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        乳腺癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)與人乳頭狀瘤病毒16/18感染的關(guān)系及其臨床病理意義

        2022-08-31 02:04:32梅娟馬新義張金蓮張正
        安徽醫(yī)藥 2022年9期
        關(guān)鍵詞:乳腺癌研究

        梅娟,馬新義,張金蓮,張正

        乳腺癌是一種臨床常見惡性腫瘤,其發(fā)病率逐年增加,但其病因尚未完全闡明。既往研究認(rèn)為家族病史、生活方式等均為該病致病因素[1]。早期診斷乳腺癌對提高病人治療及改善病人預(yù)后均有重要意義[2]。進(jìn)一步探討影響乳腺癌可能發(fā)生的內(nèi)在機(jī)制及尋找分子標(biāo)志物對提高臨床早期診療效果具有重要應(yīng)用價值。乳腺癌屬血管依賴性病變,多種因素參與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲過程。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)可降解細(xì)胞外基質(zhì)及基膜進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移或侵襲。MMP-2、MMP-9 與腫瘤細(xì)胞浸潤、遷移及侵襲的作用關(guān)系密切。MMP-9在乳腺癌組織中呈高表達(dá),并可參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展,可作為評估乳腺癌疾病進(jìn)展的重要生物學(xué)標(biāo)志物[3-4]。近年來研究顯示,感染人乳頭狀瘤病毒(HPV)16/18 型可在E7 蛋白的黏膜和表皮膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá),并增強(qiáng)MMP 表達(dá)及活性,HPV16/18 型感染還與乳腺癌等其他臟器上皮腫瘤密切相關(guān)[5]。但是,乳腺癌病人中MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18感染的相關(guān)性研究相對較少。本研究擬通過檢測乳腺癌病人癌組織中MMP-2、MMP-9 表達(dá)及HPV16/18 感染情況,初步分析MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18 感染的關(guān)系,為臨床治療及預(yù)防乳腺癌病人HPV16/18 感染提供理論依據(jù)?,F(xiàn)報告如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料回顧性選取2015 年3 月至2018 年5月蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的90例乳腺癌病人為研究對象,乳腺癌病人行外科手術(shù)切除的標(biāo)本為乳腺癌組,所有病人均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。收集90 例乳腺癌病人臨床病理資料,包括腫瘤長徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、臨床分期、絕經(jīng)狀態(tài)、雌激素受體(ER)表達(dá)情況等。乳腺癌組病人年齡(52.16±5.24)歲,范圍為45~70歲。同時選取同期該院85 例因良性疾病切除病變周圍正常乳腺組織為對照組,病人年齡(51.57±4.65)歲,范圍為43~72歲。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):乳腺癌活組織檢查前均未進(jìn)行放療或化療;生存時間超過6 個月。排除標(biāo)準(zhǔn):合并其他惡性腫瘤者;患有自身免疫性疾病者;臨床資料不全者。病人或其近親屬知情同意,本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

        圖1 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2與MMP-9在乳腺正常組織和乳腺癌組織中的表達(dá)情況(免疫組織化學(xué)染色×400)

        1.2 方法

        1.2.1 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)檢測乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平 取出凍存乳腺癌及正常乳腺組織樣本,按照Trizol 試劑盒(日本TaKaRa 公司)說明書操作提取組織總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。根據(jù)SYBR Green RCR master mix 試劑(北京優(yōu)尼康生物科技有限公司)加樣。反應(yīng)體系(20 μL):SYBR Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL,cDNA 樣本2.0 μL,正反向引物各0.8 μL,ddH2O 6.4 μL。熒光定量PCR 儀(西安天隆科技有限公司)程序:95 ℃1 min;95 ℃30 s、60 ℃30 s,40 個循環(huán)。MMP-2、MMP-9 均以β 肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因。β-actin 5’-3’正向引物GTCGGTGAATGAAGTGCTTA,反向引物GCTTCGGGTAAGTTTGCCGG;MMP-2 5’-3’正向引物 ATTTTCCCCTCGACAGCCTC, 反 向 引 物GTCCCAGGCGTAGACCAATA;MMP-9 5’-3’正向引物AATATCAGACATTCGGGAGG,反向引物GTCAATGTACAGCTGCCCCA。采用2-ΔΔCt法計算MMP-2、MMP-9 mRNA的相對表達(dá)量。

