鄭瑞利，馮迎軍，楊慧敏，王芳潔，何坤

病毒性心肌炎（VMC）是一種常見病毒感染相關(guān)性心肌疾病，其中以柯薩奇病毒B較多見，可發(fā)生于各年齡階段，但多見于學(xué)齡前及學(xué)齡期兒童［1］。病兒臨床表現(xiàn)不一，多數(shù)經(jīng)適當(dāng)治療后可痊愈，少數(shù)病兒病情進(jìn)展，可導(dǎo)致心律失常、心力衰竭甚至猝死，嚴(yán)重影響病兒身心健康并給其家庭帶來嚴(yán)重傷害［2］。目前尚缺乏特異、敏感單一快速診斷指標(biāo)，臨床確診VMC 金標(biāo)準(zhǔn)仍為心內(nèi)膜活檢，因其有創(chuàng)性，活檢難度及風(fēng)險(xiǎn)較大，臨床應(yīng)用受限，而心電圖、臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)等準(zhǔn)確性差，一定程度影響臨床治療及預(yù)后判斷，易延誤病情［3］。研究報(bào)道，血液外泌體與柯薩奇B 病毒引起的VMC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］。微小RNA（miRNA，miR）是一種非編碼RNA，在外泌體中表達(dá)豐度比組織中高很多，且miRNA 可被包裹在外泌體中運(yùn)輸，發(fā)揮對(duì)其靶基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，研究報(bào)道m(xù)iR-381、miR-133b 等多種miRNA 可參與心肌炎發(fā)生發(fā)展［5-6］。有研究報(bào)道，miR-148a 與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化作用機(jī)制有關(guān)［7］，但關(guān)于miR-148a 與VMC 的關(guān)系研究尚不多見。因此本研究擬通過檢測(cè)血漿外泌體miR-148a 水平，探究其對(duì)VMC 的診斷價(jià)值，以期為臨床VMC 快速診斷提供一定參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2017 年9 月至2019 年6 月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的VMC 病兒112 例納入研究組。住院時(shí)間（23.67±5.32）d；治愈63 例，有效36 例，無效13 例，總有效率88.39%；年齡（9.12±2.24）歲，范圍為2～14 歲；男66 例，女46 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)心血管學(xué)組和中華兒科雜志編輯委員會(huì)制定的《病毒性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)（修訂草案）》［8］；（2）年齡不超過14 歲；（3）臨床資料完整。另選取同期門診健康體檢正常兒童112 例為對(duì)照組，年齡（9.06±2.15）歲，范圍為2～13 歲；男62 例，女50 例。兩組病兒年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并先天性心臟病者；（2）合并惡性腫瘤者；（3）合并嚴(yán)重肝、肺、腎等重要臟器功能障礙者；（4）合并血液傳染性疾病或自身免疫性疾病者。收集所有受試者臨床檢查資料，所有樣品采集及資料調(diào)查均取得病兒或其監(jiān)護(hù)人知情同意并簽字確認(rèn)，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要試劑及儀器Exosome Isolation Reagent（貨號(hào)EX010）購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司；Trizol 試劑（貨號(hào)R0016）購(gòu)自上海碧云天科技有限公司；miRNA 提取試劑盒（貨號(hào)AM1561）、人心肌肌鈣蛋白I（cTnI）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（貨號(hào)MA1-20117）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；Prime-Script ?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨 號(hào)6210A）、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit（貨 號(hào)638314）均購(gòu)自TaKaRa 生物公司；檢測(cè)超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）試劑盒（50人份/盒，批號(hào)20122401706，武漢明德生物科技股份有限公司）。引物由華大基因合成。FC 型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司等。

1.3 方法

1.3.1 提取血漿外泌體 于VMC 病兒確診1 周內(nèi)，采集病兒及同期受試兒童晨起空腹外周靜脈血5 mL，并于1 h 內(nèi)3 000 r/min 離心10 min，有效離心半徑10 cm，留取血漿。采用外泌體分離試劑盒分離血漿中外泌體，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。并于透射電鏡下鑒定外泌體形態(tài)。

