易永祥 唐晨野 沈瑞林 郭曉 湯志靈

炎癥與腫瘤關(guān)系密切，目前認(rèn)為由細(xì)菌或病毒感染引起的炎癥可能會(huì)促進(jìn)腫瘤發(fā)生，同時(shí)在腫瘤發(fā)展的大多數(shù)階段也可能起著關(guān)鍵作用，包括增殖、血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移等[1]。炎癥在膀胱癌（bladder cancer,BC）發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中同樣被認(rèn)為是一種重要的因素[2]，但其內(nèi)在機(jī)制尚未完全闡明。脂多糖（lipopoly‐saccharide,LPS）是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的組成成分，是一種致炎因子，其通過(guò)作用于配體Toll樣受體4（toll-like receptor 4,TLR4）促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（nucleotide binding oligomeriza‐tion-like receptor family pyrin domain containing 3,NL‐RP3）基因轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮生物學(xué)活性。本研究通過(guò)觀察LPS及NLRP3的特異性抑制劑MCC950對(duì)BC5637細(xì)胞增殖活力、侵襲遷移及相關(guān)因子表達(dá)的影響，來(lái)闡釋炎癥在BC發(fā)展過(guò)程中一種潛在的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 人BC5637細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；LPS（LPG-38-01）購(gòu)自深圳欣博盛生物科技有限公司；MCC950（HY-12815）購(gòu)自美國(guó) MCE 公司；CCK-8試劑盒（40203ES60）、RT-PCR試劑盒（11202ES08）購(gòu)自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Transwell侵襲小室（3422）購(gòu)自美國(guó)Corning公司；NLRP3（19771-1-AP）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metallopeptidase-2，MMP-2）（10373-2-AP）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-2，MMP-9）（27306-1-AP）、鈣黏蛋白E（E-cadhjerin）（20874-1-AP）、波形蛋白（Vimentin）（10366-1-AP）、GAPDH（10494-1-AP）抗體均購(gòu)自于美國(guó)proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的5637細(xì)胞于37℃水浴融化后移入EP管，離心后取上清液，加入新鮮RPMI1640完全培養(yǎng)基（含10%FBS），置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的5637細(xì)胞按50×104個(gè)/孔接種至6孔板中，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)且匯聚達(dá)到80%時(shí)加入不同藥物，分為4組，分別為L(zhǎng)PS組、MCC950組、LPS/MCC950組及空白對(duì)照組。藥物濃度為 LPS（100 μg/ml）、MCC950（1 μmol/L），藥物作用時(shí)間12 h，然后分別提取各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將4組細(xì)胞分別按5×103個(gè)/孔種植在96孔板中，每孔加入90 μl培養(yǎng)基，繼續(xù)置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于第24、48、72、96 h時(shí)采用酶標(biāo)儀檢測(cè)選定孔的450 nm處光密度（optical density,OD）值，OD值可反映細(xì)胞增殖活力，檢測(cè)前2 h需加入CCK-8溶液。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel基質(zhì)膠提前1 d鋪在Transwell小室內(nèi)，放置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)待用。收集4組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，接種100 μl細(xì)胞懸液于Transwell小室內(nèi)，24 h后取出小室并用PBS清洗2遍，加入4%甲醛溶液室溫固定20 min，PBS清洗3遍，結(jié)晶紫染色5 min，用棉簽去除小室內(nèi)細(xì)胞，PBS再次清洗2遍，晾干后采用倒置顯微鏡隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照并計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)目。相對(duì)侵襲率=觀察組細(xì)胞侵襲數(shù)/對(duì)照組平均細(xì)胞侵襲數(shù)×100%。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將4組細(xì)胞分別按104個(gè)/孔種植于24孔板中，用25 μl的消毒槍頭從上至下在24孔板中央做垂直劃痕，再用無(wú)血清PBS清洗3遍以除去劃下的懸浮細(xì)胞，分別在劃痕后即刻及24 h采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的遷移情況并拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量?jī)蓚€(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞未覆蓋的面積。劃痕愈合率=[1-（24 h的劃痕面積/開始的劃痕面積）]×100%。

1.2.6 qRT-PCR 按照TRIzol法的相關(guān)步驟分別提取4組細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行RNA純度和完整度鑒定并取500 ng進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將取得的cDNA用作實(shí)時(shí)定量PCR的模板。設(shè)計(jì)并合成MMP-2、E-cadherin、Vimentin、NLRP3及內(nèi)參照GAPDH的引物序列詳見表1。在ABI7500（Applied Biosystems）PCR儀上進(jìn)行操作，采用RQ=2-ΔΔCt法計(jì)算上述基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 各基因的引物序列

