袁 博,卜 偉,戴威威,鞠秀云,王 欣,*
(1.江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131;2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 徐州 221116)
紫甘薯是甘薯()的一種紫色品種,是重要的經(jīng)濟作物,可作為糧食、飼料和工業(yè)原料使用,具有重要的產(chǎn)業(yè)地位。研究表明,紫甘薯塊根提取物具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖等作用,可用于預(yù)防心血管疾病和糖尿病,保健功能開發(fā)價值極高。
紫甘薯中含有多種重要的活性成分,如花色苷、多酚、黃酮和多糖。其中多糖是具有抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、降血糖等功效的一類天然生物大分子,也是食品中重要的功能因子之一。研究開發(fā)紫甘薯多糖,探究其活性機制是目前紫甘薯多糖研究領(lǐng)域熱點問題。Sun Jian等從紫甘薯中分離獲得一種堿溶性多糖,研究表明其具有調(diào)節(jié)腸道微生物和抗炎癥的活性。Tang Chao等從紫甘薯中分離獲得一種可以調(diào)節(jié)免疫力的多糖,研究表明其可以增強小鼠體內(nèi)免疫球蛋白A等免疫蛋白的表達水平。此外,紫甘薯多糖還在抗氧化、抗腫瘤、益生和護肝方面具有重要的應(yīng)用潛力。
由于氧化因子的存在,細胞內(nèi)會因氧化和抗氧化作用失衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生,細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累過量時會破壞細胞內(nèi)生物大分子,如造成蛋白質(zhì)氧化和DNA損傷,最終導(dǎo)致機體產(chǎn)生病理變化。目前,對于細胞氧化損傷的研究主要集中于測定氧化損傷過程中關(guān)鍵酶(如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalyse,CAT)和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px))活力以及脂質(zhì)氧化產(chǎn)物(丙二醛(malonaldehyde,MDA))的含量以評價氧化應(yīng)激的水平。
本研究以紫甘薯為原料,通過高速逆流色譜技術(shù)分離獲得一種水溶性多糖,通過高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)和氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)分別鑒定其單糖組成和糖苷鍵構(gòu)型;利用HO構(gòu)建細胞氧化應(yīng)激模型,以評估紫甘薯多糖的抗氧化特性;同時通過代謝組學(xué)闡釋紫甘薯多糖抗氧化的代謝機制,以期為紫甘薯多糖的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
紫甘薯(‘徐紫薯8號’)采自江蘇徐州,洗凈、切塊、低溫烘干備用。
鼠李糖(rhamnose,Rha)、葡萄糖(glucose,Glc)、甘露糖(mannose,Man)、半乳糖(galactose,Gal)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid,GlcA)(純度均大于98%) 上海源葉生物科技有限公司;乙腈、甲醇、氯化鈉(均為色譜純)和其余試劑(均為分析純) 國藥集團化學(xué)試劑有限公司;100T-500T ROS測定試劑盒(化學(xué)熒光法)、CAT測定試劑盒(可見光法)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力測定試劑盒等均購自南京建成生物工程研究所。
AB Triple 4600高分辨液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(liquid chromatography-time of flight mass chromatography,LC-TOF MS)、4500三重四極桿液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometer,LC-MS/MS) 美國AB SCIEX公司;7890A-5975C GC-MS儀 美國安捷倫科技公司;OptiChromeA-600高速逆流色譜儀 江陰逆流科技有限公司。