1.3.2 檢測(cè)血漿外泌體miR-148a 水平 取50 μL外泌體樣本，采用Trizol 提取血漿外泌體總RNA，濃度及純度檢驗(yàn)合格（吸光度280nm/吸光度260 nm約1.8～2.0）后，逆轉(zhuǎn)錄得互補(bǔ)DNA（cDNA）。采用RT-qPCR儀對(duì)miR-148a 進(jìn)行擴(kuò)增。miR-148a 正向引物序列（5′ →3′） ：ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCACTACAGAA，反 向 引 物 序 列（5′→3′）：CACAGCTCGTAGAACAGGAGG。內(nèi)參U6 正向引物序列（5′→3′）：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，反向引物序列（5′→3′）：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。反應(yīng)體系（25 μL）：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2X）12.5 μL，cDNA（50 mg/L）2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，5 s；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40 個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線。采用2-ΔΔCt法定量分析血漿外泌體miR-148a 相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 檢測(cè)血漿cTnI、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、hs-CRP水平 采用ELISA檢測(cè)病兒血漿cTnI水平，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用DXC600全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血漿CK-MB水平。采用熒光免疫層析法檢測(cè)血漿hs-CRP 水平（50 人份/盒，批號(hào)20122401706，武漢明德生物科技股份有限公司）。血漿CK-MB 正常參考范圍：0～25 U/L，cTnI 正常參考范圍：0～0.2 μg/L。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料均符合正態(tài)分布以± s表示，兩組間比較行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)血漿外泌體miR-148a 與血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平的相關(guān)性。繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線），組間ROC 曲線下面積（AUC）比較行Z 檢驗(yàn)，根據(jù)AUC比較血漿外泌體miR-148a、cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平對(duì)VMC 的診斷價(jià)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿外泌體鑒定分離得到血漿外泌體在透射電鏡下呈大小不等、直徑約100 nm 典型圓形或橢圓形囊泡結(jié)構(gòu)，見圖1。

圖1 透射電鏡下血漿外泌體形態(tài)

2.2 研究組與對(duì)照組兒童血漿外泌體miR-148a 水平比較研究組病兒血漿外泌體miR-148a 相對(duì)表達(dá)水平為（5.34±1.06），高于對(duì)照組（1.01±0.12）（t=42.96，P＜0.001）。

2.3 研究組與對(duì)照組兒童血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平比較與對(duì)照組比較，研究組病兒血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水 平 均 升 高（P＜0.05），見表1。

表1 兩組兒童血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP水平比較/± s

表1 兩組兒童血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP水平比較/± s

注：cTnI 為心肌肌鈣蛋白I，CK-MB 為肌酸激酶同工酶，hs-CRP為超敏C反應(yīng)蛋白。

組別對(duì)照組研究組t值P值例數(shù)112 112 cTnI/（μg/L）0.07±0.02 0.56±0.13 39.43＜0.001 CK-MB/（U/L）42.01±5.36 106.13±17.82 36.47＜0.001 hs-CRP/（mg/L）1.16±0.21 5.19±1.02 40.95＜0.001

2.4 VMC 病兒血漿外泌體miR-148a與血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平的相關(guān)性Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，VMC病兒血漿外泌體miR-148a與血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP水平均呈正相關(guān)（r=0.62、0.64、0.49，均P＜0.001）。

2.5 血漿外泌體miR-148a 及血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平對(duì)VMC 的診斷價(jià)值比較血漿外泌體miR-148a 與血漿cTnI 診斷早期VMC 的效能一致，均優(yōu)于血漿CK-MB、hs-CRP，見表2。

表2 血漿外泌體miR-148a及血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP水平對(duì)VMC的診斷價(jià)值比較

