞最終滯留在遠(yuǎn)處器官的毛細(xì)血管床中，導(dǎo)致繼發(fā)部位產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性集落[5]。因此，可溶性因子在轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它們的變化往往能加劇乳腺癌患者病情惡化甚至死亡的風(fēng)險(xiǎn)[7]。

可溶性因子是機(jī)體內(nèi)可溶于血清的各類細(xì)胞因子，可通過(guò)增加炎性損傷、干預(yù)信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)免疫等方式參與各類疾病的發(fā)展[8]。研究表明，骨橋蛋白、表皮生長(zhǎng)因子和IL-6等可溶性因子會(huì)參與乳腺癌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的細(xì)胞相互作用[9]。成纖維細(xì)胞分泌的可溶性因子可募集單核細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)三陰性乳腺癌患者反應(yīng)性基質(zhì)的激活使其更具備侵襲性[10]。乳腺癌微環(huán)境下所分泌的可溶性因子甚至可觸發(fā)異常信號(hào)傳導(dǎo)，刺激骨微環(huán)境中的破骨細(xì)胞分化，進(jìn)而加大骨轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[11]。這些研究表明，可溶性因子極大程度參與了乳腺癌的發(fā)病進(jìn)展及預(yù)后，但大多研究并未基于整體性及系統(tǒng)性對(duì)可溶性因子的作用進(jìn)行篩選和分析。基于此，本研究擬基于癌癥基因圖譜（the cancer genome Atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌患者的基因表達(dá)等數(shù)據(jù)，探究可溶性因子在乳腺癌中的變化與影響。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)的采集 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/projects）下載乳腺癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)。刪除生存數(shù)據(jù)缺失的樣本后，通過(guò)R語(yǔ)言中的limma包對(duì)腫瘤組織與正常組織進(jìn)行差異分析，以FDR值＜0.05為條件篩選差異基因。通過(guò)基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/cards/NABA_SECRETED_FACTORS.html）下載可溶性因子數(shù)據(jù)集。并通過(guò)survival包對(duì)樣本的生存時(shí)間和生存狀態(tài)與可溶性因子基因相關(guān)表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析得到可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因。將預(yù)后相關(guān)可溶性因子數(shù)據(jù)集與TCGA中差異基因取交集后得到可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)。以熱圖和森林圖的方式對(duì)可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因的差異表達(dá)及對(duì)乳腺癌患者預(yù)后的影響進(jìn)行展示。

1.2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein inter‐action,PPI）、基因本體論（gene ontology,GO）與京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）分析 通過(guò)基因搜索工具（search tool for recurring instances of neighbouring genes,String）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/cgi/input.pl）對(duì)交集基因進(jìn)行PPI分析，并根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)中乳腺癌患者轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)計(jì)算可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因的相關(guān)性，最后通過(guò)R語(yǔ)言對(duì)可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因進(jìn)行GO、KEGG分析。

1.3 風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建及主成分分析、隨機(jī)臨近嵌入分析 Glmnet包是構(gòu)建Lasso回歸模型的重要工具，通過(guò)樣本中所有可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因的表達(dá)及危險(xiǎn)系數(shù)的乘積作為風(fēng)險(xiǎn)值為基礎(chǔ)建模。以所有樣本風(fēng)險(xiǎn)值的中位數(shù)為界限，劃分高低風(fēng)險(xiǎn)組。通過(guò)survival、survminer、timeROC包比較高低風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存差異并獲取受試者工作特征曲線。使用Rtsne包對(duì)高低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行主成分分析和T分布隨機(jī)臨近嵌入分析展現(xiàn)高低風(fēng)險(xiǎn)組基因的分布情況并進(jìn)行降維可視化。