1.3.1 紫甘薯多糖提取
稱取風(fēng)干紫甘薯塊1 kg,以料液比1∶10(/)加入蒸餾水超聲提取30 min,過濾,反復(fù)操作3 次,合并提取液。調(diào)節(jié)pH值為4,向提取液中加入終質(zhì)量分數(shù)2%纖維素酶(10 000 U/g),室溫水解2 h,然后加入終質(zhì)量分數(shù)2%酸性蛋白酶解液(≥45 U/mg)繼續(xù)水解1 h。減壓旋蒸濃縮多糖提取液至原有體積的1/3后加入一定體積的體積分數(shù)95%乙醇溶液至乙醇終體積分數(shù)為75%,靜置過夜,3 000 r/min下離心,棄去上清液得沉淀。65 ℃水浴減壓濃縮除去乙醇,加超純水溶解,冷凍干燥獲得紫甘薯粗多糖(polysaccharide from purple sweet potato,PSPP)。利用Sevag法去除PSPP中的蛋白質(zhì):取PSPP溶于蒸餾水中(1∶10,/),按體積比4∶1加入氯仿-正丁醇混合溶液(4∶1,/),混合后,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,振蕩、靜置、分層,取上層水相溶液按體積比繼續(xù)加入氯仿-正丁醇混合溶液后萃取。反復(fù)3~4 次,直至上層溶液在250~280 nm波長處無吸收峰,冷凍干燥獲得去除蛋白的PSPP。
1.3.2 紫甘薯多糖的分離純化
配制甲醇-甲基叔丁基醚-水混合溶液(3∶1∶2,/),靜置過夜,下層為流動相,上層為固定相。使用高壓泵將上層相以1 mL/min的速率泵入高速逆流色譜儀中,當出口出現(xiàn)液體后,開啟高速逆流色譜儀,轉(zhuǎn)速為10 000 r/min,轉(zhuǎn)向為正向,柱溫30 ℃。利用高壓泵將下層相泵入高速逆流色譜儀中(1 mL/min)中,穩(wěn)定60 min。取1 g凍干PSPP,使用5 mL下層相溶劑溶解,使用針泵注入PSPP溶液,開啟自動接收器,使用示差檢測器進行監(jiān)測。取吸收峰對應(yīng)的接受試管樣品,冷凍干燥,分別獲得純化多糖PSPP01、PSPP02、PSPP03和PSPP04。采用DPPH自由基清除能力測定試劑盒測定DPPH自由基清除率,篩選抗氧化活性最大的多糖,結(jié)果顯示只有PSPP03具有較明顯的DPPH自由基清除活性,故以PSPP03進行后續(xù)實驗。
1.3.3 PSPP03分子質(zhì)量測定及傅里葉變換紅外光譜分析
利用高效液相凝膠色譜(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)法進行分子質(zhì)量分析,色譜柱為OHpak SB-804HQ柱(8.0 mm×300 mm,10 μm),流動相為0.1 mol/L NaSO,流速為0.5 mL/min,柱溫35 ℃,采用示差檢測器檢測。以分子質(zhì)量為4 300、20 000、44 100、63 000 Da和123 500 Da的葡聚糖為標準品,以保留時間和葡聚糖標準品分子質(zhì)量的對數(shù)進行擬合,得到線性回歸方程,根據(jù)標準曲線方程計算PSPP03的分子質(zhì)量。
采用傅里葉變換紅外光譜對多糖結(jié)構(gòu)信息進行表征:取約10 mg樣品按質(zhì)量比1∶200加入溴化鉀,充分研磨后,放入壓片機壓片。使用傅里葉變換紅外光譜儀進行分析,掃描范圍500~4 000 cm(步長為1 cm)。
1.3.4 PSPP03單糖組成分析
PSPP03單糖組成分析參照文獻[19]進行。取500 mg PSPP03加入安瓿瓶中,加入5 mL鹽酸-甲醇溶液(2 mol/L),在氮氣保護下置于80 ℃金屬浴中水解15 h,氮氣吹干,加入5 mL三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)溶液(2 mol/L),升溫至120 ℃,繼續(xù)水解2 h。冷卻,過濾除去不溶物,減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除去TFA,加水洗滌,再旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,反復(fù)3 次,向最后一次濃縮產(chǎn)物加入2 mL蒸餾水,溶解即得完全水解產(chǎn)物PSPP03-B,待用。
