易永祥 唐晨野 沈瑞林 郭曉 湯志靈

炎癥與腫瘤關系密切，目前認為由細菌或病毒感染引起的炎癥可能會促進腫瘤發(fā)生，同時在腫瘤發(fā)展的大多數(shù)階段也可能起著關鍵作用，包括增殖、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等[1]。炎癥在膀胱癌（bladder cancer,BC）發(fā)生和進展過程中同樣被認為是一種重要的因素[2]，但其內(nèi)在機制尚未完全闡明。脂多糖（lipopoly‐saccharide,LPS）是革蘭陰性桿菌細胞壁的組成成分，是一種致炎因子，其通過作用于配體Toll樣受體4（toll-like receptor 4,TLR4）促進細胞內(nèi)NOD樣受體熱蛋白結(jié)構域相關蛋白3（nucleotide binding oligomeriza‐tion-like receptor family pyrin domain containing 3,NL‐RP3）基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生物學活性。本研究通過觀察LPS及NLRP3的特異性抑制劑MCC950對BC5637細胞增殖活力、侵襲遷移及相關因子表達的影響，來闡釋炎癥在BC發(fā)展過程中一種潛在的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 人BC5637細胞購自中國科學院上海細胞庫；LPS（LPG-38-01）購自深圳欣博盛生物科技有限公司；MCC950（HY-12815）購自美國 MCE 公司；CCK-8試劑盒（40203ES60）、RT-PCR試劑盒（11202ES08）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Transwell侵襲小室（3422）購自美國Corning公司；NLRP3（19771-1-AP）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metallopeptidase-2，MMP-2）（10373-2-AP）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-2，MMP-9）（27306-1-AP）、鈣黏蛋白E（E-cadhjerin）（20874-1-AP）、波形蛋白（Vimentin）（10366-1-AP）、GAPDH（10494-1-AP）抗體均購自于美國proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將凍存的5637細胞于37℃水浴融化后移入EP管，離心后取上清液，加入新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%FBS），置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至對數(shù)期時，用于后續(xù)實驗。

1.2.2 實驗分組及處理 將生長至對數(shù)期的5637細胞按50×104個/孔接種至6孔板中，當細胞貼壁生長且匯聚達到80%時加入不同藥物，分為4組，分別為LPS組、MCC950組、LPS/MCC950組及空白對照組。藥物濃度為 LPS（100 μg/ml）、MCC950（1 μmol/L），藥物作用時間12 h，然后分別提取各組細胞進行實驗。

1.2.3 CCK-8實驗 將4組細胞分別按5×103個/孔種植在96孔板中，每孔加入90 μl培養(yǎng)基，繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于第24、48、72、96 h時采用酶標儀檢測選定孔的450 nm處光密度（optical density,OD）值，OD值可反映細胞增殖活力，檢測前2 h需加入CCK-8溶液。

1.2.4 Transwell侵襲實驗 將Matrigel基質(zhì)膠提前1 d鋪在Transwell小室內(nèi)，放置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)待用。收集4組細胞，調(diào)整細胞濃度為5×104個/ml，接種100 μl細胞懸液于Transwell小室內(nèi)，24 h后取出小室并用PBS清洗2遍，加入4%甲醛溶液室溫固定20 min，PBS清洗3遍，結(jié)晶紫染色5 min，用棉簽去除小室內(nèi)細胞，PBS再次清洗2遍，晾干后采用倒置顯微鏡隨機選擇5個視野拍照并計算細胞侵襲數(shù)目。相對侵襲率=觀察組細胞侵襲數(shù)/對照組平均細胞侵襲數(shù)×100%。

1.2.5 細胞劃痕實驗 將4組細胞分別按104個/孔種植于24孔板中，用25 μl的消毒槍頭從上至下在24孔板中央做垂直劃痕，再用無血清PBS清洗3遍以除去劃下的懸浮細胞，分別在劃痕后即刻及24 h采用倒置顯微鏡觀察細胞的遷移情況并拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件測量兩個時間點細胞未覆蓋的面積。劃痕愈合率=[1-（24 h的劃痕面積/開始的劃痕面積）]×100%。

1.2.6 qRT-PCR 按照TRIzol法的相關步驟分別提取4組細胞的總RNA，進行RNA純度和完整度鑒定并取500 ng進行逆轉(zhuǎn)錄，將取得的cDNA用作實時定量PCR的模板。設計并合成MMP-2、E-cadherin、Vimentin、NLRP3及內(nèi)參照GAPDH的引物序列詳見表1。在ABI7500（Applied Biosystems）PCR儀上進行操作，采用RQ=2-ΔΔCt法計算上述基因的相對表達量。

