馮 巍, 周國強, 陳浩天, 馬伯軍, 陳析豐

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

衰老是細胞死亡和分解、組織和器官的退化、生命功能的老化等一系列退化過程，它受到細胞核和細胞質的嚴格控制.葉片衰老的起始不僅受到溫度、光照、干旱、營養(yǎng)缺乏、損傷、病原體感染等外部環(huán)境的影響，還受到發(fā)育階段、植物激素水平等內部遺傳因素的影響[1-5].當葉片受到來自環(huán)境或內部本身的壓力后，為了維持生命的進程，就會通過信號起始衰老基因的表達，進而使得葉片衰老死亡.葉片衰老涉及一系列的細胞學和生物化學變化，主要包括：細胞膜通透性的改變、核酸、蛋白質等生物大分子的降解、光合作用能力降低、葉綠體變性導致的葉綠素含量降低、丙二醛含量升高、活性氧、H2O2含量增加等[6-7].水稻作為單子葉植物，其營養(yǎng)的積累主要在于葉片中葉肉細胞的光合作用，但水稻葉片過早的衰老往往會減少光合作用時間、降低養(yǎng)分再轉化效率和收獲指數(shù)，進而影響水稻的品質和產量[8-10].相反，延遲葉片衰老對水稻生產力有潛在的積極影響，據(jù)理論推算,水稻葉片衰老每推遲1 d可增產2%，實踐證明也可達到1%左右.因此，克隆葉片衰老的調控基因，解析其分子機制對提高水稻產量和品質具有重要意義.

目前，許多水稻葉片衰老相關基因已經被鑒定出來.這些基因可以根據(jù)代謝途徑分為不同的類別：1)合成葉綠體并降解葉綠素的相關基因，包括NYC1，NOL，OsPAO，OsRCCR1，OsSGR，V1，V2等[11-14]；2)涉及GnT1，OsSAG12，Osh69，TDC1，TDC2 等蛋白的合成、降解和轉運[15-19]；3)與激素信號通路有關，如OsFBK12，OsSAMS1，EIN2和EIN3等[20-22]參與了乙烯信號通路；4)與細胞程序性死亡(PCD)相關的基因，如RLS1，OsCATC，SPL28等[23-25].雖然，水稻葉片衰老相關的基因研究已經取得了較大的進展，但葉片衰老是一個非常復雜的過程，具體的分子機制尚不完全清楚，有待進一步研究.本研究從水稻誘變庫中獲得了一個早衰突變體els-t(earlyleafsenescence-temporary)，并對該突變體進行了表型鑒定、遺傳分析與基因精細定位，通過PCR測序分析確定了候選基因，為進一步研究水稻早衰的分子機理提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻早衰els-t突變體是秈稻品種鎮(zhèn)恢084經60Co-γ輻射誘變而來，經多代自交，其突變表型遺傳穩(wěn)定.以els-t突變體為母本，分別與野生型對照鎮(zhèn)恢084、日本晴雜交，獲得F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代群體.水稻材料均種植于浙江省金華市的大田中，4月中旬播種，10月份收獲.

1.2 凈光合速率測定

在水稻分蘗期的晴天上午，隨機選取突變體els-t及其野生型對照鎮(zhèn)恢084各3株，對其正常葉片采用LI-6800型便攜式光合作用測定儀測定凈光合速率，繪制光合曲線，每株重復測定3次，取其平均值作圖.

1.3 葉綠素降解實驗

在水稻分蘗期，選取els-t突變體及其野生型對照鎮(zhèn)恢084的正常葉片，放置到裝有20 mL純凈水的培養(yǎng)皿中，避光28 ℃分別處理0，3,5 d后，將葉片組織剪碎，按照Porra方法[26]測定葉綠素a和葉綠素b含量，每個材料重復測定3次，并進行t檢驗，分析突變體與野生型之間的顯著性差異.

1.4 水稻農藝性狀調查

根據(jù)劉建豐等[27]方法，在水稻抽穗時取els-t突變體與野生型對照鎮(zhèn)恢084各15株，測定每株水稻的株高、分蘗數(shù)、劍葉長、劍葉寬；待水稻成熟后，取els-t突變體與野生型對照鎮(zhèn)恢084各15株，考察穗長、結實率、粒長、粒寬、千粒質量.采用t檢驗進行顯著性分析.使用GraphPad Prism 7軟件繪制箱形圖.

1.5 目的基因的連鎖分析與精細定位

取水稻日本晴、els-t突變體及其雜交F2群體中15個野生型單株和15個早衰型單株，采用Murray 等[28]方法分別提取葉片的基因組DNA，并將所有的野生型F2單株或早衰型F2單株DNA等量混合，構建野生型DNA混池和早衰型DNA混池.采用覆蓋水稻基因組的SSR和InDel標記[29-30]對日本晴與els-t突變體進行PCR擴增，PCR采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒，程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃復性30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸2 min；4 ℃保存.

