景依葶，田曉娟，魏曉霞，徐佳志，張新國(guó)，王銘也，魏 麗，宏亞麗，蓋 軻

(1.隴東學(xué)院 岐伯醫(yī)學(xué)院，甘肅 慶陽(yáng) 745000；2.隴東學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，甘肅 慶陽(yáng) 745000； 3.慶陽(yáng)能源化工集團(tuán)沃德石油技術(shù)有限公司，甘肅 慶陽(yáng) 745000)

生物法污水處理是去除污水中有機(jī)物質(zhì)的技術(shù)，該技術(shù)已在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。其依賴生物處理系統(tǒng)中具有有機(jī)物分解能力的微生物達(dá)到處理污水的目的[1-2]。污水生物法處理中常見的污染物降解微生物一般為常溫菌。我國(guó)北方寒冷地區(qū)氣溫較低，導(dǎo)致污水生物處理池中的溫度也較低，尤其在冬季，低溫環(huán)境導(dǎo)致污水生物曝氣池中的溫度常低于常溫菌的適宜生長(zhǎng)溫度范圍，使微生物的數(shù)量和活性降低，導(dǎo)致污水中的有機(jī)物質(zhì)不能被迅速降解，污水降解效率低下，出水水質(zhì)難以達(dá)標(biāo)[3-4]。針對(duì)這一問題，工程設(shè)計(jì)中一般采用降低污泥負(fù)荷、延長(zhǎng)污水停留時(shí)間和生物曝氣池保溫等措施，來增加低溫環(huán)境下微生物對(duì)有機(jī)物質(zhì)的分解時(shí)間并提高分解溫度，從而改善污水處理效率[5-6]。但這些方法導(dǎo)致污水處理投資成本和運(yùn)行費(fèi)用增加。因此，改善北方寒冷地區(qū)污水處理效果是亟待解決的難題。

眾所周知，低溫是導(dǎo)致北方寒冷地區(qū)污水降解效果低下的主要原因。當(dāng)水溫低于10℃時(shí)，常溫菌的新陳代謝活性下降。研究表明，耐冷菌的最高生長(zhǎng)溫度高于20℃，最適生長(zhǎng)溫度大于15℃，在0℃～5℃仍可生長(zhǎng)繁殖[7]。耐冷菌耐受低溫這一生長(zhǎng)特性為解決北方寒冷地區(qū)污水處理效果不理想，并降低投資運(yùn)行成本提供可行方案。國(guó)外對(duì)耐冷菌的研究及應(yīng)用起步較早，而國(guó)內(nèi)對(duì)這項(xiàng)工作的研究還處于探索階段[8]。本研究對(duì)生活污水中的污泥進(jìn)行低溫馴化，并從中篩選分離耐冷COD去除功能菌，對(duì)單菌進(jìn)行鑒定，并研究其低溫生長(zhǎng)特性和低溫人工生活污水去除特性，再對(duì)優(yōu)勢(shì)耐冷功能菌進(jìn)行組合，研究混合菌對(duì)低溫人工生活污水中COD的去除情況，從而為改善我國(guó)北方寒冷地區(qū)生活污水處理效率提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種來源：從甘肅省慶陽(yáng)市西峰區(qū)東區(qū)污水處理廠和甘肅省慶陽(yáng)市西峰區(qū)南區(qū)污水處理廠采集污泥樣本，并于10℃條件下對(duì)污泥進(jìn)行低溫馴化。

富集培養(yǎng)基：葡萄糖8.0g、蛋白胨1.5g、酵母膏1.5g、K2HPO40.4g、(NH4)2SO40.5g、MgSO4·7H2O0.05g、CaCl20.10g、FeCl30.01g、MgCl20.10g、NaCl3.0g、L-半胱氨酸0.5g，去離子水定容至1000ml。固體富集培養(yǎng)基，在上述培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉。滅菌條件：115℃，15min。

人工生活污水：葡萄糖0.17g、可溶性淀粉0.16g、乙酸鈉0.23g、NH4Cl0.26g、蛋白胨0.15g、牛肉膏0.04g、(NH4)2SO40.03g、KH2PO40.07g、Na2CO30.06g，去離子水定容至1000ml。固體人工生活污水，在上述培養(yǎng)基中加入15g瓊脂粉。COD為650mg/L。滅菌條件：115℃，15min。

1.2 主要設(shè)備及儀器

全恒溫生化培養(yǎng)箱，BJPX-SG170Ⅱ型，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；生物安全柜，BSC-1304ⅡA2型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PCR儀，Proflex3×32，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；紫外分光光度計(jì)，DR6000型，哈希上海有限公司；多參數(shù)水質(zhì)測(cè)定儀，5B-3B型，北京連華科技有限公司；多參數(shù)消解儀，LH-25A，北京連華科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 耐冷菌的篩選及分離純化

