劉耀川，龔商羽

（1.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.錦州市動物疫病預防控制中心，遼寧 錦州 121000）

鵪鶉作為野生鳥類，長期以來廣泛分布于自然環(huán)境中。近年來隨著人們生活水平不斷提高，蛋用及肉用鵪鶉的飼養(yǎng)規(guī)模也逐漸擴大，而與之相關的細菌病的報道也隨之增加，嚴重制約了鵪鶉規(guī)模化養(yǎng)殖的發(fā)展。由于野生鵪鶉在自然環(huán)境中具有較高的自由度，因此也成為病原的傳播媒介。特別是在禽類養(yǎng)殖密度較高及人類生活區(qū)附近，極易造成病原快速傳播，不僅威脅養(yǎng)殖業(yè)安全，同時也對公共衛(wèi)生安全造成嚴重威脅。

本研究對阜新地區(qū)鵪鶉飼養(yǎng)場及自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的急性死亡鵪鶉進行病原菌分離、鑒定，為該地區(qū)鵪鶉細菌病治療、預防提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 樣本來源 在阜新市某蛋用鵪鶉養(yǎng)殖場內(nèi)，選取急性死亡鵪鶉（69只）及臨床表現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、羽毛松亂、縮頭、排白色糞便的鵪鶉（155只）；同時收集在自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的野生鵪鶉尸體14只。

1.1.2 主要儀器 解剖用手術器械、酒精燈、無菌棉拭子、5mL離心管、10mL離心管、高壓立式蒸汽滅菌器（DOZ/CQ30L）、生物安全柜（AirBio 2680C）、立式電熱恒溫培養(yǎng)箱（HitPot 6079）、電熱恒溫振蕩培養(yǎng)器（TZD-68C）、酒精燈、各量程微量移液器（Eppednorf）等，由阜新市動物疫病預防控制中心提供。

1.1.3 主要試劑 沙門氏菌生化鑒定管（11種×10支，J2201）、腸桿菌科細菌生化鑒定管（15種×10支，J2002）購于杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏染色液試劑盒（HB8278）購于青島海博科技公司；普通瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯、S-S瓊脂（Salmonella Shigella agar）、麥康凱瓊脂購于北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集 對死亡鵪鶉尸體胸廓區(qū)域用碘酊-酒精消毒后，用手術剪沿胸廓正中線剪開暴露肝臟。將手術刀片用酒精燈灼燒后對肝臟組織表面燒烙，然后切取合適大小的肝臟組織塊，存放于含有無菌生理鹽水的離心管中，將離心管密封、標記后，置于4℃保溫箱中，盡快送至實驗室。

對患病鵪鶉，用無菌棉拭子采集其泄殖腔內(nèi)容物。采集后將棉拭子頭存放于含無菌生理鹽水的離心管中，標記后置于4℃保溫箱中送至實驗室。

1.2.2 培養(yǎng)基配置 按照產(chǎn)品說明書要求，用無菌去離子水對NB、營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、S-S瓊脂進行配置、分裝。NB分裝于5mL離心管中，營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、S-S瓊脂分別制備成90mm的固體培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均需在無菌生物安全柜中制備，密封后在37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，檢菌合格后放于4℃冰箱中保存、備用。

1.2.3 病原菌擴增 在無菌生物安全柜中，用無菌眼科剪將死亡鵪鶉肝臟在存放的離心管中充分剪碎。在震蕩混勻儀上對離心管充分震動、混勻，用同樣的方法處理盛放泄殖腔棉拭子頭的離心管。樣品充分混勻后，取其中的生理鹽水混勻液100μL接種于5mL的NB肉湯中。將NB肉湯置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，37℃180rpm過夜培養(yǎng)。

取100μL過夜培養(yǎng)的NB肉湯，在無菌生物安全柜中用三角玻璃棒將其均勻涂布于普通營養(yǎng)瓊脂上，正置片刻，待菌液完全吸收后，將瓊脂培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h。觀察培養(yǎng)的普通瓊脂，選取大小不同的單獨菌落，進行NB肉湯擴增。并將擴增后的菌液保存于終濃度為30%的甘油溶液中，于-80℃保存，待檢。

1.2.4 病原菌分離 用接種針取保存的甘油菌，分別于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和S-S瓊脂培養(yǎng)基中進行劃線培養(yǎng)。劃線完畢后，將培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，需氧條件下培養(yǎng)18～24h。

1.2.5 革蘭氏染色鏡檢 在麥康凱培養(yǎng)基中選取經(jīng)典紅色圓形、具有金屬光澤的單獨菌落；在S-S瓊脂培養(yǎng)基中，選取無色、圓形、小菌落，進行NB純化培養(yǎng)。用接種環(huán)分別挑取等量的生理鹽水和細菌培養(yǎng)物，充分混合后，按革蘭氏染色試劑盒說明書操作要求對病原菌進行染色、鏡檢，觀察細菌染色結果與形態(tài)，對其進行初步鑒定。