用親本間具多態(tài)性的SSR標記對野生型DNA混池和突變型DNA混池進行PCR擴增，在2個混池間篩選具多態(tài)性的標記，即目的基因連鎖的標記，對目的基因進行初步定位.然后，用連鎖分子標記對F2群體中的所有早衰型單株進行PCR擴增，并在定位區(qū)間內開發(fā)新的InDel標記(見表1)，對目的基因進行精細定位.

表1 InDel標記的PCR引物序列

1.6 候選基因的擴增與測序

根據(jù)水稻日本晴基因組的注釋(http://rapdb.dna.affrc.go.jp)，對定位區(qū)間內的候選基因設計PCR引物(見表2)，使用PrimeSTAR?HS DNA Polymerase試劑盒(TaKaRa公司，日本)對野生型對照鎮(zhèn)恢084和els-t突變體的基因組DNA進行PCR擴增，程序為：95 ℃預變性 5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，72 ℃復性 90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存.PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，寄送生物技術公司進行測序.

表2 Os03g0265100基因的PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 水稻els-t突變體表現(xiàn)為葉片早衰及生長發(fā)育受影響

水稻els-t突變體從分蘗期開始出現(xiàn)早衰表型，葉尖首先黃化，隨后整個葉片逐漸枯黃，而對照葉片還未出現(xiàn)任何衰老的跡象(見圖1a).進一步對els-t突變體正常葉片的光響應曲線進行了測定，發(fā)現(xiàn)els-t突變體的暗呼吸速率(光照強度為0 時)與同時期的對照葉片相近；但是，隨著光照強度的增強，els-t突變體達到光補償點和光飽和點都比對照延遲了，而且els-t突變體的凈光合速率也比對照顯著性下降(見圖1b).以上結果表明，els-t突變體對光的響應能力及其光合作用效率均低于對照.同時，將els-t突變體的正常葉片與同時期的對照葉片進行黑暗處理，并測定了其葉綠素含量的變化，結果顯示，處理前二者的葉色與綠色含量沒有差異，而經過黑暗處理后，els-t突變體的葉片明顯比對照更黃(見圖1c)，其葉片的葉綠素含量也比對照下降得更快(見圖1d).這表明在黑暗條件下，els-t突變體葉片中葉綠素的降解速率比對照更快.對els-t突變體的農藝性狀統(tǒng)計調查發(fā)現(xiàn)，其穗長、每穗粒數(shù)、結實率、千粒質量和單株產量等產量相關的重要性狀均比對照顯著性下降(見圖2).

a：分蘗期的植株表型；b：分蘗期葉片的光響應曲線；c：暗處理后葉片的表型；d：暗處理后葉片的葉綠素含量變化對照：野生型對照鎮(zhèn)恢084；els-t：els-t突變體.“**”表示對照與els-t之間存在顯著性差異(P<0.01)

箱形圖顯示中間值(線)和異常值(黑點).“**”表示野生型對照鎮(zhèn)恢084與突變體之間存在顯著性差異(P<0.01)

2.2 水稻els-t突變體的早衰表型受單隱性核基因控制

以els-t突變體為母本與野生型鎮(zhèn)恢084(秈稻)雜交，F(xiàn)1代自交獲得F2代群體.F1代植株為野生型，F(xiàn)2代群體(3 835單株)出現(xiàn)了表型分離，其中野生型2 918株，早衰突變型917株，經χ2檢驗該群體的野生型與突變型的分離符合3∶1(見表3).同時，以els-t突變體為母本與野生型日本晴(秈稻)雜交，其F1代植株也為野生型，自交F2代群體的野生型與早衰突變型的分離比也符合3∶1(見表3).這些結果表明，els-t突變體的早衰表型由單隱性核基因控制.

表3 水稻els-t 突變體與野生型雜交F2代群體的表型及分離比

2.3 水稻els-t 基因被精細定位于3號染色體的48 kb區(qū)間

利用els-t突變體與日本晴雜交構建的F2代群體，用覆蓋水稻基因組、在兩個親本間具有多態(tài)性的92個分子標記進行了連鎖分析，結果見圖3，圖中“n”表示用于分析的F2突變單株數(shù)目，分子標記下對應的數(shù)字表示該標記與目的基因間發(fā)生染色體交換的單株個數(shù).首先將目的基因確定在水稻3號染色體上，并利用100個F2突變單株將els-t基因初步定位在標記RM14635和RM14766之間，物理距離為3.0 Mb(見圖3a).隨后，在這兩個標記之間篩選出了6個多態(tài)性分子標記，通過擴大F2突變單株數(shù)目至1 585株，進一步將目的基因精細定位在InDel3與InDel4兩個標記之間，物理距離為48 kb(見圖3b).

