王磊，鄭廣濤

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，因其早期病癥隱匿，部分病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已出現(xiàn)肝臟轉(zhuǎn)移，化療是其重要治療方法。然而，化療具有一定局限性，而分子靶向藥物治療可以能夠特異性阻止結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并不損傷正常細(xì)胞，可延長(zhǎng)結(jié)腸癌病人的生存期，提高病人的生命質(zhì)量［1］。微小RNA（miRNA，miR）是由20 個(gè)左右核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈RNA小分子，許多研究表明多種miRNA的異常表達(dá)與結(jié)腸癌的進(jìn)展關(guān)系密切［2］。有研究報(bào)道m(xù)iR-152-3p 能抑制人胃癌SGC-7901 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］；上調(diào)miR-152 可逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞EMT，從而降低膀胱癌生長(zhǎng)、侵襲和遷移的風(fēng)險(xiǎn)［4］。miR-152在結(jié)直腸癌組織中的低表達(dá)，與結(jié)直腸癌病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期有關(guān)［5］。轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2（metastasis-associated gene2，MTA2）是MTA 家族重要成員之一，研究發(fā)現(xiàn)MTA2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)較高，與腫瘤的臨床分期、分化程度等密切相關(guān)［6］。過表達(dá)MTA1 通過促進(jìn)MTA2 降解在體外抑制乳腺癌ZR-75-30 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［7］。但miR-152-3p 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及其作用機(jī)制是否與MTA1 相關(guān)尚未可知，本研究于2019 年2 月至2020年4月通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)揭示miR-152-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制是否與MTA1有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、HCT116、SW480和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；熒光定量試劑、Trizol 試劑盒，美國(guó)Alpco 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基，美國(guó)Gibico 公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒，美國(guó)Sigma 公司；放射免疫沉淀法（RIPA）蛋白裂解液，南京凱基生物公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，碧云天。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 以含胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、LoVo、SW480和人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW480 細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染分為miR-152-3p 模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）組、miR-152-3p 模擬物（miR-152-3p）組、抑制物（anti-miR-NC）組、miR-152-3p 抑制物（anti-miR-152-3p）組、陰性對(duì)照（si-NC）組、沉默轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2（si-MTA2）組、miR-152-3p 模 擬 物+ 空 載 體（miR-152-3p+pcDNA3.1）組、miR-152-3p 模擬物+過表達(dá)MTA2（miR-152-3p+pcDNA3.1-MTA2）組，另取未轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞記為Control組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)miR-152-3p 和MTA2 mRNA 表達(dá)水平提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），定量，相對(duì)表達(dá)量以β肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定蛋白的表達(dá) 提取總蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，脫脂奶粉室溫封閉膜1 h，將膜至于稀釋的一抗溶液中4 ℃孵育過夜，再用稀釋的二抗室溫孵育膜2 h。顯影定影，對(duì)蛋白條帶進(jìn)行吸光度分析，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

圖3 過表達(dá)miR-152-3p和沉默轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2（MTA2）對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移和侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200）

1.2.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組細(xì)胞均培養(yǎng)48 h，參照試劑盒指南，用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處吸光度。

1.2.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 遷移：Transwell上室加200 μL 懸液，下室加培養(yǎng)液，溫育24 h，甲醛、結(jié)晶紫固定染色后，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)。侵襲：Matrigel包被Transwell上室，其余步驟同遷移。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建MTA2 的3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）野生型和突變型熒光素酶載體（MTA2-WT 和MTA2-MUT），將其分別與miR-NC及miR-152-3p 共轉(zhuǎn)染至SW480 細(xì)胞中；依報(bào)告指南測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.00 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以± s表示，兩組間比較行兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步多組間的兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-152-3p 在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，MTA2表達(dá)上調(diào)與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460 相比，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116、LoVo、SW480 中MTA2 mRNA 和蛋白較高，miR-152-3p 較低（P＜0.05），選擇MTA2 和miR-152-3p 表達(dá)較NCM460 細(xì)胞差異最明顯的結(jié)腸癌SW480進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1，表1。

圖1 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460與結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、HCT116、SW480中MTA2蛋白表達(dá)

表1 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460與結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、HCT116、SW480中miR-152-3p和MTA2表達(dá)水平比較/± s

表1 人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460與結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo、HCT116、SW480中miR-152-3p和MTA2表達(dá)水平比較/± s

注：MTA2為轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2。①相比NCM460 細(xì)胞，P＜0.05。②相比HCT116 細(xì)胞，P＜0.05。③相比SW480細(xì)胞，P＜0.05。

?