使用HPLC分析單糖組成,流動相為體積分數(shù)0.05%甲酸-水溶液,流速0.5 mL/min,色譜柱為Repromer Ca(250 mm×8 mm,9 μm),柱溫40 ℃,使用示差檢測器進行監(jiān)測。采用相同的方法分析Man、GlcA、Rha、Glc、Gal、Ara標準品。
使用0.5 mol/L的TFA溶液對PSPP03進行不完全水解(料液比為1∶20),用超純水透析(截留分子質(zhì)量50 000 Da),透析后取透析袋內(nèi)樣品(PSPP03-B)用2 mol/L的TFA溶液進行水解(料液比為1∶20),按照上述方法測定單糖組成,以確定主鏈單糖和側(cè)鏈單糖組成。
1.3.5 PSPP03甲基化組成分析
取500 mg PSPP03于反應(yīng)瓶中,加入2 mL干燥的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液,溶解后加入20 mg干燥的NaOH,超聲1 h使NaOH完全溶解,冰浴30 min,加入1 mL干燥的碘甲烷,在氮氣的保護下,超聲處理反應(yīng)液1 h。加入蒸餾水終止甲基化反應(yīng)。加入1 mol/L乙酸溶液中和反應(yīng)。用超純水對反應(yīng)液進行透析(截留分子質(zhì)量50 000 Da)至袋內(nèi)顏色透明,冷凍干燥。將甲基化的多糖樣品溶于體積分數(shù)90%甲酸溶液,密封后110 ℃解聚反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸干,分別加入3 mL甲醇重復(fù)蒸干5 次。轉(zhuǎn)移樣品于含有2 mol/L TFA溶液的安瓿管中,封管后110 ℃水解反應(yīng)2 h,隨后減壓蒸干。再加入3 mL蒸餾水充分溶解樣品,隨后加入30 mg NaBH還原乙?;笾频眉谆囊宜嵫苌铮褂寐确螺腿?,回收氯仿層物質(zhì),減壓濃縮后進行GC-MS分析。
GC條件:毛細管柱為HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm),進樣口溫度250 ℃,程序升溫,起始溫度為80 ℃,以10 ℃/min升至260 ℃,保持10 min。
MS條件:電子電離離子源,離子源溫度280 ℃,氦氣流速1 mL/min。
1.3.6 多糖中花青素鑒定及活性檢測
取適量PSPP03,按質(zhì)量體積比1∶2加入水溶解,超聲輔助溶解,過濾,清液轉(zhuǎn)移至DEAE-52大孔樹脂柱內(nèi),使用體積分數(shù)20%~60%的乙醇溶液進行洗脫,分別收集有色段(花青素)和無色段洗脫液。將用斐林試劑檢測出含有多糖的無色段洗脫液合并,冷凍干燥獲得去除花青素的多糖PSPP03-E。有色段濃縮后,使用氮氣吹干儀進行處理,獲得有色段物質(zhì)PSPP03-P,PSPP03-P使用體積分數(shù)0.5%甲酸-甲醇溶液溶解后,利用LC-MS/MS進行分析。利用矢車菊素-3葡萄糖為內(nèi)標(標準曲線方程:=417 726-108 870,=0.999 7)進行定量計算。
質(zhì)譜條件:正離子模式全掃描和自動二級離子掃描,掃描范圍為100~1 200/,載氣為干燥氮氣,離子源溫度550 ℃,霧化氣壓力55 psi,渦輪增壓氣壓力55 psi,氣簾氣壓力25 psi,全掃描分析。
液相色譜條件:選用ACQUITY UPLC HSS T3 C色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流動相A為體積分數(shù)5%甲酸-水溶液,B為體積分數(shù)5%甲酸-乙腈溶液,梯度洗脫為0~8 min 97% A,8~30 min 92% A,30~35 min 80% A,35~40 min 75% A,隨后流動相A體積分數(shù)升至97%,穩(wěn)定5 min。
為探究PSPP03結(jié)構(gòu)對抗氧化能力的影響,采用DPPH自由基清除能力測定試劑盒分析PSPP03-E和PSPP03-P的抗氧化活性。
1.3.7 細胞培養(yǎng)、造模和給藥處理
HepG2細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10%(質(zhì)量分數(shù),后同)胎牛血清+1%鏈霉素-青霉素溶液),取對數(shù)生長期的HepG2細胞,接種至6 孔板中,24 h細胞貼壁情況良好、覆蓋率為80%時給藥。