將10℃低溫馴化污泥按5%(體積分?jǐn)?shù))比例加入帶有玻璃珠的無菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，取混勻液體10ml加入90ml無菌液體富集培養(yǎng)基中，10℃，150r·min-1條件下恒溫振蕩培養(yǎng)10d，取培養(yǎng)后的上清液10ml，加入90ml新的無菌液體富集培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)7d，如此共進(jìn)行4輪富集。將第4輪富集培養(yǎng)液混勻，用無菌生理鹽水梯度稀釋成10-2至10-7濃度，取不同濃度的稀釋液各0.1ml，分別均勻涂布于無菌固體富集培養(yǎng)基上。10℃，150r·min-1，恒溫培養(yǎng)，直至出現(xiàn)菌落。

用無菌接種針挑取單菌落分別接種至無菌富集培養(yǎng)基，10℃，150r·min-1條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取菌液測(cè)定600nm處的吸光度值(OD600值)。當(dāng)OD600值為1.0時(shí)，按1%(體積分?jǐn)?shù))比例接種至200ml無菌人工生活污水中，10℃，150r·min-1條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7d。取上清液離心，測(cè)COD，選擇COD去除效果較好的菌株。

用無菌生理鹽水分別稀釋篩選的優(yōu)勢(shì)耐冷功能菌，涂布于固體人工污水培養(yǎng)基上，10℃恒溫培養(yǎng)直至長(zhǎng)出菌落。挑取單菌落在相同固體培養(yǎng)基上劃線分離純化，直至分離出單一菌株。-80℃保存菌種。

1.3.2 耐冷菌的鑒定

分別以純化后的優(yōu)勢(shì)耐冷菌菌體為模板，擴(kuò)增菌株的16SrDNA，擴(kuò)增引物序列為：1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)。0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源檢測(cè)。

1.3.3 耐冷菌的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將篩選出的優(yōu)勢(shì)耐冷菌活化，無菌生理鹽水調(diào)整至OD600值為1.0，按1%(體積分?jǐn)?shù))比例接種至200ml無菌液體富集培養(yǎng)基，10℃，150r·min-1條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每12h取菌液，以未接種液體培養(yǎng)基為空白，測(cè)定菌液OD600值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)，繪制各優(yōu)勢(shì)菌株的生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算菌株的比生長(zhǎng)速率和世代時(shí)間。

比生長(zhǎng)速率計(jì)算公式：

其中，κ為比生長(zhǎng)速率(h-1)；x1為t1時(shí)的OD600值；x2為t2時(shí)的OD600值；t1、t2為培養(yǎng)時(shí)間(h)。

世代時(shí)間計(jì)算公式：

其中，g為世代時(shí)間(h)；κ為比生長(zhǎng)速率(h-1)。

1.3.4 耐冷菌的COD降解性能測(cè)定

將優(yōu)勢(shì)耐冷功能菌在無菌液體富集培養(yǎng)基中活化36h，8000r·min-1離心10min，棄去上清液，用無菌生理鹽水洗滌菌體3至4次，再用無菌生理鹽水調(diào)整OD600值為1.0。按1%(體積分?jǐn)?shù))比例接種至200ml無菌人工污水中，10℃，150r·min-1條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。每24h取上清液，離心，測(cè)COD。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3.5 COD測(cè)定方法

COD的測(cè)定采用重鉻酸鉀法(HJ828-2017)，具體操作步驟詳見《水質(zhì)化學(xué)需氧量的測(cè)定重鉻酸鉀法》(HJ828-2017)[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 優(yōu)勢(shì)耐冷菌的篩選與鑒定

經(jīng)過多次富集和反復(fù)純化，從馴化污泥中篩選分離得到5株COD去除效果較好的低溫功能菌，分別命名為WE-1、WE-2、WS-1、WS-2、FH。對(duì)以上5種菌株的16SrDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，將16SrDNA序列提交NCBI庫(kù)比對(duì)，選取同源性較高的菌種，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，從低溫馴化污泥中篩選分離出的5株功能菌分屬于3個(gè)不同的屬，其中WE-1、WE-2和FH屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，WS-1屬于節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobactersp.)，WS-2屬于土生拉烏爾菌屬(Raoultellasp.)。假單胞菌屬的菌所占比例最高，為60%。有研究表明，在0℃～5℃能夠繁殖的耐冷細(xì)菌主要有假單胞菌屬[10]、喜冷桿菌屬[11]，節(jié)桿菌屬[12]，嗜冷桿菌屬[13]，黃桿菌屬[14]等。本研究表明土生拉烏爾菌屬中也存在耐冷菌。薛天福[15]從低溫馴化污泥中篩選出8株COD降解效果較好的菌株，10℃條件下，對(duì)模擬農(nóng)村生活污水COD去除效率最高的是假單胞菌屬，為88.6%。劉婧[16]從高原濕地沼澤土壤中馴化分離得到6株COD去除效果較好的耐冷菌，其中假單胞菌在6℃～9℃對(duì)畜禽廢水COD的降解效率高于63%。