1.4 高低風(fēng)險(xiǎn)組免疫浸潤(rùn)模式分析 基于單樣本基因富集分析（single sample GSEA,ssGSEA）的方法對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行免疫打分，并根據(jù)模型中高低風(fēng)險(xiǎn)組中可溶性因子集內(nèi)核心基因的表達(dá)進(jìn)行免疫細(xì)胞及免疫功能的差異分析。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)的分析及處理 通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)集中的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中共有1 222個(gè)乳腺癌相關(guān)樣本，其中正常樣本有113個(gè)，乳腺癌樣本1 109個(gè)。GSEA數(shù)據(jù)庫(kù)中可溶性因子基因共有343個(gè)，其中有42個(gè)基因與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)（圖1a）。將TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌患者體內(nèi)的差異基因與預(yù)后相關(guān)的可溶性因子取交集后共得到27個(gè)預(yù)后相關(guān)的可溶性因子的差異基因（圖1b），并通過(guò)森林圖（圖1c）及熱圖（圖1d）的形式展現(xiàn)交集基因的風(fēng)險(xiǎn)因素及表達(dá)。從圖1c的結(jié)果中可以看出，除FGF8及WNT11為高風(fēng)險(xiǎn)致病基因外，其他可溶性因子均對(duì)患者預(yù)后影響較小，這可能是由于眾多可溶性基因綜合作用下單基因產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)相互之間存在一定的抵消。從圖1d的結(jié)果來(lái)看，F(xiàn)GF8、WNT11、CCL23、FLT3LG、TNFSF12、IL-7、CXCL1、FGFBP1、IL-17B、S-100B、SFRP1、NRG1、IFNE、IL-4、CXCL14、IL-16、XCL1在正常組中表達(dá)明顯，但在腫瘤組中表達(dá)較低，故這些基因可能有抑癌的作用。CCL25、CCL5、CXCL13、CXCL9、IL-12B、IL-18、IL-24、LTA、LTB、TNFSF12、WNT7B等基因在正常組中表達(dá)較低但在腫瘤組中表達(dá)較高，這表明這些基因可能有抑癌的作用。

圖1 數(shù)據(jù)的分析與處理（a：42個(gè)可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因；b：可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因與差異基因的韋恩圖；c：預(yù)后相關(guān)可溶性因子森林圖；d：預(yù)后相關(guān)可溶性因子熱圖）

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖及GO、KEGG分析 PPI網(wǎng)絡(luò)圖顯示，在可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因相互間存在較強(qiáng)的相互作用（圖2a），其中相關(guān)度≥10的靶點(diǎn)為IL-7、IL-4、IL-16、CCL5、CXCL13、CXCL9、CXCL1、LTA，這表明這些靶點(diǎn)與其他基因之間具有較強(qiáng)的相互作用。相關(guān)性分析發(fā) 現(xiàn)，F(xiàn)LT3LG、CXCL9、IL-12B、IL-18、IL-24、LTA、LTB、TNFSF12的表達(dá)之間存在明顯的正相關(guān)（圖2b）。GO分析表明,可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因在生物過(guò)程中可以參與補(bǔ)體的激活，循環(huán)免疫球蛋白介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)等（圖2c）。在細(xì)胞組分中涉及免疫球蛋白復(fù)合物、免疫球蛋白復(fù)合物，循環(huán)的漿膜外側(cè)血液微粒子等。在分子功能中多涉及抗原結(jié)合、免疫球蛋白受體結(jié)合、趨化因子活性等。KEGG分析（圖2d）表明，可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因與病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號(hào)傳導(dǎo)途徑、造血細(xì)胞譜系、細(xì)胞粘附分子、NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑、Th1和Th2細(xì)胞分化、TNF信號(hào)傳導(dǎo)途徑、IL-17信號(hào)傳導(dǎo)途徑、癌癥中的PD-L1表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路、JAK-STATd等信號(hào)傳導(dǎo)途徑密切相關(guān)。

圖2 PPI、GO、KEGG分析（a：PPI分析圖；b：相關(guān)性分析圖；c：GO分析圖；d：KEGG分析圖）

2.3 風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建及主成分分析、隨機(jī)臨近嵌入分析 使用Lasso回歸分析構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，最終篩選出14個(gè)基因參與構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，風(fēng)險(xiǎn)模型計(jì)算公式為：風(fēng)險(xiǎn)值=CCL25×（-0.267 761 762 190 859）+CXCL1×（-0.0343324083608361）+CXCL13×（-0.0427683660862547）+CXCL14×（-0.0498671701605376）+FGF8×1.2580095296421+FGFBP1×（-0.0758992553296801）+FLT3LG×（-0.159 083 190 747 296）+IL-12B×（-0.088 335 107 649 380 9）+IL-24×（-0.0514706044485947）+IL-4×（-1.22386864779545）+NRG1× （-0.252 446 906 132 768 ）+S-100B×（-0.0277742304519763）+WNT11×（-0.0736641709388857）+WNT7B×0.123 111 236 484 031。

