楊 樂(lè)，張創(chuàng)娟，程 斌，冷 艷，李師翁

（蘭州交通大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，蘭州 730070）

果膠甲酯酶（PME）廣泛存在于高等植物中，在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和防御等過(guò)程中起著重要作用.在植物中，PME是一個(gè)由多基因組成的大基因家族，如擬南芥、水稻、番茄、油菜和棉花分別有66、43、79、110和80個(gè)PME基因［1-7］.通常分為兩種類型（Ⅰ型和Ⅱ型），Ⅰ型在N端含有Pro區(qū)，Ⅱ型不帶Pro區(qū)［8-9］.有學(xué)者研究了擬南芥幼苗PME的表達(dá)譜，僅有15%的PME高表達(dá)，其余基因在任何生長(zhǎng)階段均未表達(dá)［10］.也有學(xué)者研究了亞麻和棉花中的PME表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)纖維發(fā)育特異性表達(dá)相關(guān)的PMEs［11-12］.PMEs可能在植物非生物脅迫中起作用，例如，當(dāng)植物受到Cd脅迫時(shí)，細(xì)胞壁纖維素含量降低，半纖維素含量升高，導(dǎo)致細(xì)胞壁孔隙度和厚度變小，可使Cd2+滯留在細(xì)胞壁間，果膠含量和PME酶活性在這一過(guò)程中起作用［13］.然而，目前對(duì)于PME在植物重金屬脅迫中的作用及其機(jī)制還缺乏系統(tǒng)研究，開(kāi)展系統(tǒng)研究十分必要.

鎘（Cd）是一種廣泛存在且對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染的重金屬，其高水溶性對(duì)生物具有嚴(yán)重的毒害作用.Cd會(huì)通過(guò)胞質(zhì)間隙和管狀纖維殘留在植物體中［13］，通過(guò)食物鏈和食物網(wǎng)進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，也會(huì)對(duì)人造成嚴(yán)重的危害.豆科植物因其能形成根瘤菌的特性，在土壤重金屬污染植物修復(fù)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì).綠豆是世界上廣泛種植的重要的豆科作物，開(kāi)展其重金屬耐受性及其對(duì)重金屬脅迫響應(yīng)的研究具有理論和實(shí)踐價(jià)值.本人所在課題組前期已開(kāi)展了綠豆幼苗期對(duì)Cd脅迫響應(yīng)的生理生化與分子機(jī)制研究［14-16］，本研究聚焦于PMEs，對(duì)綠豆PMEs進(jìn)行全基因組鑒定，采用生物信息學(xué)方法分析PMEs系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、理化性質(zhì)等.運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)PMEs表達(dá)譜及其響應(yīng)Cd脅迫的表達(dá)譜進(jìn)行研究，并對(duì)Cd脅迫下PME酶活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果將為PME基因在響應(yīng)重金屬的毒害作用層面和基因工程應(yīng)用層面提供科學(xué)資料.

1 材料與方法

1.1 植物材料培養(yǎng)

用10%次氯酸鈉溶液浸泡新鮮的綠豆種子15 min，無(wú)菌水沖洗，在培養(yǎng)箱中于25±1℃浸種36 h，播種于滅菌的珍珠巖：蛭石（1∶1）的育苗盤(pán)［14］，25±1℃光照培養(yǎng)箱（PAR為0.1 mol·m-2·s-1）中14 h光周期培養(yǎng)5 d.

1.2 植物材料處理

將上述培養(yǎng)的幼苗分為兩組，每組至少包括三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，處理組施以終濃度0.1 mol/L CdCl2的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液［15］，對(duì)照組施以1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每皿分別施加營(yíng)養(yǎng)液70 mL在相同的條件下繼續(xù)培養(yǎng).以施加營(yíng)養(yǎng)液的時(shí)間為基準(zhǔn)，分別于培養(yǎng)的1、5、9天取根、莖、葉各1 g組織，液氮速凍，保存在-80℃冷藏備用.

1.3 RNA分離和表達(dá)譜分析

總RNA提取和cDNA文庫(kù)制備按照我們之前研究中描述的方法進(jìn)行［7，17］，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司IlluminaHiseq 2000平臺(tái)完成.基因表達(dá)譜用TBtools中的Heatmap Illustrator制作熱圖［18］.基因表達(dá)量以基因表達(dá)量以TPM（transcripts per kilobase per million mapped reads）值表示.

1.4 果膠甲酯酶活性的測(cè)定

取1 g綠豆樣品于預(yù)冷研缽中，加入等體積（w／v）提取緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl，pH=7.5，0.5 mol/L NaCl）研磨成勻漿，4℃12 000 rpm離心10 min，收集上清液用于所有酶測(cè)定.在試管中加入4 mL 0.5% （w／v）果膠溶液和0.3 mL 0.01% （w／v）溴酚藍(lán)［19］，然后加入300μL酶液.2 min后記錄樣品的吸光度并計(jì)算酶活性（ΔA620/min·g·FW）［2，18］，每個(gè)樣品重復(fù)3次.

