郭連安，莫讓瑜，譚均，潘媛，陳大霞

（重慶市中藥研究院，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心重慶分中心，重慶市中藥良種選育與評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心，重慶 400065）

全球變暖導(dǎo)致極端高溫天氣頻發(fā)，高溫已成為影響植物產(chǎn)量的主要因素之一。高溫不僅影響植物的表型，還會(huì)破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡［1］。研究表明，高溫脅迫會(huì)抑制植物各種生理和生化反應(yīng)，包括水分利用、細(xì)胞膜穩(wěn)定性、光合作用、次級(jí)代謝產(chǎn)物和植物激素水平等變化［2］。因此，研究植物如何響應(yīng)高溫脅迫對(duì)于提高植物耐熱性具有重要意義。

半夏（Pinellia ternate）是天南星科半夏屬植物，為我國(guó)傳統(tǒng)的常用大宗中藥材之一，具有悠久的藥用歷史，用于止咳祛痰、鎮(zhèn)吐、抗癌、抗早孕、抑制心律失常和炎癥等多種病癥［3］。目前，有關(guān)半夏的研究多集中于栽培技術(shù)［4］、有效成分［5］和藥理作用［6］等方面。半夏對(duì)高溫非常敏感，溫度過(guò)高會(huì)出現(xiàn)倒苗，人們逐漸關(guān)注到高溫對(duì)半夏的生理特性［7-8］、植物激素［9］和有效成分含量［10］等方面的影響。然而，從分子生物學(xué)水平上探究半夏在溫度脅迫下的應(yīng)對(duì)機(jī)制，篩選半夏熱脅迫基因，提高半夏的耐熱性是減輕高溫對(duì)半夏生長(zhǎng)造成傷害的最有效方法。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已普遍應(yīng)用于藥用植物功能基因組的研究，能在單核苷酸水平對(duì)藥用植物的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，從而快速地獲取研究對(duì)象在某一狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄本信息［11-12］。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能研究藥用植物活性成分的生物合成與調(diào)控，挖掘參與逆境脅迫調(diào)控的重要功能基因，有助于天然藥物的開(kāi)發(fā)和高產(chǎn)抗逆品種的選育。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，已獲得高溫脅迫下牡丹Paeo?nia suffruticosa［13］、薄荷Mentha haplocalyx［14］、黃花蒿Artemisisannua［15］等藥用植物轉(zhuǎn)錄組信息，為藥用植物的遺傳改良提供了豐富的基因資源。本研究對(duì)高溫脅迫下半夏葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選和挖掘半夏熱脅迫基因，為培育半夏耐熱品種提供基因資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

半夏種源采自重慶市萬(wàn)州區(qū)，經(jīng)重慶市中藥研究院陳大霞研究員鑒定為天南星科半夏屬植物半夏（Pinellia ternate）的塊莖。選取大小一致的半夏塊莖播種于花盆中，培養(yǎng)基質(zhì)為土壤∶蛭石=2∶1，每盆20顆，在人工氣候箱中培養(yǎng)，白天溫度25℃，晚上溫度20℃，光周期為12 h光照12 h黑暗，光照4 000 lx。待半夏植株長(zhǎng)到約15 cm時(shí)，在人工氣候箱中進(jìn)行38℃高溫處理，12 h后取半夏葉片，用錫箔紙包裹儲(chǔ)藏于液氮中，待用。

1.2 總RNA的提取、文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序

采用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取半夏葉片總RNA，用Nanodrop超微量分光光度計(jì)（Thermo）檢測(cè)RNA的濃度和純度，利用瓊脂糖凝膠電泳（150 V，20 min）分析RNA質(zhì)量。檢測(cè)合格的6個(gè)半夏葉片RNA樣品委托北京諾禾致源科技股份有效公司進(jìn)行cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝

轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)經(jīng)去除帶接頭和低質(zhì)量的reads后，獲得Clean reads。利用Trinity軟件對(duì)Clean reads進(jìn)行拼接和組裝，獲得不同大小的轉(zhuǎn)錄本（Transcripts）和基因（Unigenes）。

1.4 差異基因分析

采用FPKM值估算基因表達(dá)水平，采用Cuf?flinks軟件對(duì)測(cè)序得到的FPKM值進(jìn)行分析［16-17］，以Padj<0.05（Padj為矯正后的P）且log2（fold change）≥2為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因（DEGs）。