實驗分組:對照組(CK)為正常培養(yǎng)細胞;造模組(HO處理組)為體積分數(shù)30% HO溶液孵育6 h;給藥組(HO+PSPP03)為不同質(zhì)量濃度(25 μg/mL和100 μg/mL,根據(jù)DPPH自由基清除率所選擇)PSPP03預(yù)處理24 h,再用HO孵育6 h。
1.3.8 細胞活力測定
采用噻唑藍(thiazolyl blue,MTT)法測定細胞活力,取1.3.7節(jié)培養(yǎng)細胞,每孔加入5 g/L MTT處理4 h,棄掉上清液,加入DMSO重懸,振蕩10 min溶解沉淀,用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度。細胞存活率按下式計算,設(shè)置6 個平行。
1.3.9 ROS及抗氧化酶活力測定
按1.3.7節(jié)培養(yǎng)細胞,使用ROS測定試劑盒(化學(xué)熒光法)測定ROS水平。同理,MDA、SOD、CAT、GSH-Px和還原型/氧化型谷胱甘肽(reduced glutathione/oxidized glutathione,GSH/GSSG)等水平均采用相應(yīng)試劑盒進行測定。
1.3.10 代謝組學(xué)分析
取1.3.7節(jié)培養(yǎng)細胞并離心,沉淀中加入適量甲醇-丙酮(1∶1,/)混合溶液,超聲提取30 min,12 000 r/min冷凍離心15 min,取上清液,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干,使用0.5 mL甲醇溶解殘余物,過0.22 μm濾膜,進LC-MS/MS分析。
色譜條件:選用ACQUITY UPLC HSS T3 C色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm),流動相A為體積分數(shù)0.1%甲酸-水溶液,流動相B為體積分數(shù)0.1%乙腈-水溶液。梯度洗脫:0~5 min,5% B;5~10 min,5%~90% B;10~15 min,90% B;11 min,5% B。流速0.5 mL/min,進樣量為10 μL,柱溫35 ℃。
質(zhì)譜條件:電噴霧電離離子源,正離子模式,碰撞能量(40±15)eV,電壓5 500 V,離子源溫度600 ℃,霧化氣壓力55 psi,渦輪增壓氣壓力55 psi,氣簾氣壓力25 psi,全掃描分析,質(zhì)量掃描范圍55~1 000 Da,一級質(zhì)譜采集頻率為0.25 s,二級質(zhì)譜采集頻率0.1 s。
統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用GraphPrism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析,采用單因素分析法進行顯著性分析,以<0.05表示差異顯著。
代謝組學(xué)數(shù)據(jù)采用Peakview軟件對采集的譜圖進行峰提取,利用Markview軟件對原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。得到的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件進行主成分分析和正交偏最小二乘判別分析,獲得差異代謝物。根據(jù)差異代謝物的碎片信息,在人類代謝組數(shù)據(jù)庫(The Human Metabolome Database,HMDB)中進行比對,最終鑒定出差異代謝物。將差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0軟件檢索出富集代謝通路。
圖1A為PSPP高速逆流色譜分離圖,可以看出,PSPP在高速逆流色譜上共有4 個明顯分離的峰。每個色譜峰分離度較好,表明可以利用高速逆流色譜對紫甘薯多糖進行一步分離、純化。通過收集各色譜峰樣品,對各色譜峰樣品進行抗氧化活性測試,如圖1B所示,PSPP03抗氧化活性最好,DPPH自由基清除率達到(92.27±5.03)%,接近PSPP的DPPH自由基清除率((95.05±6.77)%)。同質(zhì)量濃度下,PSPP03 DPPH自由基清除率顯著高于VC(<0.05),其他3 個多糖DPPH自由基清除率都不足10%,因此選取PSPP03作為后續(xù)研究的多糖樣本。
圖1 紫甘薯多糖分離純化及鑒定結(jié)果Fig. 1 Isolation and identification of polysaccharides from purple sweet potato