以風(fēng)險(xiǎn)值的中位數(shù)為界，將患者劃分為高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組，依據(jù)患者的分組及風(fēng)險(xiǎn)值繪制患者的生存狀態(tài)（圖3a）及風(fēng)險(xiǎn)值熱圖（圖3b）。使用主成分分析、隨機(jī)臨近嵌入分析將患者的分組信息進(jìn)行可視化（圖3c、3d）。通過(guò)比較兩組間患者的總生存率，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)患者的生存時(shí)間顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖3e，P＜0.01）。通過(guò)R語(yǔ)言繪制的ROC曲線發(fā)現(xiàn)，患者1～3年的AUC均＞0.65，這表明本模型較為可靠（圖3f）。最后通過(guò)單因素及多因素分析，發(fā)現(xiàn)可溶性因子預(yù)后相關(guān)基因的致病性與乳腺癌患者的年齡、性別、分期均顯著相關(guān)（圖3g、3h）。

圖3 風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建及主成分分析、隨機(jī)臨近嵌入分析（a：高、低風(fēng)險(xiǎn)組生存狀態(tài)圖；b：高、低風(fēng)險(xiǎn)組風(fēng)險(xiǎn)值熱圖；c：高、低風(fēng)險(xiǎn)組主成分分析圖；d：高、低風(fēng)險(xiǎn)組隨機(jī)臨近嵌入分析；e：高、低風(fēng)險(xiǎn)組生存分析；f：高、低風(fēng)險(xiǎn)組ROC曲線下面積圖；g：高、低風(fēng)險(xiǎn)組單因素Cox回歸；h：高、低風(fēng)險(xiǎn)組多因素Cox回歸）

2.4 高低風(fēng)險(xiǎn)組免疫浸潤(rùn)模式分析 通過(guò)ssGSEA對(duì)高低風(fēng)險(xiǎn)組中免疫細(xì)胞及免疫功能進(jìn)行了差異分析，研究表明可溶性因子可以很大程度上改變免疫細(xì)胞在高低風(fēng)險(xiǎn)組的評(píng)分。在高風(fēng)險(xiǎn)組中所有的免疫細(xì)胞及免疫功能評(píng)分均發(fā)生了降低。這表明aDCs、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、DCs、iDCs、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、pDCs、輔助T細(xì)胞等免疫細(xì)胞在高風(fēng)險(xiǎn)患者中自身的功能有明顯的抑制，見圖4。

圖4 高低風(fēng)險(xiǎn)組免疫浸潤(rùn)模式分析（a：高、低風(fēng)險(xiǎn)組免疫細(xì)胞差異分析；b：高、低風(fēng)險(xiǎn)組免疫功能分析；**P＜0.01）

3 討論

可溶性因子是人體內(nèi)各類免疫細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞分泌的具有高度誘導(dǎo)性細(xì)胞因子，深度參與了乳腺癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移、惡化等過(guò)程[12]。