1.5 DEGs功能注釋及GO、KEGG富集分析

將DEGs與NR（NCBI non-redundant protein sequences）、NT（NCBI nucleotide sequences）、PFAM（Protein family）、KOG（euKaryotic Ortholog Groups）、Swiss Prot（Swiss Prot protein database）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）和GO（Gene Ontology）等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得DEGs的功能注釋信息，并對(duì)DEGs做GO和KEGG富集分析。

1.6 qRT-PCR分析

采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物，內(nèi)參基因?yàn)镻tGAPDH［7］（表1）。采用M 5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover試劑盒（Mei5bio），以500 ng RNA為模板反轉(zhuǎn)成cDNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒（Vazyme）進(jìn)行qRT-PCR，20μL反應(yīng)體系為：模板RNA 2μL、上游引物和下游引物各1μL（引物終濃度0.2μmol/L），10μL ChamQTMUniversal SYBR qPCR Master Mix，用ddH2O補(bǔ)足至20μL。所用程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5 min；94°C變性10 s，60°C退火30 s，72°C延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 實(shí)時(shí)定量熒光基因引物序列Table 1 Real-time quantitative gene primer sequences

1.7 轉(zhuǎn)錄組序列號(hào)

全部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可在美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）SRA數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢（PRJNA781127）。

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)組裝

經(jīng)高溫脅迫處理后，半夏對(duì)照組（CK）和高溫處理組（T）樣本經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得Raw reads 131 281 455條。將有接頭的、低質(zhì)量的Raw reads進(jìn)行過(guò)濾，對(duì)照組和高溫處理組分別獲得62 973 770條和65 240 619條Clean reads，共包含38.48 Gb Clean bases（表2）。經(jīng)測(cè)序質(zhì)量控制分析，6個(gè)半夏葉片測(cè)序樣本的Q20≥97.23%，Q30≥92.94%，GC con?tent≥48.84%（表2），表明這6個(gè)半夏葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的質(zhì)量較高，可用于De novo組裝和數(shù)據(jù)分析。

表2 高溫脅迫下半夏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量情況Table 2 Sequencing quality of transcriptome of Pinellia ternata under high temperature stress

通過(guò)Trinity軟件對(duì)過(guò)濾后的Clean reads進(jìn)行拼接，共獲得281 189個(gè)轉(zhuǎn)錄本，總長(zhǎng)度275 002 094 bp，平均長(zhǎng)度978 bp，N50長(zhǎng)度為1 270 bp（表3）。通過(guò)對(duì)所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行進(jìn)一步聚類和組裝，共獲得91 526條Unigenes，總長(zhǎng)度82 269 071 bp，平均長(zhǎng)度899 bp，N50平均長(zhǎng)度1 214 bp。Unigenes長(zhǎng)度主要分布在300~500 bp，共有36 904個(gè)，占總數(shù)的40.32%；長(zhǎng)度為500~1 000 bp的轉(zhuǎn)錄本29 243個(gè)，占比31.95%；長(zhǎng)度為1 000~2 000 bp的轉(zhuǎn)錄本17 362個(gè)，占比18.97%；長(zhǎng)度大于2 000 bp的轉(zhuǎn)錄本有8 017個(gè)，占比8.76%（表3）。轉(zhuǎn)錄本和Unigenes的分布趨勢(shì)不同，分布在500~1 000 bp的轉(zhuǎn)錄本最多，而Unigenes的數(shù)量隨序列長(zhǎng)度的增加而減少。

表3 高溫脅迫下半夏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝統(tǒng)計(jì)Table 3 Assemble statistics of transcriptome data of Pinellia ternata under high temperature stress

2.2 轉(zhuǎn)錄組Unigenes的功能注釋

將Unigenes序列分別在不同的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，共有45 409條Unigenes獲得注釋，占比46.61%。其中獲得注釋比例前三的數(shù)據(jù)庫(kù)是NR、PFAM和GO，分別占比39.47%（36130條）、30.05%（27 506條）和30.05%（27 505條）（表4）。根據(jù)NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的物種注釋比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大部分Unigenes（27.3%）的E值分布于10-15~10-5（圖1A）；40.2%的Unigenes的序列相似度在60%~80%（圖1B）；此外，分別有12.5%和12.1%的Unigenes注釋到非洲油棕和海棗（圖1-C）。

圖1 Unigene的NR注釋Figure 1 NR annotation of transcriptome for Unigenes

表4 Unigene的注釋統(tǒng)計(jì)Table 4 Unigenes annotation statistics

2.3 差異表達(dá)分析

通過(guò)將對(duì)照組和高溫處理組的半夏葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，以Padj<0.05（Padj為矯正后的P）且|log2（fold change）|≥2為判斷標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs。圖2結(jié)果表明：對(duì)照組和高溫處理組之間共篩選到1 716個(gè)DEGs，與對(duì)照組相比，高溫處理組中有1 138個(gè)DEGs表達(dá)量上調(diào)，578個(gè)DEGs表達(dá)量下調(diào)。