1.5 綠豆PME基因家族的鑒定

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載綠豆全基因組及注釋文件信息，篩選綠豆PME基因，從EnsemblPlant數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//plants.ensembl.org/index.html）檢索擬南芥（Arabidopsis thaliana）PME參考基因，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)得到大豆（Glycine max）基因組注釋文件和蛋白質(zhì)序列文件［20］.

使用基于隱馬爾可夫模型（HMMER）（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmsc an）的工具對(duì)得到的綠豆PME蛋白質(zhì)序列進(jìn)行檢索，Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org）進(jìn)行蛋白序列的結(jié)構(gòu)域分析.

1.6 PMEs蛋白分析

使用PSROT（https：//www.genscript.com/psort.html）軟件的WoLFPSORTII（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)PME蛋白的亞細(xì)胞定位［21］，ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）軟件預(yù)測(cè)PME蛋白的分子量和等電點(diǎn)，MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線工具獲取基因結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)［22］，Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，TBtools軟件［18］獲取基因家族分析結(jié)果及可視化，參數(shù)設(shè)置最大motif 6，最小和最大寬度為50和100，其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值［23］.MEMESuite（5.0.5）進(jìn)行PME的保守基序掃描，ExPASYPROTPARAM工具（http：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行PME基因的基因表達(dá)譜分析及可視化［21］.

2 結(jié)果

2.1 綠豆PMEs基因鑒定及蛋白特征

通過(guò)與擬南芥直系同源比對(duì)分析，從綠豆基因組中鑒定出80個(gè)PME基因家族成員，根據(jù)先前報(bào)道的命名規(guī)則［24］，將其命名為VrPME01-VrPME80.對(duì)應(yīng)的UniProt基因ID和蛋白質(zhì)基本特征及亞細(xì)胞定位列于表1.綠豆PMEs蛋白序列長(zhǎng)度介于131～634 aa，分子量為14 550～6 270 Da，等電點(diǎn)（PIs）為4.74～9.73.亞細(xì)胞預(yù)測(cè)將PMEs定位于細(xì)胞壁、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜和葉綠體中，其中定位于細(xì)胞質(zhì)外基質(zhì)的PMEs最多（39個(gè)）.綠豆的PME基因包含兩種類型，52個(gè)（VrPME01～VrPME53，除VrPME48外）為N端含有Pro區(qū)的Ⅰ型，26個(gè)（VrPME54～Vr-PME80，除VrPME75和VrPME78）屬于Ⅱ型.

表1 綠豆PME蛋白質(zhì)特征Tab.1 Characteristics of the PME protein of mung bean

續(xù)上表

2.2 綠豆PMEs基因結(jié)構(gòu)

對(duì)3個(gè)物種PME的motif和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，91%的PME包含相同的6個(gè)保守基序，同源關(guān)系較近的成員具有相似的外顯子及內(nèi)含子，其他PME基因的外顯子之間大小存在一定差異，72.5%的VrPMEs含有2～3個(gè)內(nèi)含子，其中VrPME45和VrPME79只有1個(gè)內(nèi)含子，25%VrPME含有4～5個(gè)內(nèi)含子（見(jiàn)圖1（c））.保守結(jié)構(gòu)域分析表明，Vr-PME01～VrPME53（VrPME48除外）具有PMEI域，而VrPME54～VrPME80（除VrPME75和VrPME78外）不包含PMEI域（見(jiàn)圖2）.

圖1 綠豆PMEs親緣關(guān)系（a）、保守motif（b）和基因結(jié)構(gòu)（c）Fig.1 Phylogenetic relationship（a），conserved motif（b），and structure of mung bean PMEs（c）

圖2 綠豆PME蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 Domains of mung bean PME proteins

2.3 綠豆PMEs基因表達(dá)譜

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示80個(gè)綠豆PMEs中只有17個(gè)在根、莖和葉中表達(dá)，如圖3所示，綠豆中Vr-PMEs的表達(dá)量基本呈現(xiàn)根＞莖＞葉.其中，Vr-PME16和VrPME11基因在根中的表達(dá)量最高，且在第1天VrPME16和VrPME11表達(dá)量TPM值分別高達(dá)444.9和197.8；在第9天分別為177.7和37.1；VrPME11和VrPME12在莖中的表達(dá)量最高，且在第1天VrPME11和VrPME12基因表達(dá)量分別為260.3和49.8；在葉中表達(dá)量最高的基因是VrPME06，在第5天表達(dá)量最高為94.16（TPM），其他基因的表達(dá)量均在10以下.此外，VrPME66在莖和葉中均表達(dá)，但在根中未表達(dá).