表1 各基因的引物序列

1.2.7 Western blot 使用RIPA裂解液分別提取4組細胞的總蛋白，紫外分光光度計測定蛋白濃度，將蛋白樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合后上樣，經(jīng)過轉(zhuǎn)膜及5%脫脂牛奶+TBST封閉，加入一抗稀釋液，4℃雜交過夜，PBS清洗3遍后加入二抗稀釋液室溫孵育1 h，滴加化學發(fā)光液后顯影、掃描，對感光膠片條帶進行灰度值測定，以目的條帶與內(nèi)參照條帶GAPDH的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計作圖。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS和MCC950對5637細胞增殖活力的影響 圖1和表2顯示，在24、48、72、96 h 4個時間點，4組之間的OD值均不全相同或全不相同，差異有統(tǒng)計學意義；LPS組的OD值均顯著高于空白對照組和MCC950組，MCC950組在24、48 h兩個時間點的OD值顯著低于空白對照組；LPS/MCC950組在4個時間點的OD值均顯著低于LPS組。LPS增強5637細胞增殖活力的作用可被MCC950抑制，說明LPS可能通過刺激NLRP3表達來增強5637細胞的增殖活力。

圖1 CCK-8實驗檢測LPS和MCC950對5637細胞增殖的影響

表2 4組細胞各時間點的450 nm OD值比較

2.2 LPS和MCC950對5637細胞侵襲能力的影響 空白對照組、LPS組、MCC950組、LPS/MCC950組的相對侵襲率分別為（100.00±14.43）%、（150.00±8.33）%、（100.00±22.05）%、（111.10±9.62）%，總體上具有統(tǒng)計學差異（F=7.89，P＜0.01）。圖2顯示，LPS組的侵襲率顯著高于空白對照組和MCC950組；LPS/MCC950組的侵襲率顯著低于LPS組。LPS促進5637細胞侵襲的作用可被MCC950抑制，說明LPS可能通過刺激NLRP3表達來增加5637細胞的侵襲能力。

圖2 Transwell侵襲實驗檢測LPS和MCC950對5637細胞侵襲能力的影響（a：結(jié)晶紫染色，×10；b：4組間相對侵襲率的兩兩比較，*P＜0.05）

2.3 LPS和MCC950對5637細胞遷移能力的影響 空白對照組、LPS組、MCC950組、LPS/MCC950組的24 h劃痕愈合率分別為（50.23±1.95）%、（60.87±1.99）%、（39.82±2.89）%、（48.27±0.64）%，總體上具有統(tǒng)計學差異（F=54.40，P＜0.01）。圖3顯示，LPS組的劃痕愈合率顯著高于空白對照組和MCC950組；MCC950組的劃痕愈合率顯著低于空白對照組；LPS/MCC950組的劃痕愈合率顯著低于LPS組并高于MCC950組。LPS促進5637細胞遷移的作用可被MCC950抑制，說明LPS可能通過刺激NLRP3表達來增加5637細胞的遷移能力。

圖3 細胞劃痕實驗檢測LPS和MCC950對5637細胞遷移能力的影響（a：細胞劃痕圖，×4；b：4組間24 h劃痕愈合率的比較，**P＜0.01）

2.4 LPS和MCC950對5637細胞侵襲遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關因子及NLRP3表達的影響 4組的MMP-2、E-cadherin、Vimentin、NLRP3 mRNA相對表達量均不全相同或全不相同，差異有統(tǒng)計學意義（F=109.80、6.63、133.50和9.67，均P＜0.05）。圖4顯示，LPS組的 MMP-2、Vi‐mentin、NLRP3 mRNA表達量均顯著高于空白對照組和MCC950組，E-cadherin mRNA表達量則顯著低于空白對照組和MCC950組；MCC950組的MMP-2 mRNA表達量顯著低于空白對照組；LPS/MCC950組的MMP-2、Vimentin、NLRP3 mRNA表達量顯著低于LPS組，E-cadherin mRNA表達量則顯著高于LPS組。4組的MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin、NLRP3蛋白相對表達量均不全相同或全不相同，差異均有統(tǒng)計學意義（F=9.72、41.26、190.60、224.30和38.23，均P＜0.05）。圖5顯示，LPS組的MMP-2、MMP-9、NLRP3蛋白表達量均顯著高于對照組和MCC950組，E-cadherin蛋白表達量則顯著低于對照組和MCC950組；MCC950組的MMP-2、MMP-9、Vimentin、NLRP3蛋白表達量均顯著低于對照組，E-cadherin蛋白表達量則顯著高于對照組；LPS/MCC950組的MMP-9、Vimentin、NLRP3蛋白表達量均顯著低于LPS組，E-cadherin蛋白表達量則顯著高于LPS組。LPS可顯著上調(diào)5637細胞NLRP3 mRNA和蛋白表達，同時影響侵襲遷移及EMT相關因子的表達，但這些效應均可被MCC950抑制，證實LPS可通過誘導NLRP3表達來促進5637細胞侵襲遷移及EMT。