圖2 差異表達(dá)基因的火山圖Figure 2 Volcano map of differentially expressed genes

2.4 DEGs的GO富集分析

將對(duì)照組與高溫處理組半夏葉片之間的DEGs進(jìn)行GO（Gene ontology）功能注釋分析，611個(gè)DEGs被注釋到生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3大類，其中有356個(gè)DEGs表達(dá)量上調(diào)，255個(gè)DEGs表達(dá)量下調(diào)。圖3為DEGs在GO數(shù)據(jù)中顯著富集的GO term（P<0.005）。在生物學(xué)過(guò)程方面，除單有機(jī)體細(xì)胞器組織（22個(gè)，占3.60%）得到最顯著富集外，還有化學(xué)響應(yīng)（20個(gè)，占3.27%）、激素響應(yīng)（14個(gè)，占2.29%）、有機(jī)物響應(yīng)（14個(gè)，占2.29%）和生長(zhǎng)素響應(yīng)（13個(gè)，占2.13%）等與逆境脅迫相關(guān)的GO term，說(shuō)明高溫脅迫已影響半夏的正常生命活動(dòng)。在細(xì)胞組分方面，DEGs主要富集在轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體（45個(gè)，占7.36%）、轉(zhuǎn)移復(fù)合體，轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)（22個(gè)，占3.60%）和宿主細(xì)胞核（18個(gè)，占2.95%）等GO term。在分子功能方面，DEGs主要在內(nèi)肽酶活性（27個(gè)，占4.42%）、血紅素結(jié)合（23個(gè)，占3.76%）和四吡咯結(jié)合（23個(gè)，占3.76%）等GO term得到顯著富集，說(shuō)明高溫脅迫已導(dǎo)致植物細(xì)胞被破壞。

圖3 高溫脅迫處理下半夏轉(zhuǎn)錄組DEGS的GO分類Figure 3 Go classification of DEGs in Pinellia ternata transcriptome under high temperature stress treatment

2.5 DEGs的KEGG分類與通路富集分析

將對(duì)照組與高溫處理組半夏葉片之間的DEGs進(jìn)行全基因組及代謝途徑調(diào)控網(wǎng)絡(luò)富集分析，共有194個(gè)DEGs注釋到細(xì)胞過(guò)程（3條）、環(huán)境信息處理（2條）、遺傳信息處理（15條）、代謝（41條）和生物系統(tǒng)（2條）5大類63條KEGG代謝通路，其中有120個(gè)DEGs表達(dá)量上調(diào)，74個(gè)DEGs表達(dá)量下調(diào)。圖4為DEGs富集程度排名前30的代謝通路，獲得DEGs注釋數(shù)量最多的3個(gè)代謝通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工（68個(gè)，占35.05%）、內(nèi)吞作用（25個(gè)，占12.89%）和剪接體（23個(gè)，占11.86%）。進(jìn)一步對(duì)上調(diào)和下調(diào)的DEGs進(jìn)行代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)高溫脅迫后半夏葉片中表達(dá)量上調(diào)的DEGs主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、內(nèi)吞作用和剪接體有關(guān)（圖5A）；表達(dá)量下調(diào)的DEGs主要集中在氨基糖和核苷酸糖代謝、淀粉和蔗糖代謝及半胱氨酸和氮代謝等代謝通路（圖5B）。

圖4 高溫脅迫下DEGs富集程度排名前30的代謝通路Figure 4 Top 30 of metabolic pathways enrichment of DEGs under high temperature stress treatment.

圖5 高溫脅迫處理的半夏轉(zhuǎn)錄組DEGs KEGG通路富集分析Figure 5 KEGG pathway encichment of DEGs in Pinellia ternata transcriptome under high temperature stress treatment

2.6 差異表達(dá)基因功能鑒定

2.6.1 半夏葉片植物激素相關(guān)DEGs分析 高溫脅迫可能會(huì)引起植物細(xì)胞內(nèi)激素代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生變化。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白基因PtARP1、赤霉素調(diào)控蛋白基因PtGRP1和脫落酸應(yīng)答元件結(jié)合因子基因PtABF表達(dá)量上調(diào)，而11個(gè)生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白基因PtARP、2個(gè)細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑負(fù)調(diào)控基因PtARR（PtARR1、PtARR2）和赤霉素調(diào)控蛋白基因PtGRP2表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明高溫脅迫下不同植物激素響應(yīng)基因的表達(dá)模式存在一定的差異。