使用不同分子質(zhì)量的葡聚糖作為標準品,利用HPGPC得到線性回歸方程為lg=1.257 1-4.092 7(=0.997 2)。將PSPP03在HPGPC中的保留時間代入線性回歸方程,計算得到分子質(zhì)量為29.1 kDa。通過圖1C可知,PSPP03在HPGPC上吸收峰相對狹窄且對稱,說明PSPP03分子質(zhì)量分布相對均一,為均一組分。
PSPP03的傅里葉變換紅外光譜如圖1D所示,3 435 cm處是—OH的伸縮振動峰,1 615 cm處吸收峰可能歸屬于糖醛酸中C=O基團,1 413 cm處吸收峰則可能是由多糖中甲基的彎曲振動所引起,同時1 040 cm處吸收峰由C—O—C的伸縮振動引起,提示PSPP03組分中存在吡喃糖環(huán)。綜上,PSPP03在紅外譜圖中存在多糖的特征吸收峰,且可能為酸性多糖。
利用HPLC分析PSPP03完全水解產(chǎn)物和不完全水解的產(chǎn)物PSPP03-B,結(jié)果如圖2所示,PSPP03主要是由-Ara、-Man、-Rha、-GlcA和-Glc組成,物質(zhì)的量比為16.2∶25.3∶7.1∶8.6∶10.8。PSPP03不完全水解后單糖主要為-Ara、-Man、-Rha和-Glc,物質(zhì)的量比為10.6∶24.76∶6.6∶6.2,表明PSPP03主鏈主要是由這4 種單糖組成,側(cè)鏈主要以-GlcA和部分-Ara和-Glc組成。
圖2 PSPP03單糖組成HPLC色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram showing monosaccharide composition of PSPP03
甲基化分析是一種檢測多糖主鏈中糖苷鍵類型的有效方法。利用GC-MS對PSPP03甲基化產(chǎn)物進行分析,通過比對保留時間和質(zhì)譜碎片信息,如表1所示,PSPP03結(jié)構(gòu)中主要有7 種連接類型,包括→4)-Ara-(→1、→3)-Man-(1→、→3,4)-Man-(1→、→3,6)-Man-(1→、→3)-Glc-(1→、Glc-(1→和→4)-Rha-(1→,通過計算,上述7 種連接類型的物質(zhì)的量比為21.34∶16.24∶2.65∶15.61∶15.61∶10.08∶11.75。根據(jù)單糖組成、物質(zhì)的量比和甲基化物質(zhì)的量比的結(jié)果,推測Glc-(1→可能是GlcA完全甲基化后被還原的產(chǎn)物。因此,結(jié)合單糖組成分析,PSPP03的主鏈主要連接類型可能有→4)-Ara-(→1、→3)--Man-(1→、→3,4)--Man-(1→、→3,6)--Man-(1→、→3)--Glc-(1→和→4)--Rha-(1→,而側(cè)鏈的連接形式可能主要為-Glc-(1→以及→4)--Ara-(→1和→3)--Glc-(1→。
表1 PSPP03甲基化組成分析結(jié)果Table 1 Methylation results of PSPP03
根據(jù)多糖和花青素結(jié)構(gòu)特點,花青素結(jié)構(gòu)中的羥基易與多糖中羥基通過氫鍵進行結(jié)合。利用LC-MS/MS對PSPP03中花青素組分進行鑒定,結(jié)果如表2所示。PSPP03共鑒定出4 個花青素組分,分別為矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖、芍藥素-3-槐糖苷-5-葡萄糖、矢車菊素-3-羥基苯甲?;碧擒?5-葡萄糖和矢車菊素-3-(6’’’-咖啡酰槐糖苷)-5-葡萄糖。通過內(nèi)標定量計算后,4 種花青素在PSPP03中的含量分別為14.68、12.62、2.85 μg/100 mg和6.82 μg/100 mg。結(jié)果表明,PSPP03結(jié)構(gòu)中存在一定含量的花青素,其主要成分為矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖和芍藥素-3-槐糖苷-5-葡萄糖。
表2 PSPP03中花青素鑒定及含量Table 2 Identification and concentrations of anthocyanins in PSPP03
