王輝麗，于樹學，郭立，梁海龍，李偉

（1.北京林業(yè)大學生物科學與技術學院，林木育種國家工程實驗室，林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，樹木花卉育種生物工程國家林業(yè)和草原局重點實驗室，北京 100083；2.河北省豐寧千松壩林場，河北 承德 068350）

樟子松（Pinussylvestrisvar.）為松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物，是我國珍貴的沙地樹種［1-2］，具有抗逆性強、生長快、成材早、耐寒性和深根性等特性［3］。樟子松是我國北方地區(qū)重要的水土保持、防風固沙和水源涵養(yǎng)樹種［4］，也是東北地區(qū)主要速生用材和庭園觀賞樹種［5］，被廣泛的應用于三北防護林建設中［6］，具有極高的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益［7］。從20世紀90年代起育種工作者開展樟子松遺傳多樣性研究，初期主要以表型測定和地理變異研究為主，秦泅華等［8］研究了樟子松生長性狀的地理變異規(guī)律，表明樟子松緯向呈現(xiàn)負向漸變趨勢，經(jīng)向呈現(xiàn)明顯的隨機變異規(guī)律；肖杰等［9］通過培育不同地區(qū)樟子松幼苗并統(tǒng)計表型變化，認為樟子松種源間種源內(nèi)都存在豐富的變異。近年來，隨著分子標記技術的發(fā)展，樟子松遺傳多樣性研究進入了分子標記時代，周志強等［10］利用ISSR技術分析了天然樟子松林在不同海拔和群落下的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)海拔和緯度差異一定程度上影響了樟子松遺傳分化，而不同的群落類型對樟子松群體的遺傳多樣性影響較低；苗禹博等［11］利用SSR標記技術分析不同地區(qū)樟子松育種資源的遺傳多樣性參數(shù)以及遺傳差異，發(fā)現(xiàn)不同樟子松群體之間的空間分布與遺傳距離呈現(xiàn)明顯的正相關關系。目前，樟子松遺傳改良正處于升級換代的關鍵時期，在高世代種子園營建過程中，樟子松引種信息不清楚，以半同胞子代為基礎的高世代育種材料親緣關系難鑒別，高世代育種材料偏少等問題不可避免產(chǎn)生，這導致出現(xiàn)樟子松高世代種子園近交水平顯著上升，近交衰退的風險增加，樟子松高世代種子園種子的遺傳多樣性降低等。因此，開展樟子松遺傳多樣性評價，建立一套快速、準確的鑒定方法，能夠為樟子松引種、營建種子園以及遺傳改良提供理論依據(jù)和奠定基礎。

簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）分子標記具有靈敏度高、多態(tài)性好、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點［12-13］，是遺傳多樣性分析及群體親緣關系區(qū)分的標記方法之一［14］，被廣泛應用于品種鑒定、多樣性分析、指紋圖譜的構建等研究中［15］。指紋圖譜能夠利用植物某個基因型特有標記對其進行準確的鑒定，是親本鑒定的依據(jù)，也是遺傳多樣性的基礎［16］，近些年在林木的應用也越來越多。劉超凡等［17］以141份楊樹無性系為材料利用篩選出的14對引物進行遺傳多樣性分析，構建其DNA指紋圖譜；毛秀紅等［18］以49份刺槐種質(zhì)為材料利用8對核心引物進行了遺傳多樣性分析，并完成了DNA指紋圖譜的構建；雷阿娜等［19］利用22對多態(tài)性高的引物構建黃帝手植柏DNA指紋圖譜；趙阿風等［20］利用8對多態(tài)性較高的引物分析了120份馬尾松無性系遺傳多樣性，成功構建其DNA指紋圖譜。而目前針對樟子松研究主要集中在遺傳多樣性、遺傳關系的分析［21］，而利用SSR分子標記對樟子松育種資源進行指紋圖譜構建鮮見報道。

本研究以紅花爾基天然林和豐寧、圍場、章古臺人工引種林，4個地區(qū)的樟子松群體作為研究對象，利用本課題組開發(fā)的12對樟子松特異SSR分子標記［22］，計算優(yōu)樹群體的遺傳多樣性參數(shù)，構建不同地區(qū)樟子松優(yōu)樹SSR指紋圖譜，分析不同地區(qū)優(yōu)良單株的遺傳多樣性差異，為樟子松的種子園營建、遺傳改良等方面提供理論依據(jù)，促進SSR分子標記在樟子松育種工作中的應用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為紅花爾基（HHEJ）、章古臺（ZGT）、圍場（WC）、豐寧（FN）共4個地區(qū)的樟子松優(yōu)良單株，其中章古臺、圍場、豐寧的種源來自紅花爾基地區(qū)天然林的混雜種子，具有相同的遺傳背景，人工林建成后，沒有進行人為選擇干預，所有引種樟子松均在自然選擇的壓力下生長、繁殖、篩選、淘汰?；拘畔⑶闆r見表1。2019年10~11月，在材料采集地選取樟子松當年生松針8~10針，裝入離心管中迅速置于液氮，做好標簽，放入-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樟子松試驗材料采集地基本信息Table 1 Basic information of collection regions of Pinussylvestris var.mongolica