2.2 過表達(dá)miR-152-3p和沉默MTA2對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染miR-152-3p mimics 的SW480細(xì)胞中miR-152-3p 表達(dá)水平顯著高于轉(zhuǎn)染miR-NC的細(xì)胞（3.53±0.12 比1.03±0.05，t=33.31，P＜0.05），轉(zhuǎn)染si-MTA2 的SW480 細(xì)胞中MTA2 蛋白表達(dá)顯著低于 轉(zhuǎn) 染si-NC 的 細(xì) 胞（0.33±0.03 比0.99±0.08，t=13.39，P＜0.05），說 明 過 表 達(dá)miR-152-3p 或 沉 默MTA2的SW480細(xì)胞構(gòu)建成功。

與miR-NC 組 相 比，miR-152-3p 組SW480 細(xì) 胞中細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、SW480 細(xì)胞活性較低，周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）較高（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-MTA2組SW480細(xì)胞中cyclin D1表達(dá)較低，P21表達(dá)較高，SW480細(xì)胞活性較低（P＜0.05）。見圖2，表2。

2.3 過表達(dá)miR-152-3p和沉默MTA2對(duì)SW480細(xì)胞遷移和侵襲的影響與miR-NC組相比，miR-152-3p 組SW480 細(xì)胞中上皮鈣黏素（E-cadherin）較高，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2 較低，SW480 細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量較低（P＜0.05）；與si-NC 組相比，si-MTA2組SW480 細(xì)胞中MMP-2 表達(dá)較低，E-cadherin 表達(dá)較高，SW480 細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。見圖3，4；表3。

表2 過表達(dá)miR-152-3p或沉默MTA2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響/± s

表2 過表達(dá)miR-152-3p或沉默MTA2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖的影響/± s

注：MTA2 為轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2，cyclin D1 為細(xì)胞周期蛋白D1，P21為周期素依賴激酶抑制劑p21。①相比Control 組，P＜0.05。②相比miR-NC 組，P＜0.05。③相比si-NC組，P＜0.05。

組別Control miR-NC miR-152-3p si-NC si-MTA2 F值P值重復(fù)次數(shù)33 3 3 3吸光度0.92±0.22 0.96±0.17 0.31±0.07①②0.99±0.17 0.32±0.09①③15.62＜0.001 cyclin D1蛋白0.85±0.07 0.87±0.09 0.36±0.03①②0.91±0.12 0.26±0.083①③42.39＜0.001 P21蛋白0.34±0.03 0.36±0.04 0.65±0.09①②0.25±0.04 0.89±0.18①③23.73＜0.001

圖4 過表達(dá)miR-152-3p和沉默MTA2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中MMP-2和E-cadherin蛋白表達(dá)表達(dá)的影響

2.4 miR-152-3p靶向調(diào)控MTA2表達(dá)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示MTA2 與miR-152-3p 存在結(jié)合位點(diǎn)；miR-152-3p 與MTA2-WT 共轉(zhuǎn)染的SW480 細(xì)胞熒光素酶活性降低（0.43±0.03 比1.10±0.15，t=7.59，P=0.002）；而miR-152-3p 與MTA2-MUT 共 轉(zhuǎn) 染 的SW480 細(xì)胞的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.92±0.09 比1.13±0.14，t=2.19，P=0.094）。過表達(dá)miR-152-3p，MTA2 表達(dá)水平顯著降低；抑制miR-152-3p 表達(dá)，MTA2 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見表4。

表4 miR-152-3p對(duì)MTA2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響/± s

表4 miR-152-3p對(duì)MTA2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響/± s

組別miR-NC miR-152-3p anti-miR-NC anti-miR-152-3p F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 MTA2 mRNA 0.99±0.03 0.23±0.02①0.98±0.02 3.61±0.10②2 251.79＜0.001 MTA2蛋白0.92±0.09 0.40±0.02①0.92±0.11 1.78±0.18②74.05＜0.001

注：MTA2為轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2。
①相比miR-NC組，P＜0.05。②相比anti-miR-NC組，P＜0.05。

2.5 過表達(dá)MTA2 逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-152-3p 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用相比miR-152-3p+pcDNA3.1 組，miR-152-3p+pcDNA3.1-MTA2組SW480 細(xì)胞中P21、E-cadherin 的表達(dá)較低，MTA2、cyclin D1、MMP-2蛋白的表達(dá)較高，SW480細(xì)胞活性、遷移、侵襲數(shù)量較高（P＜0.05），見表5。