1.2.7 Western blot 使用RIPA裂解液分別提取4組細(xì)胞的總蛋白，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混合后上樣，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜及5%脫脂牛奶+TBST封閉，加入一抗稀釋液，4℃雜交過(guò)夜，PBS清洗3遍后加入二抗稀釋液室溫孵育1 h，滴加化學(xué)發(fā)光液后顯影、掃描，對(duì)感光膠片條帶進(jìn)行灰度值測(cè)定，以目的條帶與內(nèi)參照條帶GAPDH的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS和MCC950對(duì)5637細(xì)胞增殖活力的影響 圖1和表2顯示，在24、48、72、96 h 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，4組之間的OD值均不全相同或全不相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LPS組的OD值均顯著高于空白對(duì)照組和MCC950組，MCC950組在24、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值顯著低于空白對(duì)照組；LPS/MCC950組在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的OD值均顯著低于LPS組。LPS增強(qiáng)5637細(xì)胞增殖活力的作用可被MCC950抑制，說(shuō)明LPS可能通過(guò)刺激NLRP3表達(dá)來(lái)增強(qiáng)5637細(xì)胞的增殖活力。

圖1 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LPS和MCC950對(duì)5637細(xì)胞增殖的影響

表2 4組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)的450 nm OD值比較

2.2 LPS和MCC950對(duì)5637細(xì)胞侵襲能力的影響 空白對(duì)照組、LPS組、MCC950組、LPS/MCC950組的相對(duì)侵襲率分別為（100.00±14.43）%、（150.00±8.33）%、（100.00±22.05）%、（111.10±9.62）%，總體上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=7.89，P＜0.01）。圖2顯示，LPS組的侵襲率顯著高于空白對(duì)照組和MCC950組；LPS/MCC950組的侵襲率顯著低于LPS組。LPS促進(jìn)5637細(xì)胞侵襲的作用可被MCC950抑制，說(shuō)明LPS可能通過(guò)刺激NLRP3表達(dá)來(lái)增加5637細(xì)胞的侵襲能力。

圖2 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LPS和MCC950對(duì)5637細(xì)胞侵襲能力的影響（a：結(jié)晶紫染色，×10；b：4組間相對(duì)侵襲率的兩兩比較，*P＜0.05）

2.3 LPS和MCC950對(duì)5637細(xì)胞遷移能力的影響 空白對(duì)照組、LPS組、MCC950組、LPS/MCC950組的24 h劃痕愈合率分別為（50.23±1.95）%、（60.87±1.99）%、（39.82±2.89）%、（48.27±0.64）%，總體上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=54.40，P＜0.01）。圖3顯示，LPS組的劃痕愈合率顯著高于空白對(duì)照組和MCC950組；MCC950組的劃痕愈合率顯著低于空白對(duì)照組；LPS/MCC950組的劃痕愈合率顯著低于LPS組并高于MCC950組。LPS促進(jìn)5637細(xì)胞遷移的作用可被MCC950抑制，說(shuō)明LPS可能通過(guò)刺激NLRP3表達(dá)來(lái)增加5637細(xì)胞的遷移能力。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LPS和MCC950對(duì)5637細(xì)胞遷移能力的影響（a：細(xì)胞劃痕圖，×4；b：4組間24 h劃痕愈合率的比較，**P＜0.01）

2.4 LPS和MCC950對(duì)5637細(xì)胞侵襲遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)因子及NLRP3表達(dá)的影響 4組的MMP-2、E-cadherin、Vimentin、NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均不全相同或全不相同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=109.80、6.63、133.50和9.67，均P＜0.05）。圖4顯示，LPS組的 MMP-2、Vi‐mentin、NLRP3 mRNA表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組和MCC950組，E-cadherin mRNA表達(dá)量則顯著低于空白對(duì)照組和MCC950組；MCC950組的MMP-2 mRNA表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組；LPS/MCC950組的MMP-2、Vimentin、NLRP3 mRNA表達(dá)量顯著低于LPS組，E-cadherin mRNA表達(dá)量則顯著高于LPS組。4組的MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin、NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量均不全相同或全不相同，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.72、41.26、190.60、224.30和38.23，均P＜0.05）。圖5顯示，LPS組的MMP-2、MMP-9、NLRP3蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組和MCC950組，E-cadherin蛋白表達(dá)量則顯著低于對(duì)照組和MCC950組；MCC950組的MMP-2、MMP-9、Vimentin、NLRP3蛋白表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，E-cadherin蛋白表達(dá)量則顯著高于對(duì)照組；LPS/MCC950組的MMP-9、Vimentin、NLRP3蛋白表達(dá)量均顯著低于LPS組，E-cadherin蛋白表達(dá)量則顯著高于LPS組。LPS可顯著上調(diào)5637細(xì)胞NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)影響侵襲遷移及EMT相關(guān)因子的表達(dá)，但這些效應(yīng)均可被MCC950抑制，證實(shí)LPS可通過(guò)誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)來(lái)促進(jìn)5637細(xì)胞侵襲遷移及EMT。

