夏虹 馬書云 張文 張培培 陳雨婷 陳紅波 馬紅珍

特發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropa‐thy,IMN）是一種以腎小球足細(xì)胞為抗原介導(dǎo)的免疫性疾病，最終導(dǎo)致免疫復(fù)合物形成并沉積于基底膜、補(bǔ)體激活和大量蛋白尿[1]。目前已確定的IMN靶抗原包括磷脂酶A2受體（phospholipase A2 receptor,PLA2R）、血小板反應(yīng)蛋白7A（thrombospondin domain-containing 7A,THSD7A）、神經(jīng)表皮生長因子樣1蛋白（neural epi‐dermal growth factor-like 1 protein,NELL-1）、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1,NCAM-1）、信號肽3B（semaphorin 3B,SEMA3B）、高溫重組蛋白A1（high temperature recombinant protein A1,HTRA1）、原鈣黏附蛋白（protocadherin 7,PCDH7）以及未知抗原（5%～10%）[2]。IMN病理特點(diǎn)是免疫球蛋白G（immunoglobu‐lin G,IgG）呈顆粒狀沉積于基底膜上皮側(cè)，多數(shù)患者可伴有補(bǔ)體系統(tǒng)成分沉積，少數(shù)患者同時可見免疫球蛋白M（immunoglobulin M,IgM）和免疫球蛋白A（immu‐noglobulin A,IgA）沉積。抗PLA2R抗體和抗THSD7A抗體以IgG4亞類為主[3-4]，NELL-1相關(guān)IMN患者產(chǎn)生的最豐富的IgG亞類是IgG1[5]。目前也有證據(jù)證明補(bǔ)體激活是IMN發(fā)病的潛在機(jī)制[6-7]。而部分IMN患者存在的腎小球IgM沉積是否參與IMN的發(fā)病以及對其臨床病理特征及轉(zhuǎn)歸是否存在影響目前尚未完全明確?；诖?，本研究回顧性分析IMN患者伴腎小球毛細(xì)血管襻IgM沉積的臨床病理特征，探討IgM沉積在IMN中的臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年5月至2022年2月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的IMN患者133例，均經(jīng)腎穿刺活檢確診。其中男73例，女60例，男女比例1.2∶1。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）腎穿刺活檢診斷為IMN，且光鏡下每個切面腎小球數(shù)目＞10個，免疫熒光下腎小球數(shù)目＞3個；（2）病理免疫熒光染色顯示毛細(xì)血管襻IgG沉積++或以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除腫瘤、風(fēng)濕免疫性疾病（如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)性血管炎等）、感染性腎炎（如乙肝相關(guān)性腎炎、丙型肝炎、梅毒等）、明確腎毒性用藥史或重金屬暴露史、糖尿病腎病等已知繼發(fā)性膜性腎病患者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 （1）患者基本信息：年齡、性別、病程（指從出現(xiàn)腎病相關(guān)癥狀如浮腫，或從明確檢查出尿檢異常及腎功能異常到腎穿刺活檢時）、高血壓病史、基礎(chǔ)血壓。（2）實驗室檢查資料：入院腎穿刺活檢當(dāng)日時或腎穿刺活檢前1周內(nèi)清晨空腹檢查時的24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、血尿酸、估算的腎小球濾過率（eGFR）、血漿白蛋白、血清TC、TG、LDL、IgA、IgM、IgG 和補(bǔ)體 3（complement 3,C3）、C4水平。eGFR采用EPI公式計算。高血壓定義為在未用降血壓藥物情況下，既往或住院期間存在2次或2次以上收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg。（3）腎穿刺后相關(guān)資料：隨訪時間（從腎穿刺活檢時開始計算）、是否使用免疫抑制劑、緩解情況及檢驗資料。

1.2.2 治療方案 根據(jù)IMN患者腎功能進(jìn)展分層風(fēng)險決定具體治療方案，包括僅僅觀察及評估，或給予利妥昔單抗、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、環(huán)磷酰胺、糖皮質(zhì)激素等單藥或聯(lián)合用藥治療方案[8]。

1.2.3 病情緩解標(biāo)準(zhǔn) 患者24 h尿蛋白量≤0.3 g、血清白蛋白水平≥35 g/L定義為完全緩解；24 h尿蛋白量＞0.3 g且＜3.5 g，較基線水平下降≥50%，且血清白蛋白水平≥30 g/L，定義為部分緩解；否則定義為未緩解[9]。