圖3 綠豆PMEs在根、莖和葉中的表達(dá)譜Fig.3 Expression pattern of mung bean PMEs in root，stem，and leaf tissues

2.4 Cd脅迫對(duì)Vr PMEs表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)錄組分析表明，100μmol/L Cd處理下，綠豆PME家族成員的表達(dá)存在較大差異（見(jiàn)圖4）.在根中，Cd處理顯著上調(diào)了VrPME16、VrPME21和Vr-PME25，平均上調(diào)倍數(shù)為3.52；顯著下調(diào)了14個(gè)基因，平均下調(diào)倍數(shù)為1.89倍，其中VrPME03、Vr-PME06、VrPME07、VrPME10和VrPME12顯著下調(diào)表達(dá)，平均下調(diào)3.78倍；

圖4 Cd脅迫下綠豆PMEs表達(dá)的變化Fig.4 Changes in expression level of mung bean PMEs in response to Cd stress

在莖中，Cd處理顯著上調(diào)了VrPME11和Vr-PME16，平均上調(diào)倍數(shù)為2.69倍，其中VrPME16顯著上調(diào)4.44倍；顯著下調(diào)了14個(gè)基因，平均下調(diào)倍數(shù)為1.43.

在葉中，Cd處理上調(diào)了8個(gè)基因，平均上調(diào)倍數(shù)為0.37；下調(diào)了8基因，平均下倍數(shù)為0.91.其中，VrPME10在Cd脅迫葉中未表達(dá).雖然葉片中上調(diào)基因的個(gè)數(shù)最多，但最大上調(diào)基因VrPME25在第1 d被上調(diào)2.32倍，其他基因的上調(diào)倍數(shù)均較小.上述結(jié)果表明，Cd脅迫對(duì)綠豆根和莖中PMEs表達(dá)影響最大，而對(duì)葉中PME表達(dá)影響最小.

2.5 Cd脅迫對(duì)綠豆幼苗PME酶活性的影響

為了進(jìn)一步了解Cd脅迫下VrPMEs表達(dá)變化是否與酶活性變化相關(guān)，本文對(duì)PME酶活性進(jìn)行了測(cè)定.結(jié)果表明，在根中，Cd處理組和對(duì)照組PME酶活性都隨生長(zhǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，Cd處理后的PME酶活性在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)均升高，平均升高1.25倍.在第1 d、5 d、9 d PME酶活性分別比對(duì)照提高了的6%、32%倍和85%倍（見(jiàn)圖5（a））.在莖中，Cd處理第1 d和5 d PME酶活性分別比對(duì)照降低了的0.5%和13%，第9 d比對(duì)照提高了18%（見(jiàn)圖5（b））.在葉中，Cd處理第1 d、5 d PME酶活性分別比對(duì)照降低了的1%、23%和30% （見(jiàn)圖5（c））.上述結(jié)果表明，Cd脅迫顯著升高根中PME酶活性，而降低葉中PME活性，短期（1天）Cd脅迫幾乎不改變莖和葉中PME活性，長(zhǎng)期（9天）Cd脅迫升高根和莖中PME酶活性.根中PME酶活性參與了對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)，這一結(jié)果與Cd脅迫對(duì)Vr-PMEs表達(dá)的影響基本一致.

圖5 Cd脅迫對(duì)綠豆根、莖和葉中PME酶活性的影響Fig.5 Effects of Cd stress on the activity of PME enzyme in root，stem，and leaf tissues

3 討論

本次研究從綠豆基因組中鑒定了80個(gè)PME基因，已有研究在擬南芥［3-4］、大豆［25］、水稻［7］、番茄［4］和棉花［2］基因組中分別鑒定出66、124、59、79和80個(gè)PME基因.顯然，不同物種PME家族基因數(shù)量差異較大，綠豆具有較多的PME家族基因數(shù).PME蛋白的預(yù)測(cè)表明，VrPME蛋白的肽鏈長(zhǎng)度、等電點(diǎn)和分子量等差異較大.亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，綠豆PME蛋白分布于不同的細(xì)胞器中，包括細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜、葉綠體等，這一結(jié)果與PME蛋白在葡萄中亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果有所不同，在葡萄中部分PME蛋白在線粒體中也有表達(dá)，但在葉綠體中未表達(dá)［26］.這說(shuō)明了PME蛋白在細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜中能發(fā)揮穩(wěn)定的生物學(xué)功能.