表1 5株優(yōu)勢(shì)耐冷菌的相似菌種及相似度

圖1 優(yōu)勢(shì)耐冷功能菌生長(zhǎng)曲線(10℃)

2.2 優(yōu)勢(shì)耐冷菌的低溫生長(zhǎng)曲線

經(jīng)測(cè)定，5株優(yōu)勢(shì)耐冷菌在10℃的生長(zhǎng)曲線見圖1。圖1顯示，接種后的0h～24h，5株菌均處于生長(zhǎng)延滯期；24h～48h，5株菌的生長(zhǎng)均進(jìn)入對(duì)數(shù)期，OD600值迅速增大，從0.1左右增至2.0以上；培養(yǎng)48h以后，5株菌均進(jìn)入平臺(tái)期，且生長(zhǎng)穩(wěn)定。與李政弢等[17]的研究結(jié)果相比，本研究篩選的5株耐冷菌在10℃時(shí)生長(zhǎng)的延滯期和對(duì)數(shù)期較短，均為24h，而穩(wěn)定期較長(zhǎng)，最高OD600值在2.5以上，高于其研究結(jié)果，這有利于菌株適應(yīng)新的環(huán)境，說明菌株在污水中能穩(wěn)定生存，從而穩(wěn)定發(fā)揮去除COD的效果。根據(jù)10℃下優(yōu)勢(shì)耐冷菌的生長(zhǎng)曲線分別計(jì)算其比生長(zhǎng)速率和世代時(shí)間，結(jié)果見表2。根據(jù)表2可知，5株耐冷菌的生長(zhǎng)速率在0.124h-1～0.152h-1之間，世代時(shí)間在4.46h～5.47h之間，其中世代時(shí)間最低的是WE-1，為4.46h。這說明，篩得的5株耐冷菌在10℃下能夠正常生長(zhǎng)代謝，且代謝活性較高。有研究表明，相較于中溫菌，耐冷菌的生長(zhǎng)速率較慢、世代時(shí)間較長(zhǎng)[18]。本研究中，當(dāng)溫度降低至10℃時(shí)，篩得的5株耐冷菌能保持0.124h-1～0.152h-1的較高生長(zhǎng)速率和4.46h～5.47h的世代時(shí)間，該溫度下，中溫菌的生長(zhǎng)代謝已經(jīng)大大減緩，甚至生長(zhǎng)停滯。這說明利用篩得的耐冷菌去除低溫生活污水COD的可行性。

表2 優(yōu)勢(shì)耐冷菌比生長(zhǎng)速率和世代時(shí)間(10℃)

圖2 優(yōu)勢(shì)耐冷菌對(duì)人工生活污水COD的去除效果(10℃)

2.3 單株耐冷菌的COD去除性能

將篩選出的5株耐冷菌分別接入無菌人工污水中，10℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每24h取上清液，檢測(cè)人工生活污水中的COD，結(jié)果見圖2。圖中顯示，從低溫馴化污泥中篩選出的5株耐冷菌在接入無菌人工生活污水中后，人工生活污水的COD含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且COD去除效果較好。結(jié)果顯示，在接種后1天內(nèi)，COD的去除率不佳，最高去除率為2.99%，對(duì)應(yīng)菌株為WE-1。這可能與5株菌在10℃下的生長(zhǎng)特性有關(guān)，該溫度下，接種后1天內(nèi)，5株菌均處于生長(zhǎng)延滯期，此時(shí)人工生活污水中功能細(xì)菌的菌量不足，且細(xì)菌新陳代謝緩慢，這可能是造成COD去除效果不佳的原因。接種后第2天到第7天，人工生活污水中的COD含量迅速下降，各菌株對(duì)COD的去除率均大幅提高。去除效果最好的是WE-1和FH，其第7天的COD值分別為195.47mg/L和182.59mg/L，對(duì)應(yīng)的COD去除率分別為71.91%和69.93%。接種第7天至第10天，人工污水中的COD值任仍呈下降趨勢(shì)，但其下降速率略有減緩。分析原因，可能是此時(shí)人工污水中的COD低于195.47mg/L，環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，細(xì)菌死亡速率大于繁殖速率，活菌總量下降，導(dǎo)致COD去除效率減緩。因此，利用該菌降解生活污水時(shí)，要注意監(jiān)測(cè)生活污水的COD值并及時(shí)補(bǔ)充污水進(jìn)水，以保證細(xì)菌對(duì)COD的降解活性。接種后第10天，WE-1、FH、WE-2和WS-2的COD去除率分別是85.70%、84.10%、82.68%和80.26%，處理后的COD分別為92.95mg/L、103.32mg/L、112.58mg/L和128.34mg/L，其中WE-1對(duì)人工生活污水的去除率最高，COD降至100mg/L以下。研究結(jié)果表明，假單胞菌屬的WE-1、FH和WE-2及土生拉烏爾菌屬的WS-2在10℃下均能達(dá)到較好的人工生活污水去除效果，去除率均達(dá)到80%以上。姜安璽等[19]分離得到可去除COD的耐冷菌，在10℃下對(duì)人工生活污水中COD的去除率為81.9%。高新新等[20]從活性污泥中分離的一株去除污水中有機(jī)物的假單胞菌，其在4℃下對(duì)人工生活污水的去除率為71.2%。而本研究分離得到的耐冷菌在10℃下的COD最高去除率為85.70%，這說明其具有較好的生活污水處理應(yīng)用潛力。