對不同質(zhì)量濃度PSPP03的DPPH自由基清除率進行測定,結(jié)果如圖3A所示。DPPH自由基清除率隨著PSPP03質(zhì)量濃度增加而增加,當質(zhì)量濃度為100 μg/mL時,DPPH自由基清除率達到了(94.05±18.12)%,PSPP03質(zhì)量濃度為25 μg/mL時,DPPH自由基清除率為(55.62±8.03)%,半抑制質(zhì)量濃度為22.19 μg/mL。因此后續(xù)細胞氧化損傷測試選擇用PSPP03的25 μg/mL和100 μg/mL兩個質(zhì)量濃度。
圖3B為不同處理組(CK、HO組、HO+25 μg/mL PSPP03和HO+100 μg/mL PSPP03)HepG2細胞的存活率。可以看出,PSPP03可以極顯著提高細胞的HO耐受性,提高細胞存活率。當使用25 μg/mL PSPP03孵育細胞時,細胞存活率為(68.73±8.14)%,而HO處理組細胞存活率僅為(27.84±6.97)%。當PSPP03質(zhì)量濃度為100 μg/mL時,細胞存活率為(94.17±4.50)%,與CK組并無顯著差異。結(jié)果表明,PSPP03可以有效提高細胞在HO氧化作用下的細胞存活率,提示PSPP03具有良好的細胞抗氧化活性。
細胞內(nèi)ROS、GSH和MDA水平反映了細胞內(nèi)氧化程度,SOD、GSH-Px等酶活力反映細胞內(nèi)抗氧化能力。圖3C~F為PSPP03對細胞內(nèi)抗氧化酶活力及非酶抗氧化物質(zhì)(如GSH等)含量的影響。
從圖3C可以看出,HO處理后,細胞內(nèi)的ROS水平激增至CK組的4 倍(<0.01)。當加入PSPP03進行細胞孵育后,細胞內(nèi)的ROS含量極顯著低于HO處理組,且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān),當質(zhì)量濃度為25 μg/mL時,ROS相對水平是HO處理組的39.11%(<0.01),質(zhì)量濃度為100 μg/mL時,ROS相對水平是HO處理組的24.59%(<0.01),接近CK組,說明PSPP03可以降低或者清除因HO引起的細胞內(nèi)ROS積累。
圖3D為PSPP03對細胞內(nèi)CAT和SOD相對活力的影響,HO處理后,SOD和CAT的活性被抑制,相對活力僅分別為CK組的35.42%和38.89%(<0.01)。與HO處理組相比,當加入PSPP03后,質(zhì)量濃度為25 μg/mL和100 μg/mL時CAT相對活力分別增加了1.28 倍和1.71 倍(<0.01),SOD活力分別增加了1.65 倍和2.00 倍(<0.01)。CAT在細胞內(nèi)的主要作用是通過分解HO減輕細胞氧化損傷。SOD在人體內(nèi)起氧化平衡作用,主要是通過清除細胞內(nèi)的超氧陰離子自由基來保護細胞免受氧化損傷。
圖3E為PSPP03對細胞內(nèi)GSH-Px相對活力和GSH相對含量的影響,經(jīng)HO處理后,細胞內(nèi)GSH-Px相對活力極顯著下降(<0.01),活力下降至CK組的16.44%,GSH含量也下降到CK組的30.76%。加入PSPP03后,GSH-Px相對活力極顯著提高(<0.01),質(zhì)量濃度為25 μg/mL和100 μg/mL時分別提高了3 倍和7 倍。表明PSPP03可以通過提高細胞內(nèi)GSH-Px活性催化細胞內(nèi)過氧化物分解,減輕細胞所受過氧化物的損傷。GSH是細胞中重要的非酶類抗氧化物質(zhì)之一,其主要作用是維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)定和抗氧化。本研究中,GSH相對含量在PSPP03作用后較HO處理組有所增加。GSH在細胞內(nèi)主要通過淬滅自由基和清除過氧化物來減輕細胞氧化程度,其含量反映細胞氧化程度。GSH轉(zhuǎn)化過氧化物過程需要GSH-Px的催化,本研究中HO處理會降低GSH-Px的活性,因此會造成細胞內(nèi)GSH無法轉(zhuǎn)變?yōu)镚SSG,從而導(dǎo)致細胞內(nèi)過氧化物積累。加入PSPP03后,一方面提高了GSH-Px活力,促進了GSH的催化形成;另一方面,PSPP03可能通過觸發(fā)GSH合成代謝通路,從而促進GSH的轉(zhuǎn)化或生成。
