杜鵬舉，郭琴，潘春勤，劉杰

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種能夠引起多系統(tǒng)、多臟器功能受損的免疫性疾病，好發(fā)于20～40歲育齡期婦女［1］。狼瘡腎炎是SLE 最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，主要是由于SLE 過(guò)程中產(chǎn)生的自身免疫性抗原-抗體復(fù)合物沉積在腎臟中造成的損害所致，臨床表現(xiàn)為血尿、蛋白尿、水腫等［2］。簇分化抗原36（CD36）是一種清道夫受體，廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，在自身免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝中有重要作用［3-4］。研究表明CD36 與慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［5］。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性的非編碼RNA，與自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［6］。Perez-Hernandez 等［7］研究表明與健康對(duì)照組比較，狼瘡腎炎病人尿液外泌體中微小RNA-335（miR-335）表達(dá)顯著上調(diào)。狼瘡腎炎病人不同疾病活動(dòng)度評(píng)分，決定不同劑量激素的使用及不同免疫制劑的選擇。本研究通過(guò)檢測(cè)狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335 水平，分析二者與狼瘡腎炎病人疾病活動(dòng)度的關(guān)系，可能為臨床狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度的診斷提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取仙桃市第一人民醫(yī)院2017 年5 月至2020 年6 月收治的SLE 病人138 例為研究對(duì)象，其中男42 例，女96 例，年齡（31.26±9.85）歲，范圍為18～51歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（24.28±3.12）kg/m2；同期選取在該院進(jìn)行健康體檢人員120 例為對(duì)照組，其中男43 例，女77 例，年齡（32.45±9.12）歲，范圍為18～50歲，BMI為（23.65±2.68）kg/m2。兩組性別、年齡、BMI比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合中國(guó)狼瘡腎炎診斷和治療指南編寫組制定的狼瘡腎炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］；（2）經(jīng)穿刺活檢確診；（3）≥18 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等其他自身免疫性疾病病人；（2）妊娠期及哺乳期婦女；（3）合并惡性腫瘤病人；（4）合并心、肝等重大臟器功能不全者。

所有研究對(duì)象或其近親屬簽署知情同意書，本研究經(jīng)仙桃市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核、批準(zhǔn)后實(shí)施（批號(hào)20170523）。

1.2 主要試劑及儀器RNA 提取試劑盒（貨號(hào)DP419），天根生化科技（北京）有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)RR047A）、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒（貨號(hào)RR820B），日本Takara 公司；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）CD36 試劑盒（貨號(hào)ab267614），英國(guó)abcam 公司；引物，生工生物工程（上海）股份有限公司；qRT-PCR 儀CFX96，美國(guó)BIO-RAD 公司；Nanodrop one 2000 分光光度計(jì)，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 血液樣品采集 狼瘡腎炎病人于住院次日清晨，健康體檢者于體檢當(dāng)日清晨采集空腹靜脈血3 mL，置于離心管中，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，轉(zhuǎn)移上清并分裝至新離心管中，-80 ℃超低溫冰箱保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 一般資料收集及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 收集狼瘡腎炎病人性別、年齡、BMI 及SLE 疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）評(píng)分。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)狼瘡腎炎病人血清白蛋白、血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白；全自動(dòng)特定蛋白分析儀檢測(cè)C 反應(yīng)蛋白（CRP）、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4；血細(xì)胞自動(dòng)分析儀檢測(cè)白細(xì)胞、紅細(xì)胞沉降率（ESR）；全自動(dòng)尿沉渣定量分析儀檢測(cè)尿沉渣紅細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度分組 根據(jù)ISN/RPS 關(guān)于狼瘡腎炎活動(dòng)評(píng)分系統(tǒng)分級(jí)法［9］對(duì)腎小球、腎小管進(jìn)行定量評(píng)分，活動(dòng)指數(shù)為腎小球、腎小管各項(xiàng)指標(biāo)之和。根據(jù)活動(dòng)指數(shù)將狼瘡腎炎病人分為非活動(dòng)組（0～4 分）46 例，活動(dòng)組92 例，其中輕度組（＞4～8 分）29 例，中度組（＞8～12 分）37 例，重度組（＞12分）26例。

1.3.4 qRT-PCR 檢測(cè)血清miR-335 的水平 RNA提取試劑盒對(duì)血清RNA 進(jìn)行提取，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA），qRT-PCR檢測(cè)血清miR-335 水平，循環(huán)條件為：95 ℃60 s；95 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，引物序列：miR-335 正向引物5’-3’為AGCCGTCAAGAGCAATAACGAA，反向引物5’-3’為GTGCAGGGTCCGAGGT；U6 正向引物5’-3’為GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，反向引物5’-3’為CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。采 用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-335相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 ELISA 檢測(cè)血清CD36 水平 利用ELISA 試劑盒檢測(cè)所有受試者血清CD36 的水平，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用軟件SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料采用± s 描述，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)（下、上四分位數(shù)）［M（P25，P75）］描述，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)描述，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；Pearson 相關(guān)性分析檢驗(yàn)狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335與一般資料的相關(guān)性；受試者工作特征曲線（ROC 曲線）分析血清CD36、miR-335 對(duì)狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度的診斷價(jià)值，聯(lián)合診斷與CD36、miR-335 對(duì)狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度診斷價(jià)值的比較采用Z檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者血清CD36、miR-335 水平比較與對(duì)照組比較，狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組血清中CD36、miR-335水平比較/± s