1.2.6 生化反應鑒定 取初步鑒定的大腸桿菌分離株和沙門氏菌分離株，在無菌生物安全柜中，分別接種于腸桿菌科生化鑒定管和沙門氏菌生化鑒定管中。每個鑒定管在接種后應用1滴液體石蠟對反應面進行封閉處理，并用封口膜對鑒定管進行封口、標記后，將鑒定管放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)后，根據(jù)反應管中顏色變化，對照編碼手冊對病原分離株進行賦碼。最終根據(jù)賦碼結果確定病原菌分離株的種類。

2 結果與分析

2.1 病原菌初步分離結果根據(jù)鑒別培養(yǎng)基生長特點，以及革蘭氏染色、鏡檢觀察，在麥康凱瓊脂上見到呈現(xiàn)典型金屬紅色光澤、圓形小菌落，革蘭氏染色鏡檢呈兩端鈍圓、散在、無芽孢的陰性短桿菌為大腸桿菌疑似株；在麥康凱瓊脂呈現(xiàn)半透明、圓形隆起、灰白色小菌落，在S-S瓊脂中呈現(xiàn)無色、圓形小菌落，革蘭氏染色為陰性短桿菌、中等大小、兩端鈍圓，為沙門氏菌疑似株。

在83只死亡鵪鶉肝臟樣本中，得到大腸桿菌疑似分離株42株、沙門氏菌疑似分離株33株；在155份泄殖腔棉拭子樣本中，得到大腸桿菌疑似分離株92株、沙門氏菌疑似分離株66株。

2.2 病原菌生化鑒定結果對初步分離的疑似病原菌分離株進行生化反應鑒定，并根據(jù)編碼結果進行病原菌種類確定，最終在134株大腸桿菌疑似株中確定大腸桿菌分離株71株；在99株沙門氏菌疑似株中確定沙門氏菌分離株36株。

根據(jù)不同樣品來源對病原菌分離結果進行分析可知，在飼養(yǎng)場獲得的224個樣品中（69個尸體樣本、155個泄殖腔棉拭子樣本）共分離到大腸桿菌57株、沙門氏菌22株。其中69個尸體樣本中大腸桿菌和沙門氏菌分別為27株和12株；155個棉拭子樣本中大腸桿菌和沙門氏菌分別為30株和10株。在14個野生鵪鶉尸體中分離到大腸桿菌和沙門氏菌各14株。綜合分析，本研究大腸桿菌和沙門氏菌的總體分離率分別為29.8%（71/238）和15.1%（36/238），占比分別為66.4%（71/107）和33.6%（36/107）。病原菌分離、鑒定具體結果見表1及圖1。

表1 鵪鶉源病原菌分離、鑒定結果

3 討論

大腸桿菌和沙門氏菌是禽類細菌病的主要病原，如能夠引起雞白痢、腹瀉、禽大腸桿菌病等，對規(guī)模化禽類養(yǎng)殖威脅巨大。鵪鶉作為近年來新興的集約化飼養(yǎng)禽類，因具有較高的經(jīng)濟附加值，其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中的地位逐漸提高。隨著飼養(yǎng)規(guī)模不斷壯大，鵪鶉細菌病的報道也逐漸增多，如李超等報道，揚州地區(qū)鵪鶉養(yǎng)殖場因沙門氏菌感染而造成大量死亡；夏維婕等對山東地區(qū)某鵪鶉養(yǎng)殖場調(diào)查發(fā)現(xiàn)，引起該場鵪鶉死亡的主要病原菌為大腸桿菌；張宗植等對延吉市某鵪鶉養(yǎng)殖場死亡病例研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌和沙門氏菌混合感染是造成死亡的最主要致病菌；陳鑫等報道，南通地區(qū)鵪鶉飼養(yǎng)場送檢的10只鵪鶉，沙門氏菌分離率為100%；杭柏林等報道，在河南新鄉(xiāng)某鵪鶉養(yǎng)殖場死亡病例中，致病性大腸桿菌檢出率為100%；李章程等對四川地區(qū)產(chǎn)蛋鵪鶉死亡病例檢測結果表明，該場致病性大腸桿菌檢出率為100%。本研究對阜新地區(qū)野生及飼養(yǎng)鵪鶉進行病原分離、鑒定，結果表明大腸桿菌和沙門氏菌為最主要致病菌，分離率分別為29.8%及15.1%。與報道數(shù)據(jù)相比分離率有一定差異，可能與地區(qū)性優(yōu)勢菌株差異有關。對自然環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的野生鵪鶉尸體樣本分析發(fā)現(xiàn)，野生鵪鶉的混合感染情況十分嚴重，在14只野生鵪鶉尸體中均發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和沙門氏菌混合感染。對飼養(yǎng)場內(nèi)獲得的樣本數(shù)據(jù)進行分析也可發(fā)現(xiàn)，在病死鵪鶉尸體獲得的69份肝臟樣本中，大腸桿菌和沙門氏菌的分離率分別為39.1%和17.4%，而在患病但未死亡的鵪鶉泄殖腔棉拭子樣本中，上述分離率則為19.4%和6.5%，顯著低于死亡病例中的分離率，推測2種病原菌在鵪鶉感染、患病直至死亡的整個過程中均扮演著重要角色。建議該鵪鶉養(yǎng)殖場根據(jù)研究結果，合理制定治療方案及周圍環(huán)境綜合防控方案。