朱學(xué)泰，張國(guó)晴，冶曉燕

（1.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.臨夏回族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，甘肅 臨夏 731100）

塊菌屬（Tuber）真菌，俗稱(chēng)松露，隸屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota）、盤(pán)菌綱（Pezizomycetes）、盤(pán)菌目（Pezizales）、塊菌科（Tuberaceae），是一類(lèi)常具有黑褐色或暗色子囊果的真菌，一般與樹(shù)木共生形成外生菌根，其子囊果多生于地下［1］，主要分布在青岡櫟（Cyclobalanopsis glauca（Thunb.）Oerst.）、油 松（PinustabuliformisCarr.）、云南松（Pinusyunnanen?sisFranch.）、板栗（Castanea mollissima）、栓皮櫟（Quercus variabilis）等樹(shù)下土壤中［2］。目前全球已報(bào)道的塊菌屬物種約150種。歐洲塊菌的食用和研究歷史較早，主產(chǎn)于法國(guó)、意大利和西班牙，其余國(guó)家也有分布［3］，與西方相比，我國(guó)對(duì)于塊菌的認(rèn)識(shí)和研究起步較晚，但近幾年發(fā)展迅速，大量的新種和新記錄種不斷被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道［4-6］，目前全國(guó)已記錄有84個(gè)塊菌屬物種［7］，主要分布在云南、四川等西南地區(qū)，另外在內(nèi)蒙古、河北、遼寧、山西、甘肅以及北京等地也有分布［3，7-8］。塊菌味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，但產(chǎn)量較少，因此價(jià)格昂貴，在西方國(guó)家享有“黑鉆石”“地下黃金”等美譽(yù)，形成了獨(dú)特的松露文化［9-10］。目前我國(guó)已成為世界上主要的塊菌出口國(guó)之一，但過(guò)度的開(kāi)采使我國(guó)的塊菌生態(tài)環(huán)境遭到了極大破壞，很多塊菌資源尚未成熟就被挖掘流入市場(chǎng)，產(chǎn)量急劇下降，瀕危物種日益增多，資源的保護(hù)迫在眉睫。

臺(tái)灣塊菌（Tuber formosanumH.T.Hu&Y.Wang）最早在1992年被作為一個(gè)新種進(jìn)行了描述［11］，但由于沒(méi)有指定模式標(biāo)本，因此不被認(rèn)為是有效發(fā)表。2009年該物種被證實(shí)確為一個(gè)獨(dú)立的分類(lèi)單元［12］，并于2013年被正式發(fā)表［13］。目前在中國(guó)的臺(tái)灣、云南、四川、河北、內(nèi)蒙古、北京等地均發(fā)現(xiàn)了臺(tái)灣塊菌的子實(shí)體［2，14］，在江蘇南京的林下土壤中發(fā)現(xiàn)了該種的ITS序列［6］，但甘肅省尚未有臺(tái)灣塊菌分布的相關(guān)研究和記錄。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

2021年1月，本研究組從甘肅省隴南市康縣陽(yáng)壩闊葉林中化香樹(shù)（Platycarya strobilaceaSieb.et Zucc.）下采集得到若干份塊菌子實(shí)體標(biāo)本。采集地為西秦嶺南側(cè)康南林區(qū)，地理坐標(biāo)E 105°76′90.88″、N 33°1′37.4″，海拔980 m。

1.2 試驗(yàn)方法

對(duì)所采集標(biāo)本的宏觀特征進(jìn)行觀察和記錄，包括顏色、大小和形狀等；利用光學(xué)顯微鏡觀察記錄顯微結(jié)構(gòu)特征，包括子囊的形狀和大小、孢子的形狀大小等。

采用CTAB法對(duì)所采集的塊菌子實(shí)體進(jìn)行總DNA的提取，PCR擴(kuò)增其ITS序列，引物ITS5和ITS4［15］，擴(kuò)增體系為：2×F8 Fastlong PCR Master?Mix 12.5μL（0.2 U/μL）（北京艾德萊生物科技有限公司），ddH2O 8.5μL，正、反向引物各0.5μL，DNA模板3μL；擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2.5 min，隨后進(jìn)入38個(gè)循環(huán)：95℃變性10 s，50℃退火15 s，72℃延伸10 s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸4 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰的樣品依托北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將自測(cè)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的相關(guān)序列聯(lián)合建立矩陣，基于最大似然法，利用RAxML v.7.0.4 manual軟件［16］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，相關(guān)序列的選擇和外類(lèi)群的設(shè)置，參考范黎等［6］的研究結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