大多數(shù)VrPME是保守蛋白，且所有蛋白含有PMEI保守結(jié)構(gòu)域.大部分VrPMEs含有2～3個(gè)外顯子，只有少部分基因含有4～6個(gè)數(shù)外顯子，這與棉花PME基因所呈現(xiàn)出的結(jié)果完全一致［27］.綜上，PME在基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)出具有相對(duì)穩(wěn)定的進(jìn)化方向，其功能具有穩(wěn)定性.

PME由高爾基體合成并釋放到細(xì)胞壁中，催化甲基酯化及果膠脫甲酯化［28］.PME在細(xì)胞壁的形成和果膠的重塑中起重要作用［8］.研究發(fā)現(xiàn)PME基因在植物生長(zhǎng)中起重要作用.在本研究中，轉(zhuǎn)錄組揭示17個(gè)VrPMEs在綠豆根、莖和葉中表達(dá)（見(jiàn)圖3），其表達(dá)量呈現(xiàn)根＞莖＞葉.VrPME66具有組織特異性，在莖和葉中表達(dá)，但在根中未表達(dá).在擬南芥的發(fā)育過(guò)程中，編碼PME的At4g02330主要在花組織、柱頭、微管組織和花粉粒中表達(dá)［3］，編碼PME的At2g47550可能參與花粉和花粉管的發(fā)育，而At4g02330可能參與細(xì)胞壁的果膠代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞分離和花瓣脫落［3］；葡萄中，大多數(shù)PME存在于漿果和卷須中，并在花序中高度表達(dá)［29-30］，PMEs呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)模式，可能與PMEs的擴(kuò)增、進(jìn)化以及植物生長(zhǎng)發(fā)育的復(fù)雜性有關(guān)［17］.本文分析了17個(gè)VrPMEs對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)，結(jié)果表明，Cd脅迫下，在根、莖和葉中被顯著上調(diào)的基因數(shù)量分別為3、3和8個(gè)，平均上調(diào)倍數(shù)分別為3.25、1.8和0.37.其中VrPME06、VrPME21和VrPME25在根中被強(qiáng)烈上調(diào)，在根中被顯著上調(diào)的基因且都屬于Type-1，Vr-PME16在莖中顯著上調(diào)4.44倍（見(jiàn)圖4）.Hongo等［31］發(fā)現(xiàn)Ⅰ型PME AtPME35（At3g59010）通過(guò)介導(dǎo)皮層細(xì)胞和纖維束間的初級(jí)細(xì)胞壁去甲基酯化來(lái)加強(qiáng)擬南芥莖的功能，AtPME35的特異性表達(dá)是莖機(jī)械強(qiáng)度所必需的.VrPME16、VrPME21和VrPME25的pI為8.9、8.61和8.87，與AtPME35 pI 8.70相近，因此它們也可能具有類似于AtPME35的去甲基酯化活性.VrPME16、PtoPME35和AtPME35的氨基酸序列高度相似.楊樹(shù)PtoPME35在干旱脅迫的莖中高度表達(dá)［32］.這些證據(jù)表明組織特異性表達(dá)對(duì)于PME響應(yīng)非生物脅迫功能多樣性非常重要.這為果膠不僅在初級(jí)細(xì)胞壁中起作用，而且在次級(jí)細(xì)胞壁中起作用提供了新的證據(jù).

Cd脅迫使綠豆根中PME酶活平均升高了25%（見(jiàn)圖5（a）），而莖中酶活性平均只升高了0.5%（見(jiàn)圖5），表明根中PME酶在響應(yīng)Cd脅迫中起作用，而莖和葉中PME酶對(duì)Cd脅迫不響應(yīng).并且鎘脅迫根中PME酶活性在第1天最大，隨著Cd脅迫的時(shí)間推移，PME酶活性逐漸降低，這與鹽脅迫對(duì)擬南芥PME酶活性影響一致［33］.有研究發(fā)現(xiàn)一定濃度Al3+刺激水稻PME酶活性升高［34］，低溫脅迫導(dǎo)致擬南芥和油菜（Brassica napus L.）PME酶活性升高［35-36］.此外，Al、Pb和Cu脅迫均導(dǎo)致水稻PME酶活性顯著提高，果膠含量顯著上升，果膠甲酯化程度顯著降低的趨勢(shì)［37］.這些結(jié)果表明，重金屬脅迫導(dǎo)致植物PME酶活性升高，強(qiáng)調(diào)PME基因及其酶在植物響應(yīng)重金屬中起重要作用.綜上所述，PME在植物響應(yīng)非生物脅迫中的功能及其機(jī)制仍有待揭示.

4 結(jié)論

基因組和轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明，PME基因不僅在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育中起重要功能，而且通過(guò)改變細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能植物響應(yīng)非生物脅迫中起重要作用.在植物響應(yīng)重金屬Cd脅迫中，根PME基因及其酶具有更為直接的作用，而莖和葉PME基因及其酶僅為弱響應(yīng).