表1 兩組血清中CD36、miR-335水平比較/± s

注：CD36為簇分化抗原36。

組別對(duì)照組狼瘡腎炎組t值P值例數(shù)120 138 CD36/（μg/L）67.49±8.64 147.25±11.43 62.48＜0.001 miR-335 1.00±0.00 1.58±0.23 27.62＜0.001

2.2 不同疾病活動(dòng)度狼瘡腎炎病人一般資料比較與非活動(dòng)組比較，活動(dòng)組狼瘡腎炎病人性別、年齡、BMI、白細(xì)胞、CRP、ESR 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；尿素氮、血肌酐、24 h尿蛋白、尿沉渣紅細(xì)胞、SLEDAI、活動(dòng)指數(shù)均顯著升高，補(bǔ)體C3、C4、白蛋白顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 不同疾病活動(dòng)度狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335 水平比較與非活動(dòng)組比較，活動(dòng)組狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335 水平均顯著升高，且隨著疾病活動(dòng)度的增加，血清CD36、miR-335 水平均逐漸升高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同疾病活動(dòng)度狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335的比較/± s

表3 不同疾病活動(dòng)度狼瘡腎炎病人血清CD36、miR-335的比較/± s

注：CD36為簇分化抗原36。①與非活動(dòng)組比較，P＜0.05。②與輕度組比較，P＜0.05。③與中度組比較，P＜0.05。

組別非活動(dòng)組輕度組中度組重度組F值P值例數(shù)46 29 37 26 CD36/（μg/L）128.49±3.65 135.42±2.98①146.71±3.19①②157.36±4.12①②③441.40＜0.001 miR-335 1.32±0.11 1.44±0.14①1.60±0.15①②1.72±0.18①②③53.02＜0.001

2.4 血清CD36、miR-335 水平與狼瘡腎炎病人一般資料的相關(guān)性Pearson 分析結(jié)果表明，血清CD36、miR-335 水平均與狼瘡腎炎病人白細(xì)胞、CRP、ESR、尿素氮無(wú)關(guān)（P＞0.05），與白蛋白、補(bǔ)體C3、C4呈負(fù)相關(guān)，與血肌酐、尿蛋白、尿沉渣紅細(xì)胞、SLEDAI、活動(dòng)指數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表2 不同疾病活動(dòng)度狼瘡腎炎病人一般資料比較

表4 血清CD36、miR-335水平與狼瘡腎炎病人一般資料的相關(guān)性

2.5 ROC 曲線分析血清CD36、miR-335 水平對(duì)狼瘡腎炎病人疾病活動(dòng)度的診斷價(jià)值結(jié)果顯示，血清CD36、miR-335 水平診斷狼瘡腎炎病人疾病活動(dòng)度的曲線下面積（AUC）分別為0.83［95%CI：（0.75，0.90）］、0.80［95%CI：（0.73，0.88）］，二者聯(lián)合診斷AUC 為0.94［95%CI：（0.90，0.98）］，聯(lián)合診斷對(duì)狼瘡腎炎病人疾病活動(dòng)度的診斷價(jià)值高于CD36、miR-335，見(jiàn)表5。

表5 血清CD36、miR-335水平對(duì)狼瘡腎炎病人活動(dòng)度的診斷價(jià)值

3 討論

SLE 是一種多系統(tǒng)損傷的慢性自身免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，與遺傳、環(huán)境、感染等多種因素有關(guān)［10］。狼瘡腎炎是SLE常見(jiàn)的器官損傷并發(fā)癥，50%～80%的SLE 病人會(huì)出現(xiàn)腎損傷，可在5 年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病，嚴(yán)重威脅病人健康［2］。疾病活動(dòng)度是影響狼瘡腎炎病人腎臟預(yù)后的重要因素，對(duì)狼瘡腎炎病人疾病活動(dòng)度的早期評(píng)價(jià)對(duì)改善病人預(yù)后至關(guān)重要。腎組織活檢是診斷狼瘡腎炎最有效的方法，可以判斷狼瘡腎炎病人病理類型及疾病活動(dòng)度，然而腎組織活檢屬于有創(chuàng)性檢測(cè)手段，不能重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)［11］。因此尋找有效的檢測(cè)狼瘡腎炎病人疾病活動(dòng)度的生物標(biāo)志物，有利于臨床上判斷狼瘡腎炎病人的疾病進(jìn)展，從而針對(duì)病人病情進(jìn)行有效治療，改善病人預(yù)后。

