李杰玉，林玉玲，李曾一，劉琳，金文波

糖尿病足潰瘍是糖尿病主要并發(fā)癥之一，神經(jīng)與血管病變、感染等可促進(jìn)糖尿病足潰瘍的發(fā)生，其中炎癥反應(yīng)與細(xì)菌感染是造成糖尿病足潰瘍病人截肢甚至死亡的重要原因［1-4］。但糖尿病足潰瘍細(xì)菌感染及其與血管病變的相關(guān)性尚未完全闡明。長鏈非編碼RNA（lncRNA）DLX6-AS1在糖尿病腎病中呈高表達(dá)，而微小RNA（miR）-346 表達(dá)下調(diào)，DLX6-AS1 可能靶向調(diào)控miR-346 表達(dá)從而參與糖尿病腎病發(fā)生及發(fā)展過程［5］。研究表明miR-346 在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞分化中發(fā)揮重要調(diào)控作用［6］。但DLX6-AS1、miR-346 在糖尿病足潰瘍中的表達(dá)水平尚未可知。本研究通過檢測糖尿病足潰瘍病人血清中DLX6-AS1、miR-346 的表達(dá)水平，分析其與炎性因子水平的相關(guān)性，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017 年5 月至2018 年12 月南陽市中心醫(yī)院收治的72 例糖尿病足病人為糖尿病足組，所有病人均符合糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。糖尿病足組病人年齡（65±6）歲，范圍為50～70歲；病程（13.25±7.65）年；男40 例，女32 例。根據(jù)Wagner 分級標(biāo)準(zhǔn)［8］將糖尿病足病人分為1 級14 例、2 級14 例、3 級14 例、4 級16 例、5 級14 例。選取同期該院收治的60 例2 型糖尿病病人為糖尿病組，所有病人均符合2 型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］，且未達(dá)到糖尿病足的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男35 例，女25 例；年齡（66±6）歲，范圍為52～71歲；病程（14.13±6.12）年。選取同期于該院進(jìn)行健康體檢的健康志愿者55例作為對照組，其中男28 例，女27 例；年齡（67±7）歲，范圍為51～76 歲。各組研究對象年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病足病人為第1 次發(fā)生足部潰瘍；糖尿病組與對照組受檢者均無足部潰瘍；無心功能障礙者；無肝、腎功能不全者。排除標(biāo)準(zhǔn)：外周血管病變病人；合并其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病者；合并惡性腫瘤病人。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有病人知情且簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 采集血液樣本 所有研究對象均于入組次日清晨抽取空腹靜脈血5 mL，4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min 離心6 min，吸取血清，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存待測。

1.2.2 實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測細(xì)胞中DLX6-AS1、miR-346 的表達(dá)水平 取凍存血清樣本，采用Trizol 法提取血清中總RNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共循環(huán)40 次。DLX6-AS1 以GAPDH 為內(nèi)參，miR-346 以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算DLX6-AS1、miR-346 相對表達(dá)量。Trizol、逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測炎性因子水平 采用ELISA檢測血清炎性因子血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、成纖維細(xì)胞生長因子2（FGF2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，Multiskan MK3 酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher公司。采用電化學(xué)發(fā)光法檢測血清中白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平，Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及檢測試劑盒購自美國Roche 公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 觀察指標(biāo) 檢測所有研究對象收縮壓、舒張壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白（HbA1c），檢測儀器購自美國Bio-Rad公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以± s表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)變量間的相關(guān)性；采用logistic 回歸分析研究影響糖尿病足發(fā)生的相關(guān)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象一般資料比較三組受檢者收縮壓、舒張壓、HbA1c比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），糖尿病組、糖尿病足組病人空腹血糖、VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平高于對照組（P＜0.05），糖尿病組與糖尿病足組VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 健康者55例與糖尿病132例一般資料比較/± s

注：HbA1c為糖化血紅蛋白，VCAM-1為血管細(xì)胞黏附分子-1，F(xiàn)GF2為成纖維細(xì)胞生長因子2，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，IL-6為白細(xì)胞介素-6。①與對照組相比，P＜0.05。②與糖尿病組相比，P＜0.05。

臨床指標(biāo)收縮壓/mm Hg舒張壓/mm Hg HbA1c/%空腹血糖/（mmol/L）VCAM-1/（μg/L）FGF2/（ng/L）TNF-α/（ng/L）IL-6/（ng/L）對照組（n=55）124.35±10.32 79.51±14.65 5.23±0.36 4.85±0.96 136.58±56.32 8.56±1.36 6.57±1.35 3.25±1.03糖尿病組（n=60）126.57±16.57 80.13±15.24 5.42±1.58 8.21±2.54①653.24±175.45①12.65±3.71①16.15±4.16①4.59±1.13①糖尿病足組（n=72）127.59±18.46 81.11±12.57 5.44±1.23 8.42±2.56①865.42±132.26①②17.68±5.13①②21.74±6.52①②15.68±3.21①②F值0.66 0.21 0.56 48.29 484.29 87.39 160.42 654.14 P值0.516 0.811 0.575＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 各組研究對象血清中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1 與miR-346 的表達(dá)比較與對照組相比，糖尿病組與糖尿病足組病人血清中DLX6-AS1 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-346 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），糖尿病組與糖尿病足組血清中DLX6-AS1、miR-346 的表達(dá)水平相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 健康者55例與糖尿病132例血清中DLX6-AS1與miR-346的表達(dá)比較/± s