        1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá) 乳腺癌及正常乳腺組織采用石蠟包埋制作石蠟切片(厚4 μm),脫蠟后置于甲醇溶液(含3%過氧化氫溶液)中,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗,放入乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液內(nèi)(pH 8.00,95 ℃,10 min),室溫冷卻20 min,兔血清室溫封閉切片,15 min 后去除多余液體,分別將一抗MMP-2(山羊抗人)、MMP-9(山羊抗人)均1∶200 分別滴加入切片,置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜,次日用PBS 沖洗,滴加二抗(兔抗山羊),室溫孵育20 min,PBS 沖洗,滴加DAB 進(jìn)行顯色反應(yīng),蘇木精復(fù)染,梯度乙醇、二甲苯脫水透明,中性樹脂封片,置于顯微鏡下觀察。結(jié)果判定[6]:隨機(jī)選取400倍鏡下5個視野觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)目,(1)根據(jù)陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞總數(shù)百分比分為<5%(1 分)、5%~25%(2 分)、>25%~50%(3 分)、>50%~75%(4 分)、>75%(5 分);(2)根據(jù)陽性細(xì)胞染色程度積分為:淡棕黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)。由該院病理醫(yī)師閱片并將兩項積分乘積>2分者判斷為陽性表達(dá),≤2分者判斷為陰性表達(dá)。

        1.2.3 HPV16/18 感染檢測 采用原位雜交法對HPV16/18 DNA 檢測,試劑盒購自福建邁新公司,操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。取乳腺癌組織與正常乳腺組織標(biāo)本,常規(guī)石蠟包埋、切片,并進(jìn)行脫蠟水化、干燥處理,加入胃酶工作液37 ℃消化30 min,乙醇脫水、空氣干燥。滴加25 μL HPV16/18 型DNA 探針,95 ℃原位雜交加熱器上變性8 min,37 ℃濕盒孵育過夜,TBS 緩沖液清洗,每張切片中滴加50 μL 抗地高辛抗體,37 ℃濕盒孵育30 min 后加入二抗,DAB 顯色,蘇木精復(fù)染。同時采用已知的HPV16/18DNA 陽性切片為陽性對照,以TBS 液替代探針作陰性對照[7]。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用軟件SPSS 22.0 分析。計量資料符合正態(tài)分布,以± s 表示,兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗;計數(shù)資料用例(%)表示,采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)水平比較乳腺癌組病人MMP-2 mRNA(1.58±0.13)、MMP-9 mRNA(2.14±0.11)表達(dá)水平均顯著高于對照 組(1.00±0.05、1.02±0.07)(t=38.53、79.83,均P<0.001)。

        2.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示MMP-2與MMP-9陽性信號位于細(xì)胞質(zhì)中,染色呈淺黃色、棕黃色、棕褐色,見圖1。乳腺癌組MMP-2 與MMP-9 蛋白陽性表達(dá)率顯著高于對照組(P<0.05),見表1。

        表1 免疫組織化學(xué)染色檢測兩組基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2與MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果/例(%)

        2.3 HPV16/18-DNA 檢測結(jié)果乳腺癌組HPV16/18-DNA 陽性率71.11%(64/90)顯著高于對照組12.94%(11/85)(χ2=60.40,P<0.001)。

        2.4 HPV16/18 感染、MMP-2、MMP-9 表達(dá)與乳腺癌病人臨床病理特征的關(guān)系觀察MMP-2、MMP-9表達(dá)及HPV16/18 感染與否與乳腺癌病人臨床病理特征的關(guān)系,結(jié)果顯示MMP-2、MMP-9 表達(dá)及HPV16/18 感染與否均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、絕經(jīng)狀態(tài)、ER 陽性明顯相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

        2.5 乳腺癌MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18 感染的關(guān)系62 例MMP-2 陽性表達(dá)病人同時HPV16/18-DNA 呈 陽 性,61 例MMP-9 陽 性 表 達(dá) 病 人 同 時HPV16/18-DNA 呈 陽 性,MMP-2、MMP-9 表 達(dá) 與HPV16/18 感染存在明顯相關(guān)性(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義見表3。

        3 討論

        癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲是導(dǎo)致乳腺癌病人死亡的重要原因。研究顯示,腫瘤細(xì)胞移向血管壁并附著于血管壁或貼壁血栓,進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞增殖及浸潤[8]。