1.2.4 腎組織處理及病理觀察指標(biāo) 經(jīng)患者腎穿刺活檢獲得的腎組織經(jīng)石蠟包埋，切片厚度約1.5～2 μm，行HE染色、糖原（periodic acid-schiff,PAS）染色、過碘酸六胺銀染色（periodic acid-silver metheramine,PASM）和馬松（Masson）染色；腎組織經(jīng)OCT包埋后，制作冷凍切片，厚度約4～5 μm，按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行免疫熒光染色；將染色好的光鏡切片及冷凍切片分別進(jìn)行光學(xué)顯微鏡和免疫熒光顯微鏡檢查。采用半定量法記錄免疫熒光沉積強(qiáng)度，0、+、++、+++、++++代表熒光強(qiáng)度從陰性到最強(qiáng)，記錄為0、1、2、3、4，≥0.5+（±）即定義為陽性。腎小管萎縮程度記錄方法：0、+、++、+++代表腎小管萎縮面積從小到大，記錄為0、1、2、3，0表示萎縮面積≤5%，1表示萎縮面積＞5%且≤25%，2表示萎縮面積＞25%且≤50%，3表示萎縮面積＞50%。

1.3 觀察指標(biāo) 根據(jù)IMN患者腎小球IgM是否沉積分為IgM陽性組與陰性組。（1）比較IgM陽性組與IgM陰性組患者臨床病理特征；（2）分析IMN患者IgM沉積情況與臨床病理特征的相關(guān)性；（3）比較IgM陽性組與IgM陰性組患者IgG亞型、PLA2R及THSD7A沉積情況；（4）分析IMN患者IgM沉積情況與IgG1沉積強(qiáng)度的相關(guān)性；（5）比較IgM陽性組與IgM陰性組患者預(yù)后；（6）分析IMN患者疾病未緩解的危險因素。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料以用M（P25，P75）表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。采用Kaplan-Meier生存分析分析兩組患者疾病緩解情況；IMN患者疾病未緩解的危險因素分析采用Cox回歸。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IgM陽性組與IgM陰性組患者臨床病理特征比較 IgM陽性組患者97例（72.9%），陰性組患者36例（27.1%）。陽性組男性患者占比大于IgM陰性組（P＜0.05），血清TG水平低于IgM陰性組（P＜0.05）。兩組患者年齡、病程、收縮壓、舒張壓、高血壓病史、腎穿刺前使用過免疫抑制劑占比、24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、血尿酸、eGFR、血清白蛋白、血清TC、TG、LDL、血IgA、血IgM、血IgG、血C3及血C4等指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。IgM陽性組IgG、C3沉積強(qiáng)度均高于IgM陰性組（均P＜0.05）。兩組患者腎小球球性硬化比例、腎小管萎縮程度、IgA沉積強(qiáng)度及C1q沉積強(qiáng)度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 IgM陽性組與IgM陰性組患者臨床病理特征比較

2.2 IMN患者IgM沉積與否與臨床病理特征的相關(guān)性分析 分析133例IMN患者的性別分布、血清TG水平、IgG沉積強(qiáng)度、C3沉積強(qiáng)度與IgM沉積與否的相關(guān)性，結(jié)果顯示IMN患者腎小球IgM沉積與血清TG水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與其余指標(biāo)未見明顯相關(guān)性，見表2。

表2 IMN患者IgM沉積與否與臨床病理特征的相關(guān)性分析

2.3 IgM陽性組與IgM陰性組患者IgG亞型、PLA2R及THSD7A沉積強(qiáng)度比較 133例IgM患者中68例完成了IgG亞型、PLA2R及THSD7A的免疫熒光檢查，其中THSD7A均為陰性。IgM陽性組與IgM陰性組患者IgG1沉積強(qiáng)度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而IgG2、IgG3、IgG4、PLA2R沉積強(qiáng)度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表3。

表3 IgM陽性組與IgM陰性組患者IgG亞型、PLA2R及THSD7A沉積強(qiáng)度比較

2.4 IMN患者IgM沉積與否與IgG1沉積強(qiáng)度的相關(guān)性分析 Spearman秩相關(guān)分析IgG1沉積強(qiáng)度與IgM沉積與否的相關(guān)性，結(jié)果顯示IMN患者IgM沉積與IgG1沉積強(qiáng)度呈正相關(guān)（r=0.269，P＜0.05）。

2.5 IgM陽性組與IgM陰性組患者預(yù)后比較 133例患者中72例患者隨訪資料完整，隨訪時間為腎穿刺活檢后6.7（5，12）個月，包括IgM陽性組51例、陰性組21例。其中20例（27.78%）完全緩解，19例（26.39%）部分緩解，33例（45.83%）患者未緩解。采用Kaplan-Meier生存分析比較兩組患者累積緩解率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Breslowχ2=2.144，P＜0.05）。見圖1。

圖1 IgM陽性組與IgM陰性組患者累積緩解率比較（Kaplan-Meier生存分析）

2.6 IMN患者疾病未緩解危險因素分析 將疾病未緩解定義為結(jié)局事件，單因素Cox回歸分析顯示，有高血壓病史、血清TG水平、腎小管萎縮程度與IMN患者疾病未緩解相關(guān)。進(jìn)一步多因素Cox回歸分析顯示，血甘油三酯水平高、腎小管萎縮程度重是IMN患者疾病未緩解的獨(dú)立危險因素（均P＜0.05）。見表4。