a：els-t基因初定位的遺傳圖譜；b：els-t基因精細定位的遺傳圖譜；c：els-t基因結構及其突變位點；d：日本晴與els-t突變體雜交F2代植株的突變位點測序結果

2.4 水稻els-t 為早衰調控基因PLS2的一個新等位突變

根據(jù)水稻日本晴基因組的注釋，在48 kb的基因定位區(qū)內含有9個基因.通過PCR對這些基因的測序分析，與野生型鎮(zhèn)恢084的序列進行比較，發(fā)現(xiàn)其中1個基因Os03g0265100的第5個外顯子中發(fā)生1個堿基A缺失(見圖3c).為了進一步證明該堿基的缺失導致了els-t突變體出現(xiàn)早衰表型，從F2代群體中隨機選取20個野生型和20個早衰突變型單株，對該突變位點進行PCR擴增和測序.結果發(fā)現(xiàn)，野生型單株的基因型為無突變(野生型)、或單染色體突變(野生型/A缺失)，而早衰突變型單株則全部為純合突變(A缺失)，代表性的測序結果如圖3d所示.在圖3d中，左側表示植株表型，右側表示Os03g0265100的基因型，野生型表示無突變，野生型/A缺失表示單染色發(fā)生堿基A缺失，A缺失表示雙染色體發(fā)生堿基A缺失的純合突變.基因Os03g0265100是一個曾被報道參與水稻早衰調控的基因PLS2(prematureleafsenescence2)，els-t是其新的等位突變[31].

3 討 論

葉片衰老是植物生長發(fā)育的必然進程，也是植物對環(huán)境的一種適應性.然而，葉片過早的衰老會降低光合作用的效率進而影響作物的生物量合成[32].目前，水稻中已經鑒定的葉片早衰突變體有很多，其中esl3，esl6和es5等突變體在苗期出現(xiàn)葉片早衰表型[33-35]，esl9，mps1和g398等突變體在分蘗期出現(xiàn)葉片早衰表型[35-37]，es-h等突變體在抽穗后葉片出現(xiàn)早衰表型[38].雖然，這些水稻早衰突變體衰老發(fā)生的時期不同，但在其葉片衰老過程中，葉片的葉綠素含量都會顯著下降，并且主要農藝性狀每穗粒數(shù)和單株產量等都顯著降低.水稻els-t突變體也具有相似的表型，在分蘗期時開始出現(xiàn)葉片衰老，其光合作用的效率也顯著低于野生型對照.由于水稻營養(yǎng)物質的積累主要來源于葉片的光合作用，因此其與產量相關的農藝性狀也顯著性下降.

通過對els-t突變基因的精細定位和候選基因的PCR測序研究發(fā)現(xiàn)，els-t是曾被報道參與水稻早衰調控的基因PLS2[31]的一個新的等位突變，其第5個外顯子的第61位A堿基缺失，造成移碼突變.而曾被報道的pls2突變體，其第9個外顯子上第41位的C堿基被替換為T堿基，導致精氨酸被半胱氨酸所替換引發(fā)早衰表型，株高、每穗粒數(shù)、千粒質量和單株產量等農藝性狀也顯著降低[31].移碼突變往往導致基因的功能缺失，往往比堿基替換引發(fā)的效應更加嚴重.盡管els-t突變體的多項農藝性狀發(fā)生下降，但是其株高卻沒有顯著變化，這點與株高明顯下降的pls2突變體不同.這可能是因為基因缺失只會導致PLS2蛋白質失去原有的功能，而堿基替換導致的精氨酸到半胱氨酸的替換可能影響了PLS2蛋白質的高級結構，使得PLS2蛋白質的功能發(fā)生改變，抑制了水稻的正常生長.這種通過堿基替換導致功能發(fā)生改變的突變形式可以為蛋白質高級結構與其功能之間關系的研究提供了新的思路.

PLS2基因編碼一個糖基轉移酶，它在參與生物合成、保持內部環(huán)境穩(wěn)態(tài)，調控信號分子和防御化合物的活性中起著重要的作用.依賴UDP的糖基轉移酶可以催化糖從活性糖供體轉移到小分子受體上，進而形成糖苷鍵.已有的研究表明，糖基轉移酶在植株抗性及植株衰老等過程中發(fā)揮著一定的作用.在擬南芥中，過表達豌豆的PsUGT1基因會導致植株葉片衰老加快[39]，而沉默AtUGT85A7的擬南芥葉片衰老速度會延遲[39].然而糖基轉移酶在水稻葉片衰老中是如何發(fā)揮作用的尚不明確，以上研究結果為糖代謝異常導致葉片衰老提供了一個新的遺傳材料.