CD36是一種多功能受體，是細(xì)胞表面的一種單鏈跨膜糖蛋白，也是腎臟脂肪酸攝取系統(tǒng)的主要組成成分，在慢性腎臟疾病的發(fā)展中有重要的作用，有研究表明在患有急性或慢性損傷的腎臟中CD36水平顯著升高［12-13］。本研究結(jié)果表明狼瘡腎炎病人血清CD36 水平顯著高于對(duì)照組，且狼瘡腎炎活動(dòng)組病人血清CD36 水平顯著高于非活動(dòng)組，并隨著疾病活動(dòng)度的升高而升高，提示CD36 可能與狼瘡腎炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。補(bǔ)體是血清中具有酶活性的一種球蛋白，與先天性免疫有關(guān)，補(bǔ)體C3和C4水平的降低表明補(bǔ)體活化功能異常，被認(rèn)為是狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度增加的指標(biāo)［14］。Bonegio 等［15］研究表明沉積的免疫復(fù)合物能夠激活補(bǔ)體吸引中性粒細(xì)胞并增強(qiáng)其反應(yīng)，引起SLE腎臟受累。尿蛋白、尿沉渣水平與腎臟病變程度有關(guān)。本研究結(jié)果表明與非活動(dòng)組比較，活動(dòng)組狼瘡腎炎病人尿素氮、血肌酐、尿蛋白、尿沉渣紅細(xì)胞、SLEDAI、活動(dòng)指數(shù)均顯著升高，而補(bǔ)體C3、C4、白蛋白顯著降低。研究表明CD36 通過(guò)影響嗜中性粒細(xì)胞的功能和先天性免疫反應(yīng)，在狼瘡腎炎的發(fā)病和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［12］。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果表明，狼瘡腎炎病人血清CD36 水平與白蛋白、補(bǔ)體C3、C4 呈負(fù)相關(guān)，與血肌酐、尿蛋白、尿沉渣紅細(xì)胞、SLEDAI、活動(dòng)指數(shù)呈正相關(guān)，提示CD36 可能通過(guò)病人體內(nèi)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)參與狼瘡腎炎的發(fā)病。5A 肽是一種拮抗CD36 的新型肽，研究表明5A 肽可改善腎臟炎癥和腎小管間質(zhì)纖維化［16］。Yang 等［17］研究表明CD36的沉默通過(guò)抑制炎性應(yīng)激誘導(dǎo)的脂肪酸攝取和脂質(zhì)毒性抑制肥胖小鼠慢性腎臟病的發(fā)展。本研究ROC 曲線分析表明CD36 診斷狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度具有較高的靈敏度和特異度，提示CD36 可能是診斷狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度潛在的生物標(biāo)志物。

狼瘡腎炎病人存在著多種miRNA 的差異性表達(dá)［18］，miR-335 是一種與脂質(zhì)形成有關(guān)的miRNA，與脂肪酸代謝和脂肪形成有關(guān)，在多種免疫性疾病中存在差異表達(dá)。Ebrahimiyan 等［19］研究表明與健康對(duì)照組比較，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-335 水平顯著上調(diào)。Martini 等［20］研究表明原發(fā)性干燥綜合征miR-335-5p 表達(dá)顯著高于健康志愿者。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)狼瘡腎炎病人血清miR-335水平顯著高于對(duì)照組，與Perez-Hernandez 等［7］研究結(jié)果相似，miR-335 與狼瘡腎炎病人補(bǔ)體C3、C4、尿蛋白、尿沉渣、SLEDAI、活動(dòng)指數(shù)有關(guān)，提示miR-335 可能與狼瘡腎炎的發(fā)病有關(guān)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)狼瘡腎炎活動(dòng)組血清miR-335 水平顯著高于非活動(dòng)組，且隨著病人疾病活動(dòng)度的升高，血清miR-335水平顯著升高，進(jìn)一步ROC 曲線分析結(jié)果表明，miR-335 對(duì)狼瘡腎炎病人疾病活動(dòng)度有較高的診斷價(jià)值，提示miR-335 可能是狼瘡腎炎發(fā)生發(fā)展的潛在診斷標(biāo)志物。本研究利用血清miR-335 與CD36 水平對(duì)狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度進(jìn)行聯(lián)合診斷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合診斷狼瘡腎炎的靈敏度和特異度均高于二者分別診斷，提示血清miR-335 和CD36 聯(lián)合診斷可能是狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度診斷的潛在方法。

綜上所述，血清CD36、miR-335 在狼瘡腎炎病人血清中存在差異性表達(dá)，與病人疾病活動(dòng)度有關(guān)，對(duì)狼瘡腎炎疾病活動(dòng)度有一定的診斷價(jià)值。然而本研究?jī)H從臨床水平上探討了CD36、miR-335 在狼瘡腎炎病人血清中的表達(dá)差異，而CD36、miR-335在狼瘡腎炎發(fā)生發(fā)展中具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入探討。