2.6.2 半夏葉片氧化還原系統(tǒng)DEGs分析 高溫脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧會(huì)破壞細(xì)胞膜，而保護(hù)酶系統(tǒng)可以清除活性氧，減輕活性氧所造成的細(xì)胞損傷。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)：在高溫脅迫下，7個(gè)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因PtGST表達(dá)量不同程度上調(diào)，4個(gè)過(guò)氧化物酶基因PtPOD和2個(gè)過(guò)氧化氫酶基因PtCAT表達(dá)量下調(diào)（表6）。

表6 氧化還原系統(tǒng)DEGs分析Table 6 Analysis of DEGs involved in oxidation-reduction system

2.6.3 半夏葉片熱激蛋白DEGs分析 熱激蛋白是植物受到高溫脅迫后產(chǎn)生的一類新的蛋白質(zhì)，可以提高植物的耐熱性。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)：半夏葉片中有23個(gè)熱激蛋白基因PtHSP在高溫脅迫下表達(dá)量呈現(xiàn)不同程度的上調(diào)表達(dá)（表7）。這些結(jié)果表明高溫脅迫下，半夏葉片中的熱激蛋白基因表達(dá)量增加，對(duì)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、提高抵御高溫脅迫的能力具有重要作用。

表7 熱激蛋白相關(guān)DEGs分析Table 7 Analysis of DEGs encoding heat shock protein

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，隨機(jī)選取9個(gè)在高溫脅迫下上調(diào)和下調(diào)的DEGs，分別是3個(gè)生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白基因PtARP（PtARP3、PtARP5、PtARP12）、細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑負(fù)調(diào)控基因PtARR1、過(guò)氧化物酶基因PtPOD1、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因PtGST2和3個(gè)熱激蛋白基因PtHSP（PtHSP1、PtHSP2、PtHSP23），使用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。圖6的結(jié)果表明，9個(gè)DEGs在高溫脅迫下的表達(dá)量變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相對(duì)可信。

表5 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑DEGs分析Table 5 Analysis of DEGs involved in plant hormone signal transduction

圖6 高溫脅迫下DEGs的qRT-PCR分析Figure 6 qRT-PCR analysis of DEGs under high temperature stress

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，隨著全球氣候變暖加劇，短期或長(zhǎng)期極端高溫天氣頻發(fā)，給植物的產(chǎn)量造成嚴(yán)重的影響。高溫脅迫會(huì)改變植物形態(tài)、生理生化過(guò)程和基因表達(dá)，阻礙植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物耐熱性已成為研究熱點(diǎn)。半夏的生長(zhǎng)發(fā)育極易受到高溫的傷害，在生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致半夏地上部分倒苗，嚴(yán)重影響半夏的產(chǎn)量積累。薛建平等［18］研究發(fā)現(xiàn)，隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，半夏葉片、葉柄和塊莖中的SOD和POD活性逐漸下降，葉片和葉柄中的MDA含量顯著增加。因此，進(jìn)一步闡明半夏響應(yīng)高溫脅迫的生物學(xué)機(jī)制，對(duì)于提高半夏的耐熱性具有重要的指導(dǎo)作用。本研究通過(guò)Illu?mina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)38℃高溫脅迫處理的半夏葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，樣本平均數(shù)據(jù)量為6.41 Gb，經(jīng)Trinity軟件組裝獲得91 526條Unigene，平均長(zhǎng)度899 bp，N50平均長(zhǎng)度1 214 bp。半夏經(jīng)高溫脅迫后共有1 716個(gè)DEGs差異表達(dá)，其中表達(dá)水平上調(diào)1 138個(gè)，下調(diào)578個(gè)。qRT-PCR分析表明9個(gè)DEGs在高溫脅迫下表達(dá)量變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