1.2 樟子松DNA提取與PCR擴增

所有實驗材料的針葉DNA均采用艾科瑞生化科技有限公司植物基因組DNA提取試劑盒（貨號AG21011）按照說明書進行提取，-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應體系總體積21μL，包含1μL基因組DNA，0.3μL上游引物，1μL下游引物，0.7μL熒光引物，10μL Mix，8μL ddH2O。PCR擴增反映程序：95℃預變性5 min；95℃30 s，最適退火溫度（55℃）30 s，72℃延伸30 s，10個循環(huán)；95℃30 s，最適退火溫度降低2℃（53℃）30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。引物具體信息見表2。

表2 樟子松SSR多態(tài)性引物Table 2 Polymorphic primers of SSR in Pinussylvestris var.mongolica

1.3 數(shù)據(jù)分析

PCR擴增產(chǎn)物由北京睿博興科生物技術有限公司用毛細管電泳法檢測，利用Gene marker 2.2.0軟件進行峰值讀取，Excel記錄整理數(shù)據(jù)；用Ge?nALEx 6.5軟件計算平均等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne和Shannon信息指數(shù)I；用power?makerV3.25軟件計算多態(tài)性信息量PIC；利用Pow?erMarkerV3.25軟件計算基于等位基因頻率的Nei1983距離，并對Nei1983距離進行UPGMA聚類，用MEGA7.0.14查看聚類結果，根據(jù)聚類結果分析親緣關系情況。根據(jù)每對SSR引物的帶型結果，組合形成每個無性系的SSR指紋圖譜，根據(jù)指紋圖譜的差異，再區(qū)分樟子松優(yōu)良單株。

2 結果與分析

2.1 12對引物遺傳多樣性分析

利用12條引物擴增的SSR位點進行計算，99個樣本中共擴增出35個等位基因，其中每個位點平均擴增出5.25個等位基因，lw_isotig27940引物為最多，有15個等位基因，最少的是引物lw_isotig05123，只有2個等位基因；有效等位基因數(shù)（Ne）為1.313～10.574，平均值為3.112；Shannon’s信息指數(shù)在0.339~2.461范圍內(nèi)波動，平均值為1.124；不同位點的PIC值在0.202~0.932范圍之間變化波動很大，平均PIC值為0.558（表3）。根據(jù)Botstein（1980）的理論［23］，有1個標記為低度多態(tài)位點（PIC<0.25），4個標記為中度多態(tài)位點（0.250.5）。以上遺傳多樣性參數(shù)結果均表明99份樟子松優(yōu)良單株遺傳多樣性較高。

表3 12個引物的SSR位點多態(tài)性分析Table 3 Polymorphic analysis of SSR locus of 12 primers

2.2 樟子松優(yōu)樹群體間的遺傳關系分析

聚類分析是將育種資源根據(jù)它們綜合性狀之間的相近程度進行分類，以4個樟子松育種群體的遺傳相似系數(shù)為依據(jù)，采用UPGMA法進行聚類分析，分別得到供試樟子松群體和個體的遺傳關系聚類圖。聚類結果顯示4個群體被分為3大類群（圖1）。其中，圍場、豐寧2個群體遺傳距離最近，兩者聚為一類；其余2個種群各為一類，而紅花爾基群體遺傳距離相對較遠，距離最遠的群體是章古臺群體，說明章谷臺群體差異較大。從個體聚類圖中可以發(fā)現(xiàn)（圖2），各優(yōu)株間都存在著不同程度的親緣關系，各地區(qū)樟子松材料并沒有明顯被區(qū)分開，分散在每個類群中，來源地相同的個體并沒有根據(jù)親緣關系相似而聚為一類，表明聚類結果與樟子松種質(zhì)的地域來源并沒有顯著的相關性。

圖1 4個地區(qū)的樟子松遺傳相似系數(shù)聚類圖Figure 1 Cluster diagram of genetic similarity coefficient of 4 regions in Pinussylvestris var.mongolica

圖2 樟子松優(yōu)良單株遺傳相似系數(shù)聚類圖Figure 2 Cluster diagram of genetic similarity coefficient of excellent individuals in Pinussylvestris var.mongolica

2.3 樟子松優(yōu)樹指紋圖譜構建

構建種質(zhì)DNA指紋數(shù)據(jù)庫，最有效便捷是分子標記引物組合法［24］。所有樟子松個體并未有明顯特征譜帶，無法通過1對引物將其全部區(qū)分開，因此需要利用引物組合進行區(qū)分（圖3~6）。結果發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)引物lw_isotig27940和lw_isotig21953組合的分辨率最高，能夠鑒別40份樟子松優(yōu)良單株材料，分辨率為40.4%；使用引物lw_isotig17679、lw_isotig27940和lw_isotig21953組合，能夠區(qū)分58份樟子松優(yōu)良單株，分辨率為58.5%，使用引物lw_isotig17679、lw_isotig27940、lw_isotig21953和lw_isotig00080組合，能夠區(qū)分72份樟子松優(yōu)株，分辨率為72.7%。最終選取7對多態(tài)性信息含量高的引物lw_is?otig17679、lw_isotig21953、lw_isotig27940、lw_is?otig04306、lw_isotig00080、lw_isotig20215、lw_is?otig11166進行組合用來構建樟子松SSR指紋圖譜，分辨率為100%。7對引物構建樟子松優(yōu)株的唯一的指紋圖譜。