圖4 qRT-PCR檢測(cè)LPS和MCC950對(duì)5637細(xì)胞侵襲遷移、EMT相關(guān)因子及NLRP3 mRNA表達(dá)的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖5 Western blot檢測(cè)LPS和MCC950對(duì)5637細(xì)胞侵襲遷移、EMT相關(guān)蛋白及NLRP3蛋白表達(dá)的影響（a：蛋白條帶圖；b：4組間各蛋白相對(duì)表達(dá)量的兩兩比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

LPS可以通過(guò)病原相關(guān)分子模式（pathogen associ‐ated molecular pattern，PAMP）結(jié)合 TLR4/髓樣分化蛋白-2復(fù)合體觸發(fā)TLR4信號(hào)通路，激活NF-κB，使其組成部分p65出現(xiàn)磷酸化和核易位，進(jìn)一步觸發(fā)NLRP3轉(zhuǎn)錄并激活NLRP3炎癥小體[3-5]，也可以通過(guò)激活Cas‐pase-11，切割gasdermin D產(chǎn)生氨基末端片段，以細(xì)胞固有的方式激活NLRP3炎癥小體[6]，從而引起炎癥反應(yīng)。LPS可用于構(gòu)建神經(jīng)炎、肺炎、膿毒癥等炎癥模型[7-9]，也可用于模擬腫瘤細(xì)胞所處的炎癥微環(huán)境[10-11]。本研究同樣采用LPS處理5637細(xì)胞以模擬炎癥微環(huán)境，研究炎癥對(duì)BC細(xì)胞侵襲遷移的影響。

NLRP3蛋白屬于NOD樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor,NLR）蛋白家族，由熱蛋白結(jié)構(gòu)域（pyrin domain,PYD）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding and oligomerization do‐main,NACHT）及富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeats,LRR）3部分組成[12]。NLRP3炎癥小體是目前研究最為廣泛和深入的炎癥小體之一，主要在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥和免疫相關(guān)的細(xì)胞中表達(dá)，也可在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)[13]，其可介導(dǎo)IL-1β、IL-18等促炎細(xì)胞因子分泌，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫微環(huán)境中發(fā)揮重要的作用[14]。通過(guò)調(diào)控NLRP3觀察BC細(xì)胞侵襲遷移能力的變化可以很好地闡明炎癥影響B(tài)C進(jìn)展的一種可能的機(jī)制。

本研究表明LPS可顯著增強(qiáng)5637細(xì)胞的增殖活力，促進(jìn)其侵襲遷移及EMT，同時(shí)本研究也觀察到NL‐RP3 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)，據(jù)此推測(cè)在炎癥微環(huán)境中BC細(xì)胞的侵襲及遷移能力增加，而其中NLRP3炎癥小體可能發(fā)揮著重要的作用。本研究采用MCC950處理5637細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NLRP3蛋白的表達(dá)被顯著抑制。MCC950是一種含有二芳基磺酰脲的化合物，可以直接與NLRP3的NACHT結(jié)構(gòu)域內(nèi)的Walker B基序相互作用，從而阻斷ATP水解并抑制NLRP3活化及炎癥小體形成，而且對(duì)NLRP1、NLRC4、AIM2等其它炎癥小體的激活沒有影響，因此MCC950被認(rèn)為是NLRP3的強(qiáng)效特異性抑制劑[15-16]。本研究將MCC950與LPS共同作用于5637細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MCC950可顯著抑制LPS對(duì)5637細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)，這就證實(shí)了LPS可通過(guò)誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)來(lái)促進(jìn)BC細(xì)胞侵襲遷移的機(jī)制。

近年來(lái)，許多研究同樣表明NLRP3炎癥小體具有促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。在結(jié)直腸癌中，腫瘤周圍組織的巨噬細(xì)胞高表達(dá)NLRP3，激活NLRP3可增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外遷移和體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力[17]。在食管癌中，NLRP3與Ki-67增殖指數(shù)呈正相關(guān)，過(guò)表達(dá)NLRP3顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，而沉默則產(chǎn)生相反效應(yīng)[18]。在乳腺癌中，NLRP3在高侵襲亞型中表達(dá)異常上調(diào)，且可以通過(guò)Caspase-1依賴的方式誘導(dǎo)IL-1β自分泌以促進(jìn)EMT和轉(zhuǎn)移[19]。由于NLRP3炎癥小體在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用逐步得到證實(shí)，目前已作為潛在的抗腫瘤治療靶點(diǎn)受到關(guān)注[20]。

綜上所述，本研究采用LPS處理BC細(xì)胞以模擬炎癥微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)LPS可通過(guò)誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)來(lái)促進(jìn)BC細(xì)胞侵襲與遷移。NLRP3炎癥小體可能是炎癥狀態(tài)下促進(jìn)BC進(jìn)展的重要因子。我們還需通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和進(jìn)一步的機(jī)制研究加以論證。