子囊果直徑1.3～3 cm，球形、橢球形或不規(guī)則塊狀，黑褐色，外部具不規(guī)則多角形瘤突，頂端尖或平，厚且硬，較難剖開(kāi)。包被厚150~250μm，包被細(xì)胞短柱狀，直徑5~15μm，細(xì)胞呈深紅褐色，向內(nèi)顏色變淺。產(chǎn)孢組織黑褐色，有大理石花紋狀脈絡(luò)。子囊（70~95）μm×（60~90）μm，近球形，內(nèi)含1~4個(gè)孢子（多為4個(gè)）。子囊孢子［（23.0）34.5~38.6（50.0）］μm×［（20.0）25.0~28.2（40.0）］μm，Q=（1.15）1.34~1.42（1.60），Qm=1.38±0.11，橢球形，褐色至黑褐色，具刺突，刺長(zhǎng)可達(dá)8μm（圖1）。

圖1 臺(tái)灣塊菌（zhu4361-1）的形態(tài)結(jié)構(gòu)Figure 1 Morphological features of T.formosanum（zhu4361-1）

2.2 分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果

自測(cè)的ITS序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)序列的登錄號(hào)見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)本號(hào)及其ITS序列的GenBank登錄號(hào)Table 1 Specimens vouchers and GenBank accession numbers

基于ITS用最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）顯示，所研究標(biāo)本的序列與臺(tái)灣塊菌的相關(guān)序列聚為一支，靴帶值為100%，應(yīng)屬同一物種。

圖2 基于ITS序列用最大似然法構(gòu)建的塊菌屬（Tuber）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 2 Phylogeny of Tuber inferred from the ITSdataset using RAxML

3 討論

在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的臺(tái)灣塊菌分支上，有些序列如FJ748907，被定為印度塊菌（Tuber indicumCooke&Massee.），應(yīng)該是標(biāo)本的錯(cuò)誤鑒定所致，類(lèi)似這樣被錯(cuò)定為印度塊菌的序列，在GenBank中還有很多，在使用時(shí)需要進(jìn)行甄別。

該支系上還有部分序列，如AB553388、AB553 393等，被定為喜馬拉雅塊菌（Tuber himalayenseB C Zhang&Minter.），這是由于目前學(xué)界對(duì)臺(tái)灣塊菌和喜馬拉雅塊菌的關(guān)系仍然存在爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為臺(tái)灣塊菌是喜馬拉雅塊菌的異名［17-18］。雖然喜馬拉雅塊菌發(fā)表更早，但迄今為止尚未見(jiàn)有來(lái)自于其模式標(biāo)本或模式產(chǎn)地標(biāo)本的序列，本文采信范黎等［2，19-20］的觀點(diǎn)，為該物種為臺(tái)灣塊菌［13-14］。

塊菌之所以成為世界上著名的頂級(jí)食材，除了味道獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富外，還因稀少難覓。西方國(guó)家對(duì)于塊菌采集有嚴(yán)格的限制，且通常用經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的母豬或者松露犬來(lái)協(xié)助尋找，而我國(guó)的塊菌采集目前主要是盲目地大范圍挖掘來(lái)尋找，對(duì)森林生態(tài)環(huán)境會(huì)造成很大程度的破壞［21］。野生塊菌資源被發(fā)現(xiàn)后，要避免被掠奪式采挖，應(yīng)該積極普及相關(guān)科學(xué)知識(shí)，建議在合適的時(shí)間和地點(diǎn)采集，使野生資源實(shí)現(xiàn)可持續(xù)利用。

目前，臺(tái)灣塊菌在我國(guó)已知的分布地有臺(tái)灣、四川、云南、江蘇、河北和內(nèi)蒙古寧城，甘肅隴南是該物種新發(fā)現(xiàn)的分布區(qū)。塊菌屬部分物種在歐洲等地已可進(jìn)行半人工栽培，我國(guó)學(xué)者通過(guò)10余年的研究，利用菌根合成技術(shù)，已合成了臺(tái)灣塊菌、印度塊菌、中華夏塊菌（Tuber sinoaestivumJ.O.Zhang&P.G.）、歐洲夏塊菌（Tuber aestivumVittad.）、攀枝花白塊菌（Tuber panzhihuaneseX.J.Deng&Y.Wang）以及法國(guó)黑孢塊菌（Tuber melanosporumVittad.）的菌根樹(shù)苗，并成功收獲了子囊果，為塊菌資源的可持續(xù)利用提供了技術(shù)支持［22-23］。此次臺(tái)灣塊菌標(biāo)本在甘肅隴南的獲得，證實(shí)該區(qū)域的環(huán)境和氣候條件適合該物種的生長(zhǎng)，為甘肅省保護(hù)和進(jìn)一步開(kāi)展這一珍稀食用菌的人工仿生栽培工作提供了科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，采自隴南的塊菌標(biāo)本與臺(tái)灣塊菌的相關(guān)序列以高支持率聚為一支，宏觀和顯微形態(tài)特征也與臺(tái)灣塊菌的相關(guān)描述相吻合，因此臺(tái)灣塊菌，是該物種在甘肅省的首次發(fā)現(xiàn)。