3 討論

以往研究多以血清標(biāo)本為載體篩選VMC 診斷生物標(biāo)志物，但由于血清蛋白含量豐富，易造成干擾，降低效率［9-10］。而因病兒心肌活檢組織不易獲取，在臨床早期VMC診斷中嚴(yán)重受限。本研究采用血漿外泌體為檢測(cè)標(biāo)本，外泌體是一種直徑約50～150 nm 的囊泡結(jié)構(gòu)，大小不等，主要內(nèi)容物為miRNA、mRNA 及蛋白質(zhì)等，成分相對(duì)簡(jiǎn)單，其內(nèi)部成分及其分泌細(xì)胞來源與病理生理狀態(tài)有關(guān)［11-12］。趙宗磊等［4］在VMC 病人血漿外泌體中成功篩選10 個(gè)VMC 相關(guān)差異蛋白，其中視黃醇結(jié)合蛋白4 有潛力成為VMC早期篩查特異性生物標(biāo)志，提示血漿外泌體在VMC 發(fā)病機(jī)理中扮演重要角色。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，研究組血漿外泌體miR-148a表達(dá)水平升高。miRNA 在進(jìn)化過程中序列高度保守，其在外泌體中表達(dá)豐度顯著高于組織及循環(huán)miRNA，外泌體來源miRNA 相對(duì)穩(wěn)定不易被RNA酶降解，且與VMC 炎癥、免疫過程密切相關(guān)［13］。Fan等［14］研究報(bào)道，急性心肌炎血清外泌體miR-181a 和miR-30a 表 達(dá) 上 調(diào)，上 調(diào)miR-181a 和miR-30a 可 通過靶向抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3 表達(dá)，促進(jìn)白細(xì)胞介素-6 分泌，促進(jìn)大鼠VMC 發(fā)生發(fā)展，相反抑制miR-181a 和miR-30a 可增加柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的VMC大鼠存活率。有研究報(bào)道，心肌活檢組織miR-148a 和miR-155 在急性VMC 病人中上調(diào)，miR-148a 可與miR-155 協(xié)同靶向抑制急性VMC 中核因子-κB 通路來減少柯薩奇病毒B3 誘導(dǎo)的VMC大鼠心臟損傷［15］。綜合以上研究及本研究結(jié)果提示血漿外泌體miR-148a 水平升高可能與小兒VMC發(fā)生有關(guān)。

近年來小兒VMC 發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì)，因缺乏特異性檢測(cè)指標(biāo)，易造成重癥VMC 病兒誤診、漏診，導(dǎo)致病情進(jìn)展惡化、甚至猝死，給病兒及其家屬造成嚴(yán)重傷害。因此急需尋找小兒VMC 早期診斷的簡(jiǎn)單、無創(chuàng)、敏感、特異生物指標(biāo)。目前臨床多采用等心肌酶譜、炎性指標(biāo)等相關(guān)指標(biāo)輔助VMC早期診斷，但靈敏度或特異性低，影響診斷的準(zhǔn)確性［16-17］。本研究亦對(duì)臨床常用cTnI、CK-MB、hs-CRP指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，研究組病兒血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平均升高，且與血漿外泌體miR-148a 均呈正相關(guān)。cTnI、CK-MB 在正常機(jī)體外周血含量極少，特異存在于心肌細(xì)胞中，心肌損傷時(shí)可釋放入血使血漿含量增加，是心肌損傷的標(biāo)志性蛋白［18-19］。hs-CRP是一種常見急性炎癥反應(yīng)蛋白，機(jī)體發(fā)生感染或損傷時(shí)，水平升高［20］。以上提示血漿外泌體miR-148a 水平升高可能與血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平升高有關(guān)，協(xié)同影響VMC發(fā)生發(fā)展及心肌損傷。本研究進(jìn)一步進(jìn)行ROC 分析發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體miR-148a 及血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平對(duì)VMC 早期診斷的AUC 分別為0.94、0.94、0.83、0.86，其中miR-148a 與cTnI 一致，優(yōu)于血漿CK-MB、hs-CRP，提示血漿外泌體miR-148a 對(duì)小兒VMC 診斷有較高參考價(jià)值，可能成為診斷早期VMC的生物標(biāo)志分子。

綜上所述，血漿外泌體miR-148a 在小兒VMC中表達(dá)水平上調(diào)，可能對(duì)小兒早期VMC有一定診斷價(jià)值，有潛力成為早期VMC 診斷的生物標(biāo)志分子。但由于本研究?jī)H為單中心研究，所納入的樣本量偏少，可能造成結(jié)果存在局限性，且關(guān)于miR-148a 診斷早期小兒VMC 的最佳閾值有待進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，后期應(yīng)加大樣本量進(jìn)行多中心深入探究。