表4 IMN患者疾病未緩解危險因素分析

3 討論

本研究結(jié)果顯示，IMN患者中IgM陽性組男性居多，且具有較低的血清TG水平，且IgM沉積與TG水平呈負(fù)相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)IgM陽性組和IgM陰性組之間的腎臟累積緩解率無統(tǒng)計學(xué)差異，這與Xu等[10]的研究結(jié)果一致，該項研究中還提到IgM沉積是每年eGFR下降≥5 ml/（min·1.73 m2）的獨(dú)立危險因素。本研究只探討了IgM沉積對腎臟緩解率的影響，沒有在隨訪過程中對腎功能進(jìn)展進(jìn)行單獨(dú)的分析。本研究發(fā)現(xiàn)IgM沉積不是IMN患者疾病緩解的獨(dú)立危險因素，其臨床意義還需要更多的大樣本、多中心研究進(jìn)一步驗證。本研究沒有發(fā)現(xiàn)IgM陽性組與IgM陰性組患者血清IgM水平存在差異，而有研究表明IgM腎病患者的血清IgM水平更高[11]，提示兩種疾病發(fā)病機(jī)制的差異性。

IgM是初次體液免疫應(yīng)答早期階段產(chǎn)生的主要免疫球蛋白，它的分子量是五類免疫球蛋白中最大的，同時也是人體循環(huán)系統(tǒng)中最大的抗體。IgM可激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，是補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)的初始激活劑。除了IgG，IgM沉積于IMN患者的毛細(xì)血管襻也比較常見。腎小球內(nèi)其他類型免疫復(fù)合物（IgM、IgA、C1q）的沉積通常被認(rèn)為是繼發(fā)性膜性腎病的特征[12]。然而在臨床實踐中，筆者發(fā)現(xiàn)許多抗PLA2R抗體陽性的IMN患者腎小球內(nèi)也有IgM沉積。本組患者中IgM沉積陽性率高達(dá)72.93%，潛在的機(jī)制及意義不能通過是血液中的IgM外滲通過腎小球濾過屏障而沉積這一簡單的假設(shè)來完全解釋。Panzer等[13]在小鼠非硬化性和非免疫性復(fù)雜腎小球疾病模型中，鑒定出與腎小球表位結(jié)合并促進(jìn)腎小球損害進(jìn)展的特異性IgM抗體。Strassheim等[14]在阿霉素誘導(dǎo)的局灶節(jié)段性腎小球硬化的動物模型中發(fā)現(xiàn)，低滲休克耗竭腹膜B細(xì)胞可以在不影響血清總IgM的情況下阻止腎小球IgM的沉積。本研究發(fā)現(xiàn)IgM陽性組IgG和C3沉積情況存在差異，盡管兩者與IgM沉積與否無明顯相關(guān)性，進(jìn)一步IgG亞型分析提示IgM沉積與IgG1沉積強(qiáng)度呈正相關(guān)。這提示IgM和補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷可能是原發(fā)性腎臟遭受攻擊后發(fā)生的繼發(fā)性現(xiàn)象。

目前已經(jīng)明確的與IMN病理生理學(xué)機(jī)制有關(guān)的抗原的抗體除了IgG4，還有IgG1。從抗PLA2R-Ab陽性的原發(fā)性膜性腎病患者中純化的IgG4在體外發(fā)現(xiàn)能結(jié)合凝集素，誘導(dǎo)人足細(xì)胞細(xì)胞骨架改變[15]。盡管IgG4不能通過經(jīng)典途徑有效地激活補(bǔ)體，但幾乎100%的IMN患者存在C4d沉積[16]。血漿補(bǔ)體激活片段的測定進(jìn)一步表明，補(bǔ)體系統(tǒng)在IMN患者中被激活[17]。這進(jìn)一步提示IMN中補(bǔ)體經(jīng)典途徑同樣被激活，上述已經(jīng)提到IgM可激活補(bǔ)體經(jīng)典途徑，這可能意味著IgM激活的補(bǔ)體經(jīng)典途徑在IMN也發(fā)揮了一定的作用，是否存在IgM針對的足細(xì)胞抗原，需要研究者大膽的假設(shè)和驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)使用免疫抑制劑治療不是影響腎臟預(yù)后的獨(dú)立危險因素，且腎穿刺前使用免疫抑制劑對IgM沉積與否沒有影響。Kanemoto等[18]在一項研究中評估了IgM對特發(fā)性腎病綜合征轉(zhuǎn)歸的意義，該研究包括105例患者（IgM沉積陽性30例、沉積陰性40例），不論特發(fā)性腎病綜合征是何種病理亞型，研究認(rèn)為IgM沉積與類固醇耐藥有關(guān)。本研究樣本量有限，相關(guān)的結(jié)果需要多中心、前瞻性研究去驗證。

綜上所述，腎小球IgM沉積與否與IMN患者的臨床病理特征有一定相關(guān)性。IgM沉積不是疾病緩解的獨(dú)立危險因素。筆者推測IgM可能與腎小球損傷的抗原表位結(jié)合，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)參與IMN發(fā)生、發(fā)展。