3 討論

結(jié)腸癌發(fā)病率和病死率均較高，對(duì)人類健康危害極大，分子靶向治療是一種新的方法，已取得一些成果，但仍有待深入研究［8-9］。miR-152 在多種腫瘤中可作為一種腫瘤抑制因子，如miR-152-3p 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miR-152-3p 顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制侵襲活性［10］。miR-152-3p 還能抑制前列腺癌細(xì)胞活力和侵襲潛力［11］；上調(diào)miR-152-3p表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞凋亡［12］。本研究顯示，miR-152-3p 在結(jié)腸癌細(xì)胞低表達(dá)，miR-152-3p 過表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞增殖遷移及侵襲起抑制作用。

MTA2 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，在腫瘤中多作為致癌基因，可作為診斷和治療腫瘤的靶點(diǎn)。下調(diào)MTA2 的表達(dá)抑制了胃癌的侵襲及轉(zhuǎn)移［13］；穩(wěn)定干擾MTA2有效抑制了乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移［14］。MTA2 在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，與腫瘤的分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示MTA2 與結(jié)腸癌惡性程度有關(guān)，對(duì)結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用，參與結(jié)腸癌的發(fā)展過程［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣表明，MTA2 在結(jié)腸癌細(xì)胞高表達(dá)，沉默MTA2 能抑制SW480 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。且miR-152-3p 靶向調(diào)控MTA2，過表達(dá)MTA2 逆轉(zhuǎn)了miR-152-3p 對(duì)SW480細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用。

E-cadherin 是上皮屏障和侵襲抑制因子，其下調(diào)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞去分化和高度浸潤(rùn)從而有利于腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移；MMP 是一種蛋白水解酶，MMP-2 是其家族的一員，與結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)［16-17］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-152-3p 和沉默MTA2 對(duì)MMP-2 表達(dá)起抑制作用，對(duì)E-cadherin 表達(dá)起促進(jìn)作用，提示其可抑制結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移。cyclin D1 是細(xì)胞周期正調(diào)控因子，高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，P21 是細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，促進(jìn)p21表達(dá)，進(jìn)而抑制cyclin D1 表達(dá)，可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖［18-19］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-152-3p 和沉默MTA2 抑制了cyclin D1 的表達(dá)，促進(jìn)了P21 的表達(dá)，表明其可抑制結(jié)腸癌的惡性增殖。

綜上，miR-152-3p 能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與MTA2有關(guān)。

表3 過表達(dá)miR-152-3p和沉默MTA2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲及MMP-2和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響/± s

表3 過表達(dá)miR-152-3p和沉默MTA2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480遷移、侵襲及MMP-2和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響/± s

注：MTA2為轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，E-cadherin為上皮鈣黏素。①相比Control組，P＜0.05。②相比miR-NC組，P＜0.05。③相比si-NC組，P＜0.05。

組別Control miR-NC miR-152-3p si-NC si-MTA2 F值P值重復(fù)次數(shù)33333細(xì)胞遷移數(shù)/個(gè)172.00±23.52 169.00±20.66 53.67±12.22①②155.67±16.8 54.33±8.74①③38.02＜0.001細(xì)胞侵襲數(shù)/個(gè)124.67±10.02 122.33±9.45 26.00±5.00①②108.33±10.02 42.00±4.00①③100.13＜0.001 MMP-2蛋白0.92±0.09 0.96±0.10 0.47±0.04①②0.98±0.18 0.31±0.03①③27.98＜0.001 E-cadherin蛋白0.43±0.03 0.48±0.03 1.09±0.16①②0.32±0.06 1.30±0.14①③57.43＜0.001

表5 過表達(dá)MTA2逆轉(zhuǎn)miR-152-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖、遷移和侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/± s

表5 過表達(dá)MTA2逆轉(zhuǎn)miR-152-3p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480增殖、遷移和侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/± s

注：MTA2為轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2，cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白D1，P21為周期素依賴激酶抑制劑p21，MMP-2為基質(zhì)金屬蛋白酶-2，E-cadherin 為上皮鈣黏素。

組別miR-152-3p+pcDNA3.1 miR-152-3p+pcDNA3.1-MTA2 t值P值重復(fù)次數(shù)33吸光度0.35±0.07 0.69±0.15 3.56 0.024細(xì)胞遷移數(shù)/個(gè)56.67±7.09 139.33±19.04 7.05 0.002細(xì)胞侵襲數(shù)/個(gè)40.00±5.29 117.67±10.6 11.36＜0.001 MTA2蛋白0.43±0.06 0.99±0.14 6.37＜0.001 cyclin D1蛋白0.42±0.06 1.35±0.07 17.47＜0.001 P21蛋白1.13±0.11 0.46±0.06 9.26 0.001 MMP-2蛋白0.64±0.04 1.9±0.24 8.97 0.001 E-cadherin蛋白1.86±0.13 0.65±0.04 15.41＜0.001

（本文圖3見插圖9-4）