GO功能注釋分析表明高溫脅迫下DEGs主要集中在轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、內(nèi)肽酶活性、血紅素結(jié)合和四吡咯結(jié)合。轉(zhuǎn)錄組因子是一類能夠以序列特異性方式結(jié)合真核基因啟動(dòng)子區(qū)域并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，在植物逆境脅迫中起著重要作用，當(dāng)植物遭受高溫、干旱等逆境脅迫時(shí)，通過(guò)激活基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)逆境脅迫信號(hào)的反應(yīng)。在擬南芥Arabi?dopsisthaliana中，提高轉(zhuǎn)錄因子CBF1和CBF4的表達(dá)量可以激活冷脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，并提高擬南芥的耐冷性［19-20］。在番茄Solanum lycopersicum中，過(guò)表達(dá)熱激轉(zhuǎn)錄因子HsfA1可提高番茄的耐熱性［21］。在GO分析中，富集DEGs最多的是轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體，說(shuō)明高溫脅迫后半夏葉片中大量轉(zhuǎn)錄因子被激活，并通過(guò)誘導(dǎo)高溫脅迫基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)半夏對(duì)高溫脅迫的應(yīng)答。內(nèi)肽酶是蛋白水解酶的一種，參與植物衰老、生物脅迫和非生物脅迫等生命活動(dòng)。高溫脅迫下，內(nèi)肽酶活性富集了較多的DEGs，表明高溫脅迫導(dǎo)致了半夏葉片內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂。KEGG代謝通路分析發(fā)現(xiàn)富集DEGs最多的代謝途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的加工主要包括糖基化、羥基化、?；投蜴I形成等，其中最主要的加工是糖基化，絕大部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白質(zhì)都會(huì)被糖基化，蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)糖基化作用才能進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)和正確折疊。本研究中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工代謝途徑富集了的DEGs最多，說(shuō)明該代謝途徑在半夏響應(yīng)高溫脅迫的過(guò)程中起著重要作用［22-23］。

高溫脅迫可引起植物體內(nèi)激素含量和活性的變化，從而提高對(duì)逆境的抵抗或適應(yīng)能力。半夏轉(zhuǎn)錄組DEGs注釋結(jié)果表明，生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白基因的表達(dá)受到高溫脅迫的雙向調(diào)控，其中表達(dá)水平下調(diào)的生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白DEGs明顯多于表達(dá)上調(diào)的DEGs。同時(shí)，高溫脅迫還促進(jìn)了赤霉素調(diào)控蛋白基因Pt?GRP1和脫落酸應(yīng)答元件結(jié)合因子基因PtABF的表達(dá)。研究表明，脫落酸應(yīng)答元件結(jié)合因子ABF是一種bZIP轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激活活性，參與植物非生物脅迫應(yīng)答和脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，水稻Oryza sativa OsABF1/OsbZIP12受鹽、干旱和脫落酸等非生物脅迫誘導(dǎo)，上調(diào)其表達(dá)量可增加水稻的耐旱性［22-23］。本研究中，PtABF的表達(dá)量上調(diào)可能有助于提高半夏對(duì)高溫脅迫的抗性。

植物遭受逆境脅迫的主要特征是活性氧代謝的失調(diào)。高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)活性氧大量積累，而酶促防御系統(tǒng)（包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等）通過(guò)清除活性氧，減輕高溫造成的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)損傷，增加對(duì)高溫脅迫的抗性。本研究中，7個(gè)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因PtGST的表達(dá)量在高溫脅迫脅迫下顯著增加，表明半夏通過(guò)谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶清除高溫脅迫產(chǎn)生的活性氧和調(diào)控谷胱甘肽的代謝，以減輕高溫造成的損傷。

研究表明，高溫下植物產(chǎn)生的熱激蛋白HSPs可提高植物耐熱性，保護(hù)機(jī)體蛋白質(zhì)免遭損傷或修復(fù)已受損傷的蛋白質(zhì)，從而對(duì)植物起保護(hù)作用，并在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和抵御逆境脅迫等方面具有重要作用［24］。在擬南芥中，過(guò)表達(dá)百合Lilium lancifolium LlHSP70基因可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)高溫的耐受性［25］。在擬南芥中過(guò)表達(dá)菊花Chrysanthemum HSP70基因可提高擬南芥對(duì)高溫、干旱和鹽脅迫的抗性［26］。本研究表明，半夏經(jīng)高溫脅迫后葉片中27個(gè)PtHSP表達(dá)水平顯著上調(diào)，且PtHSP1、PtHSP3、

PtHSP4、PtHSP7、PtHSP9、PtHSP11、PtHSP13、PtHSP19、PtHSP20、PtHSP21、PtHSP22和PtHSP23在高溫處理后表達(dá)量上調(diào)3倍以上，說(shuō)明PtHSP基因能迅速響應(yīng)高溫脅迫，以維持半夏葉片細(xì)胞的正常生理功能。綜上，通過(guò)對(duì)高溫脅迫后的半夏葉片進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，挖掘到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氧化還原系統(tǒng)和熱激蛋白等候選基因，為培育半夏耐熱品種提供基因資源，也為一步深入研究高溫影響半夏的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。