圖3 41份圍場樟子松優(yōu)良單株的指紋圖譜Figure 3 Fingerprint of 41 excellent individuals of Pinussylvestris var.mongolica in WC

圖4 21份豐寧樟子松優(yōu)良單株的指紋圖譜Figure 4 Fingerprint of 21 excellent individuals of Pinussylvestris var.mongolica in FN

圖5 21份紅花爾基樟子松優(yōu)良單株的指紋圖譜Figure 5 Fingerprint of 21 excellent individuals of Pinussylvestris var.mongolica in HHEJ

3 討論

種群的遺傳多樣性決定了一個種群是否能夠適應復雜的環(huán)境，遺傳多樣性越高種群對不同環(huán)境的適應性越強，就越能抵抗環(huán)境變化所產(chǎn)生的沖擊［25］。而親本的遺傳多樣性會直接影響無性系造林、母樹林、采穗圃以及種子園營建等方面。本研究利用12對SSR引物對4個群體共99份樟子松優(yōu)良單株材料進行遺傳多樣性分析，共檢測到35個等位基因，平均每個位點擴增出5.25個等位基因和3.112個有效等位基因，與王思琪［26］在紅花爾基地區(qū)挑選的3個群體（平均等位基因數(shù)分別為1.154、1.202和1.196）相比，各群體的遺傳組成更復雜，遺傳多樣性更高，也高于苗禹博［11］利用SSR標記得到的4個樟子松群體結果（平均等位基因數(shù)分別為1.852 4、1.849 8、1.999 8和2.110 5）。99份材料不同位點的Shannon’s信息指數(shù)為1.124，PIC值變化差異較大，在0.202~0.932之間，平均PIC值為0.558，也證明不同單株材料間具有較高的遺傳多樣性，具備一定的遺傳改良育種潛力，可為營建高世代種子園提供優(yōu)良豐富的原材料。同一地區(qū)的種群內(nèi)變異大，說明種群內(nèi)雜交程度較高，河北豐寧、河北圍場以及遼寧章古臺地區(qū)的人工林中林分仍有進一步選擇疏伐的空間，人工引種林應采取多無性系間隔搭配以及適宜的栽培管理措施，與內(nèi)蒙古紅花爾基天然林內(nèi)的自然雜交程度相接近。同時本研究所使用的引物從分子水平上為樟子松群體遺傳多樣性分析提供了參考價值，也可以為其他針葉樹多樣性研究提供可靠的引物資源和理論依據(jù)。

圖6 16份章古臺樟子松優(yōu)良單株的指紋圖譜Figure 6 Fingerprint of 16 excellent individuals of Pinussylvestris var.mongolica in ZGT

UPGMA聚類分析結果顯示，4個群體被分為3大類群。其中，河北圍場和豐寧2個群體聚成一類，遺傳距離相對較近；內(nèi)蒙古紅花爾基群體和遼寧章古臺群體各自為一類，與河北圍場和豐寧遺傳距離相對較遠。分析結果符合地區(qū)相近遺傳關系較近的規(guī)律，由于地理距離差異會存在基因交流的限制，不同種群在不同生境的長期適應最終導致各地區(qū)種群間差異大、種群間遺傳分化強烈。個體聚類結果則顯示各地區(qū)99份樟子松材料并沒有明顯被區(qū)分開，來源地相同的個體并沒有根據(jù)親緣關系相似而聚為一類。這可能由于個體間發(fā)生的遺傳變異在4個地區(qū)群體中均存在或存在相似遺傳變異，總體遺傳變異的比例、模式相近，所以在聚類過程中不同群體內(nèi)的個體并不會因為地區(qū)差異而聚成一類。

4 結論

SSR分子標記特異性強、譜帶清晰、數(shù)據(jù)準確，適合大量資源的指紋圖譜構建工作［27］。本研究利用12對SSR引物對4個地區(qū)種群的99份樟子松優(yōu)良單株分別構建指紋圖譜，由于樟子松優(yōu)良單株的多態(tài)性位點豐富，1條引物無法對不同個體進行鑒別。利用2對引物以上組合可以將4個種群的個體鑒定出來，不同引物組合在鑒定不同種群時有不同的分辨 率，利 用lw_isotig17679、lw_isotig21953、lw_is?otig27940、lw_isotig02842、lw_isotig00080、lw_is?otig05123、lw_isotig02138進行組合可以將99份材料鑒定出來，分辨率為100%。樟子松指紋圖譜能夠使每份優(yōu)良單株具有唯一的一套DNA指紋，這可為樟子松種質(zhì)資源鑒定、管理與保護奠定基礎和提供技術支撐，為樟子松的引種、種子園營建和遺傳改良提供科學的理論依據(jù)。