MDA是細胞內(nèi)脂類物質(zhì)分解的最終產(chǎn)物,MDA的積累會導(dǎo)致細胞代謝受阻,造成細胞功能障礙,甚至死亡。GSSG是GSH的氧化產(chǎn)物,GSSG與MDA的含量都能夠反映細胞的氧化損傷程度。PSPP03對細胞內(nèi)MDA相對含量的影響如圖3F所示,HO作用后,細胞內(nèi)MDA相對含量是CK組的2.32 倍(<0.01);當PSPP03作用后,MDA含量出現(xiàn)下降趨勢,且下降程度與PSPP03質(zhì)量濃度成正比,25 μg/mL和100 μg/mL時,MDA相對含量分別下降到HO處理組的54.67%和41.06%(<0.01)。GSSG相對含量變化趨勢與MDA相似,HO處理會促使細胞內(nèi)GSSG含量激增,上升到CK組的6.21 倍(<0.01)。當PSPP03處理后,GSSG相對含量在25 μg/mL和100 μg/mL PSPP03作用下分別下降到HO處理組的32.64%和20.00%(<0.01)。結(jié)果提示,PSPP03可以有效減少HO作用下細胞內(nèi)MDA和GSSG的積累,降低細胞的氧化損傷。
對去除花青素后的多糖(PSPP03-E)進行抗氧化活性分析,結(jié)果如圖4所示,去除花青素后,PSPP03-E抗氧化活性較未處理PSPP03下降了9.48%(<0.05),活性下降幅度較小。對洗脫掉的花青素(PSPP03-P)進行DPPH自由基清除活性測定,結(jié)果表明,PSPP03-P活性與未處理PSPP03相比DPPH自由基清除率下降了26.50%(<0.01)。通過比較可知,PSPP03的抗氧化活性主要來源于多糖部分,結(jié)合的花青素對抗氧化活性影響相對較小。
研究表明,多糖的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性有直接關(guān)系。吡喃型結(jié)構(gòu)一般被認為是多糖抗氧化的重要結(jié)構(gòu)因素,根據(jù)表1質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比數(shù)據(jù)庫可知本研究中獲得多糖中Man、Rha、Glc構(gòu)型均為吡喃型。同時PSPP03中存在一定量的花青素(表2),研究表明花青素具有較強的抗氧化性。本研究中,洗脫后的花青素抗氧化活性仍超過60%,說明花青素的存在對PSPP03抗氧化性也有一定的貢獻。
多糖可以通過清除DPPH自由基和ROS以及提高抗氧化酶活性達到抗氧化的目的。如Fang Zhiyu等發(fā)現(xiàn)南瓜多糖可以通過清除ROS和提高CAT活性達到抗氧化的目的。此外,多糖還可以降低細胞非酶系氧化物質(zhì),如MDA、GSSG等水平,從而減輕氧化損傷程度。如朱慧民等發(fā)現(xiàn)紅豆沙多糖能夠通過降低MDA含量從而減輕心肌缺血-再灌注損傷小鼠模型中心肌細胞的氧化損傷。本研究中,從紫甘薯中分離獲得的多糖PSPP03可以有效地提高細胞內(nèi)抗氧化酶系活性,同時能夠影響非酶系抗氧化物質(zhì)的水平,減輕HO對細胞的損傷。
圖3 基于細胞氧化損傷模型的PSPP03抗氧化活性Fig. 3 Antioxidant activity of PSPP03 in cell model of oxidative damage
圖4 PSPP03洗脫花青素前后的抗氧化能力Fig. 4 Antioxidant capacity of PSPP03 before and after removal of anthocyanins
對模型細胞代謝物進行提取、分析,經(jīng)過軟件歸一化和轉(zhuǎn)化后,導(dǎo)入軟件進行主成分分析,結(jié)果如圖5A所示。4 組細胞代謝物樣本在組內(nèi)聚集,而組間有明顯的距離,表明該模型建立良好,能很好地預(yù)測結(jié)果。根據(jù)圖5A進行分析,PSPP03兩個給藥組和HO處理組對主成分1影響顯著,且從距離判斷,給藥組對主成分1的影響要強于HO處理組。
圖5 基于代謝組分析PSPP03對H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷細胞代謝譜的變化Fig. 5 Metabolomics analysis of changes in metabolic profile of cells induced by PSPP03 and H2O2