表2 健康者55例與糖尿病132例血清中DLX6-AS1與miR-346的表達(dá)比較/± s

注：①與對照組相比，P＜0.05。②與糖尿病組相比，P＜0.05。

組別對照組糖尿病組糖尿病足組F值P值例數(shù)55 60 72 DLX6-AS1 1.01±0.13 2.16±0.25①3.20±1.03①②172.54＜0.001 miR-346 1.00±0.16 0.73±0.11①0.41±0.08①②397.60＜0.001

2.3 DLX6-AS1 與miR-346 在不同Wagner 分級糖尿病足組病人血清中的表達(dá)比較與Wagner分級1級糖尿病足病人相比，2～5級病人血清DLX6-AS1的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-346 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

2.4 糖尿病足組病人血清中DLX6-AS1、miR-346的表達(dá)與炎性因子水平的相關(guān)性分析Pearson 相關(guān)性分析顯示糖尿病足病人血清中DLX6-AS1 的表達(dá) 與VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 呈 正 相 關(guān)（P＜0.05），miR-346 與FGF2、TNF-α、IL-6 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表3 DLX6-AS1與miR-346在不同Wagner分級糖尿病足72例血清中的表達(dá)比較/± s

表3 DLX6-AS1與miR-346在不同Wagner分級糖尿病足72例血清中的表達(dá)比較/± s

注：①與1級相比，P＜0.05。

Wagner分級1級2級3級4級5級F值P值例數(shù)14 14 14 16 14 DLX6-AS1 1.23±0.18 2.11±0.15 2.58±0.16 3.01±0.16 3.31±0.37①198.54＜0.001 miR-346 0.98±0.13 0.65±0.10 0.63±0.11 0.53±0.13 0.35±0.09①57.59＜0.001

表4 糖尿病足72例血清中DLX6-AS1、miR-346的表達(dá)與炎性因子水平的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果

2.5 影響糖尿病足發(fā)生的多因素分析采用logistic 回歸分析對影響糖尿病足發(fā)生的相關(guān)因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示血清中DLX6-AS1 表達(dá)量升高與miR-346 表達(dá)量是影響糖尿病足發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見表5。

表5 影響糖尿病足發(fā)生的多因素logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

lncRNA 可通過調(diào)控下游miRNA 表達(dá)從而參與多種炎性反應(yīng)疾病發(fā)生過程，研究表明lncRNA 在糖尿病足病人中異常表達(dá)并可能參與該疾病發(fā)生及發(fā)展過程［10-11］。但lncRNA 在糖尿病足發(fā)生過程中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明，因而本研究積極尋找新型lncRNA，初步分析其在糖尿病足病人中的表達(dá)，為深入了解糖尿病足的病理生理機(jī)制提供新方向。

DLX6-AS1 在大腸癌、膀胱癌、宮頸癌等腫瘤中呈高表達(dá)并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲［12-14］。但DLX6-AS1 在糖尿病足中的表達(dá)尚未可知。本研究結(jié)果顯示糖尿病足病人血清中DLX6-AS1 的表達(dá)水平顯著升高，隨著Wagner 分級的增加DLX6-AS1的表達(dá)水平明顯升高，提示DLX6-AS1 表達(dá)量升高可能促進(jìn)糖尿病足發(fā)生及發(fā)展。研究表明炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 在糖尿病足病人中的水平升高，并可促進(jìn)其發(fā)展進(jìn)程［15-16］。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示糖尿病足病人血清中炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平明顯高于糖尿病組病人，提示炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 水平升高可加重糖尿病足的嚴(yán)重程度。本研究進(jìn)一步分析顯示DLX6-AS1 表達(dá)量與炎性因子VCAM-1、FGF2、TNF-α、IL-6 呈正相關(guān)，說明隨著DLX6-AS1 表達(dá)量的升高可明顯促進(jìn)糖尿病足病人體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。提示DLX6-AS1 可能在糖尿病足發(fā)生過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。

miR-346 在膿毒癥病人中表達(dá)下調(diào)，并可參與膿毒癥發(fā)生及發(fā)展過程［17-18］。有研究表明miR-346還可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)［19］。本研究結(jié)果顯示miR-346 在糖尿病足病人血清中的表達(dá)下調(diào)，隨著Wagner 分級的增加miR-346 的表達(dá)量明顯降低，其低表達(dá)量與炎性因子FGF2、TNF-α、IL-6 呈負(fù)相關(guān)，提示miR-346 表達(dá)量降低可能促進(jìn)糖尿病足的發(fā)生及發(fā)展。同時本研究采用logistic 回歸分析對影響糖尿病足發(fā)生的相關(guān)因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示血清中DLX6-AS1 與miR-346 表達(dá)量是影響糖尿病足發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示血清中DLX6-AS1 表達(dá)水平升高與miR-346表達(dá)水平降低可增加糖尿病足的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，糖尿病足病人血清中DLX6-AS1 表達(dá)升高，miR-346 表達(dá)降低，二者表達(dá)量變化與糖尿病足進(jìn)展密切相關(guān)，還與糖尿病足炎癥反應(yīng)程度有關(guān)，可能作為臨床診斷糖尿病足的有效標(biāo)志物，還可為揭示糖尿病足發(fā)病機(jī)制提供新思路。但本研究樣本量較小，后續(xù)還須擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)。