圖3 混合耐冷功能菌對(duì)人工生活污水 COD的去除效果(10℃)

2.4 混合耐冷菌的COD去除性能

根據(jù)分離到的5株優(yōu)勢(shì)耐冷菌對(duì)人工生活污水的處理效果，將其按不同體積比例混合，觀察10℃條件下，混合耐冷菌對(duì)人工生活污水中COD的去除效果，結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，在相同接種量和實(shí)驗(yàn)條件下，接種培養(yǎng)后第7天，除配比4外，其他配比的混合菌人工生活污水COD去除率均高于單株菌。其中配比1和配比3的COD去除率分別為90.11%和91.89%，處理后的COD分別為64.28mg/L和52.72mg/L。配比2和配比4的COD去除率分別為87.30%和80.09%，處理后的COD分別為82.57mg/L和129.43mg/L。配比3對(duì)人工污水COD的去除率最高。本研究表明，與單菌相比，在人工生活污水的處理時(shí)間和COD去除程度方面，合理配比的混合耐冷菌表現(xiàn)優(yōu)于單菌。馬文成等[21]從低溫污水中分離出的耐冷菌，其混合菌在5℃下6天對(duì)生活污水的COD去除率達(dá)87%，高于單株菌的去除率。黃秋婷等[22]從低溫馴化的活性污泥中分離出的8株耐冷菌的混合菌，在10℃下，7天對(duì)實(shí)際農(nóng)村生活污水COD的去除率為94.1%，其效果優(yōu)于相同條件下的單株菌，已達(dá)到我國(guó)農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。這可能是因?yàn)橥ㄟ^不同的配比，改變了微生物群落結(jié)構(gòu)，利用不同微生物對(duì)底物的處理優(yōu)勢(shì)，形成了更有效的有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化鏈，從而使污水中的COD得到了更有效的去除。

3 結(jié)論

(1)從低溫馴化的活性污泥中共篩選分離得到5株優(yōu)勢(shì)耐冷功能菌，經(jīng)過細(xì)菌16SrDNA基因測(cè)序，NCBI庫(kù)比對(duì)分析，5株菌中，WE-1、WE-2和FH屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，WS-1屬于節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobactersp.)，WS-2屬于土生拉烏爾菌屬(Raoultellasp.)。5株耐冷菌在10℃條件下對(duì)人工生活污水的COD均有較好的去除效果。

(2)在10℃條件下，5株菌在人工生活污水中的生長(zhǎng)特性為延滯期較短、穩(wěn)定期較長(zhǎng)，能夠正常生長(zhǎng)代謝，且代謝活性較高。比生長(zhǎng)速率為0.124h-1～0.152h-1，世代時(shí)間為4.46h～5.47h，對(duì)低溫生活污水COD的去除具備可行性。

(3)分離得到的單菌株在10℃條件下對(duì)人工生活污水COD去除性能均較好。培養(yǎng)第10天，假單胞菌屬的WE-1、FH、WE-2和土生拉烏爾菌屬的WS-2對(duì)人工生活污水的去除率均在80%上，分別為85.70%、84.10%、82.68%和80.26%，處理后的COD分別為92.95mg/L、103.32mg/L、112.58mg/L和128.34mg/L。人工生活污水COD去除效果最好的是假單胞菌屬的WE-1。

(4)將分離得到的5株耐冷菌按不同體積比混合制成混合菌種，10℃條件下，混合菌對(duì)人工生活污水中COD的處理時(shí)間和去除效果優(yōu)于單菌。表現(xiàn)最佳的是配比3，培養(yǎng)7天后，其COD的去除率為91.89%，處理后的COD為52.72mg/L。