根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù),對4 組樣品中的代謝物進行鑒定,結(jié)果如表3所示,根據(jù)顯著性共鑒定出23 個具有顯著性差異(<0.05且VIP>1.5)的差異代謝物,其中17 個差異代謝物上調(diào),6 個差異代謝物下調(diào)。根據(jù)鑒定的化合物種類,PSPP03處理引起的細胞內(nèi)差異代謝物質(zhì)主要分為2 類:一類為碳水化合物;另一類為氨基酸。利用MetaboAnalyst軟件進行代謝通路富集分析,發(fā)現(xiàn)PSPP03主要可以影響細胞的糖代謝(三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝和糖異生)和氨基酸代謝途徑。圖5B為PSPP03作用下氧化損傷細胞內(nèi)23 種差異代謝物的聚類熱圖,可以明顯看出高質(zhì)量濃度PSPP03給藥組可以顯著提高部分代謝物的相對含量,如檸檬酸和絲氨酸。檸檬酸是三羧酸循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物,通過代謝通路的影響分析,三羧酸循環(huán)在PSPP03給藥后受到顯著影響(圖5C、D)。三羧酸循環(huán)可以影響氨基酸代謝,如精氨酸合成以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等。此外,PSPP03還對絲氨酸的合成與代謝起到促進作用,絲氨酸在細胞內(nèi)可以通過谷氨酸半胱氨酸連接酶的作用轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽,對抗氧化具有重要的作用。同時,差異代謝物中,還存在3 個嘌呤代謝相關(guān)的化合物——肌苷一磷酸、鳥嘌呤核苷5’-磷酸和腺苷。這3 種代謝物與細胞內(nèi)ATP能量代謝具有一定的關(guān)聯(lián),提示PSPP03對細胞中的三羧酸循環(huán)也可能具有一定的影響。
表3 基于LC-MS鑒定PSPP03給藥組和H2O2處理組差異代謝物Table 3 Identified differential metabolites between PSPP03- and H2O2-treated cells
為驗證代謝組結(jié)果,挑取6 種差異代謝物利用LC-MS/MS進行精確定量,結(jié)果如表4所示。經(jīng)過PSPP03給藥后,25 μg/mL給藥組中各指標丙酮酸、檸檬酸、絲氨酸和脯氨酸物質(zhì)的量分別是HO處理組的1.38、1.33、2.03、1.67 倍,100 μg/mL給藥組中各指標物質(zhì)的量分別是HO處理組的1.49、1.39、3.55、1.84 倍。而腺苷和GSSG在25 μg/mL PSPP03給藥條件下分別下降到HO處理組的58.45%和49.92%,100 μg/mL PSPP03條件下分別下降到HO處理組的22.48%和21.14%。
表4 基于LC-MS/MS對部分差異代謝物進行定量分析Table 4 Quantitative analysis of differential metabolites by LC-MS/MS mmol
本研究從紫甘薯中分離獲得4 個純多糖,DPPH自由基清除能力分析結(jié)果表明PSPP03具有顯著的抗氧化潛力。
利用HPLC技術(shù)對PSPP03的結(jié)構(gòu)進行了初步分析,其主要由-Ara、-Man、-Rha、-GlcA和-Glc組成,物質(zhì)的量比為16.2∶25.3∶7.1∶8.6∶10.8。甲基化分析結(jié)果表明其主鏈連接主要構(gòu)型為→4)--Ara-(→1、→3)--Man-(1→、→3,4)--Man-(1→、→3,6)--Man-(1→、→3)--Glc-(1→和→4)--Rha-(1→,而側(cè)鏈的連接形式可能主要為-Glc-(1→以及→4)--Ara-(→1和→3)--Glc-(1→。PSPP03中含有一定量的花青素,主要成分為芍藥素-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷和矢車菊素-3-槐糖苷-5-葡萄糖苷,其可能主要以氫鍵形式結(jié)合。通過分析比較抗氧化性可知,PSPP03的抗氧化活性主要來源于多糖部分。
利用HO誘導(dǎo)建立氧化損傷細胞模型,探究了PSPP03細胞抗氧化能力。結(jié)果表明PSPP03可以顯著降低細胞內(nèi)ROS水平,減輕氧化損傷程度;同時顯著提高SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活力和GSH水平;顯著降低GSSG和MDA等有害物質(zhì)含量。
代謝組學(xué)分析結(jié)果表明,PSPP03細胞內(nèi)抗氧化代謝機制有可能是通過促進相關(guān)氨基酸代謝和三羧酸循環(huán)從而減輕細胞的氧化損傷。