本研究表明，可溶性因子能通過(guò)多種途徑影響乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。如CXCL1、CXCL9、CXCL13、CX‐CL14等可通過(guò)影響機(jī)體的免疫反應(yīng)在乳腺癌中發(fā)揮作用。其中CXCL1是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌的最豐富的趨化因子，可以將各種基質(zhì)細(xì)胞募集到腫瘤環(huán)境中，構(gòu)建促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、血管生成和轉(zhuǎn)移的環(huán)境[13]。CXCL9可通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的豐度，進(jìn)而干預(yù)乳腺癌的發(fā)展[14]。CXCL13是重要的趨化因子之一，B淋巴細(xì)胞聚集的標(biāo)志物，在B淋巴細(xì)胞的歸巢、遷移和積累中起關(guān)鍵作用[15]。中性粒細(xì)胞被認(rèn)為是提供抵御入侵病原體的主要免疫細(xì)胞，它們的募集在很大程度上被CXCL1和CXCL2等可溶性因子所誘導(dǎo)[16-17]。CCL5可募集T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等各類免疫細(xì)胞[18-19]，這與本研究后續(xù)免疫浸潤(rùn)分析的結(jié)果高度重合。CCL5還可通過(guò)PI3K/Akt通路激活αvβ3整合素以促進(jìn)細(xì)胞遷移，而αvβ3整合素又能激活I(lǐng)KKα/β和NF-κB通路形成聯(lián)機(jī)反應(yīng)[20]。當(dāng)然，其他白介素家族所導(dǎo)致的炎癥損傷也不能被忽視。有研究表明，IL-4由巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，可控制T輔助細(xì)胞的成熟，IL-4誘導(dǎo)的谷氨酰胺代謝對(duì)乳腺癌的生長(zhǎng)有較大的刺激作用[21]。IL-7最近參與了產(chǎn)生IL-17A的先天性樣T細(xì)胞的選擇性擴(kuò)增和功能，包括自然殺傷T細(xì)胞和Th17細(xì)胞[22-23]。此外，IL-7水平與前列腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[24-25]，與乳腺癌患者的腫瘤侵襲性正相關(guān)[26]。還有研究表明，F(xiàn)GF8作為一種可調(diào)節(jié)乳腺癌生長(zhǎng)的一種可溶性生長(zhǎng)因子，可通過(guò)調(diào)控類固醇激素的分泌影響乳腺癌的預(yù)后[27]。這些研究均顯示可溶性因子自身具有較高的致病性，而本研究基于這些關(guān)鍵基因作為預(yù)后模型在后續(xù)的驗(yàn)證中也表現(xiàn)出極強(qiáng)的特異性。

更重要的是，可溶性因子不僅自身具有一定致病性，還可以與其他因子的相互作用下形成聯(lián)級(jí)反應(yīng)。KEGG結(jié)果中，可溶性因子所涉及的NF-κB、Th1/Th2、PD-L1/PD-1等通路均與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，乳腺癌中NF-κB的激活可上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）和c-Myc[28-30]的表達(dá)，從而加速細(xì)胞周期進(jìn)程并導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控。NF-κB還調(diào)節(jié)IL-1β、TNFα、EGFR和HER2等可溶性因子的分泌以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[31]。NF-κB 活性的下降能改變Bcl-2[32]、IAP蛋白（XIAP、cIAP-1/2）[32]和 TNF 受體相關(guān)因子（TRAF）1/2[33]等細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致抗凋亡和促存活基因的上調(diào)并抑制對(duì)化療藥物的細(xì)胞凋亡反應(yīng)。Th1/Th2的平衡也影響著乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。人體內(nèi)幼稚的CD4+T細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子刺激下分化為Th1和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞產(chǎn)生具有抗癌活性的IFN-γ和IL-12。Th2細(xì)胞介導(dǎo)體液免疫并產(chǎn)生IL-4和IL-10。與Th1反應(yīng)相反，Th2反應(yīng)實(shí)際上可以促進(jìn)癌癥進(jìn)程。Th2細(xì)胞分泌的IL-4抑制IFN-γ的分泌[34]。IL-10可下調(diào)Th1細(xì)胞的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生[35]。因此Th1/Th2的平衡會(huì)極大影響著乳腺癌患者腫瘤微環(huán)境的狀況。PD-1/PD-L1是一個(gè)免疫檢查點(diǎn)，被認(rèn)為是乳腺癌治療的重要靶點(diǎn)。PD-1與其配體PD-L1結(jié)合，限制T細(xì)胞活性，并使乳腺癌細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)[36-37]。在正常情況下，PD-1/PD-L1通路通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)防止過(guò)度刺激并維持對(duì)自身抗原的免疫耐受，相反，PD-L1在乳腺癌中過(guò)度表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中的免疫功能受損[38]。故這些可溶性因子可能是通過(guò)影響這些信號(hào)傳導(dǎo)干預(yù)乳腺癌的進(jìn)展。

綜上所述，可溶性因子影響著乳腺癌患者的預(yù)后。它們自身對(duì)乳腺癌組織的損傷及相互間的聯(lián)級(jí)反應(yīng)是推動(dòng)乳腺癌發(fā)展的重要因素。此外，可溶性因子還對(duì)乳腺癌患者的免疫功能產(chǎn)生了重要影響。但這此過(guò)程所涉及的因素較多，故本文并未詳細(xì)論述。后續(xù)課題組將在嚴(yán)格執(zhí)行倫理審查的情況下廣泛收集臨床病理樣本，通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序等手段明確可溶性因子對(duì)各類免疫細(xì)胞的影響。