圖4 qRT-PCR檢測LPS和MCC950對5637細胞侵襲遷移、EMT相關因子及NLRP3 mRNA表達的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖5 Western blot檢測LPS和MCC950對5637細胞侵襲遷移、EMT相關蛋白及NLRP3蛋白表達的影響（a：蛋白條帶圖；b：4組間各蛋白相對表達量的兩兩比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

LPS可以通過病原相關分子模式（pathogen associ‐ated molecular pattern，PAMP）結(jié)合 TLR4/髓樣分化蛋白-2復合體觸發(fā)TLR4信號通路，激活NF-κB，使其組成部分p65出現(xiàn)磷酸化和核易位，進一步觸發(fā)NLRP3轉(zhuǎn)錄并激活NLRP3炎癥小體[3-5]，也可以通過激活Cas‐pase-11，切割gasdermin D產(chǎn)生氨基末端片段，以細胞固有的方式激活NLRP3炎癥小體[6]，從而引起炎癥反應。LPS可用于構建神經(jīng)炎、肺炎、膿毒癥等炎癥模型[7-9]，也可用于模擬腫瘤細胞所處的炎癥微環(huán)境[10-11]。本研究同樣采用LPS處理5637細胞以模擬炎癥微環(huán)境，研究炎癥對BC細胞侵襲遷移的影響。

NLRP3蛋白屬于NOD樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor,NLR）蛋白家族，由熱蛋白結(jié)構域（pyrin domain,PYD）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構域（nucleotide-binding and oligomerization do‐main,NACHT）及富含亮氨酸重復序列（leucine-rich repeats,LRR）3部分組成[12]。NLRP3炎癥小體是目前研究最為廣泛和深入的炎癥小體之一，主要在巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞等炎癥和免疫相關的細胞中表達，也可在多數(shù)腫瘤細胞中表達[13]，其可介導IL-1β、IL-18等促炎細胞因子分泌，在調(diào)節(jié)炎癥反應和免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要的作用[14]。通過調(diào)控NLRP3觀察BC細胞侵襲遷移能力的變化可以很好地闡明炎癥影響B(tài)C進展的一種可能的機制。

本研究表明LPS可顯著增強5637細胞的增殖活力，促進其侵襲遷移及EMT，同時本研究也觀察到NL‐RP3 mRNA和蛋白表達上調(diào)，據(jù)此推測在炎癥微環(huán)境中BC細胞的侵襲及遷移能力增加，而其中NLRP3炎癥小體可能發(fā)揮著重要的作用。本研究采用MCC950處理5637細胞，發(fā)現(xiàn)NLRP3蛋白的表達被顯著抑制。MCC950是一種含有二芳基磺酰脲的化合物，可以直接與NLRP3的NACHT結(jié)構域內(nèi)的Walker B基序相互作用，從而阻斷ATP水解并抑制NLRP3活化及炎癥小體形成，而且對NLRP1、NLRC4、AIM2等其它炎癥小體的激活沒有影響，因此MCC950被認為是NLRP3的強效特異性抑制劑[15-16]。本研究將MCC950與LPS共同作用于5637細胞，發(fā)現(xiàn)MCC950可顯著抑制LPS對5637細胞產(chǎn)生的效應，這就證實了LPS可通過誘導NLRP3表達來促進BC細胞侵襲遷移的機制。

近年來，許多研究同樣表明NLRP3炎癥小體具有促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。在結(jié)直腸癌中，腫瘤周圍組織的巨噬細胞高表達NLRP3，激活NLRP3可增強結(jié)直腸癌細胞的體外遷移和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力[17]。在食管癌中，NLRP3與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關，過表達NLRP3顯著促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移，而沉默則產(chǎn)生相反效應[18]。在乳腺癌中，NLRP3在高侵襲亞型中表達異常上調(diào)，且可以通過Caspase-1依賴的方式誘導IL-1β自分泌以促進EMT和轉(zhuǎn)移[19]。由于NLRP3炎癥小體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用逐步得到證實，目前已作為潛在的抗腫瘤治療靶點受到關注[20]。

綜上所述，本研究采用LPS處理BC細胞以模擬炎癥微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)LPS可通過誘導NLRP3表達來促進BC細胞侵襲與遷移。NLRP3炎癥小體可能是炎癥狀態(tài)下促進BC進展的重要因子。我們還需通過動物實驗和進一步的機制研究加以論證。