        HPV是一組雙鏈DNA病毒,乳腺癌組織中HPV高表達(dá),HPV 可參與乳腺癌發(fā)生過程[9]。HPV E6和E7癌蛋白具有鋅指結(jié)構(gòu)域,二者在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中持續(xù)表達(dá),對細(xì)胞轉(zhuǎn)化和維持轉(zhuǎn)化組織惡性表達(dá)起重要作用。有研究顯示,HPV 致癌機(jī)制一般認(rèn)為與HPV DNA 整合有關(guān),HPV E6 蛋白可通過E6 相關(guān)蛋白與P53 結(jié)合,達(dá)到抑制P53 蛋白與DNA 特異性位點結(jié)合,同時,也可導(dǎo)致已結(jié)合的P53 蛋白從DNA 上解除,并促使P53蛋白經(jīng)過泛素介導(dǎo)途徑而降解,最終造成細(xì)胞增殖失控及細(xì)胞凋亡機(jī)制缺陷,導(dǎo)致細(xì)胞永生化現(xiàn)象[10]。本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組HPV16/18-DNA 陽性率顯著高于對照組,提示HPV16/18-DNA 陽性組乳腺癌發(fā)生率升高,乳腺癌發(fā)生可能與HPV感染相關(guān)。

        表3 乳腺癌90例MMP-2、MMP-9表達(dá)與HPV16/18感染的關(guān)系/例

        表2 HPV16/18感染、MMP-2、MMP-9表達(dá)與乳腺癌90例臨床病理特征的關(guān)系/例(%)

        MMP-2 是一種Ⅳ型膠原酶并可降解基底膜骨架成分,進(jìn)而參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲過程。研究顯示乳腺癌腫瘤細(xì)胞中MMP-2 呈高表達(dá)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期密切相關(guān)[11]。MMP-9 是促進(jìn)細(xì)胞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要酶,可參與乳腺癌發(fā)生及發(fā)展過程,并可作為判斷乳腺癌浸潤及轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)指標(biāo);同時,MMP-9 還可通過上調(diào)血管生成因子表達(dá)水平,進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移[12]。研究表明,Ⅲ~Ⅳ期乳腺癌病人中MMP-2、MMP-9 呈高表達(dá),并與血管內(nèi)皮生長因子D 呈明顯正相關(guān),臨床上可通過抑制MMP-2、MMP-9 表達(dá)進(jìn)而治療乳腺癌,即MMP-2 與MMP-9 可能作為臨床治療乳腺癌的靶標(biāo)基因[13]。MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平與乳腺癌病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),并可通過促進(jìn)淋巴管生成進(jìn)而促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[14]。與上述報道相似,本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組MMP-2、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平顯著高于對照組,免疫組織化學(xué)顯示乳腺癌組MMP-2與MMP-9蛋白陽性表達(dá)率顯著高于正常組,提示MMP-2、MMP-9 可能與乳腺癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。另外本研究結(jié)果還顯示,MMP-2、MMP-9 表達(dá)均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、絕經(jīng)狀態(tài)、ER陽性明顯相關(guān),隨著病人淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移及臨床分期的增加,MMP-2、MMP-9 陽性表達(dá)均明顯高于陰性表達(dá),提示MMP-2、MMP-9高表達(dá)可能參與乳腺癌發(fā)展過程。

        有報道顯示,子宮頸癌組織中HPV 感染與MMP-7、MMP-9 表達(dá)密切相關(guān),并與病人淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)相關(guān)[15]。另外,郭真真等[16]研究顯示,MCF-7-E6 細(xì)胞和MCF-7-E7 細(xì)胞中MMP-9 蛋白表達(dá)水平明顯高于MCF-7 親本細(xì)胞與MCF-7-Vect 細(xì)胞,認(rèn)為MMP-9 是降解Ⅳ型膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的主要酶系。在乳腺癌中,HPV16 E6 和E7 可能通過促進(jìn)MMP-9 的表達(dá)參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究比較乳腺癌MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18感染的關(guān)系,結(jié)果顯示MMP-2、MMP-9與HPV16/18-DNA 呈顯著相關(guān)性,說明MMP-2、MMP-9 表達(dá)與HPV16/18 感染存在明顯相關(guān)性。提示MMP-2、MMP-9 表達(dá)及HPV16/18 陽性可增加乳腺癌發(fā)生發(fā)展概率。關(guān)于MMP-2、MMP-9 與HPV16/18 陽性的內(nèi)在分子關(guān)系目前尚不完全明確,有待進(jìn)一步深入研究。

        本研究表明,乳腺癌組織中MMP-2、MMP-9 呈高表達(dá),其表達(dá)與HPV16/18正相關(guān),推測HPV16/18影響癌組織中MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平,促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,加重疾病進(jìn)程。但本研究尚未排除乳腺癌病人機(jī)會性感染HPV16/18 情況,還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量繼續(xù)研究HPV16/18 感染、MMP-2、MMP-9 表達(dá)與乳腺癌的關(guān)系,以期揭示病毒對腫瘤發(fā)生及發(fā)展的影響。

        (本文圖1見插圖9-3)

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