鄭瑞利,馮迎軍,楊慧敏,王芳潔,何坤
病毒性心肌炎(VMC)是一種常見病毒感染相關(guān)性心肌疾病,其中以柯薩奇病毒B較多見,可發(fā)生于各年齡階段,但多見于學(xué)齡前及學(xué)齡期兒童[1]。病兒臨床表現(xiàn)不一,多數(shù)經(jīng)適當(dāng)治療后可痊愈,少數(shù)病兒病情進(jìn)展,可導(dǎo)致心律失常、心力衰竭甚至猝死,嚴(yán)重影響病兒身心健康并給其家庭帶來嚴(yán)重傷害[2]。目前尚缺乏特異、敏感單一快速診斷指標(biāo),臨床確診VMC 金標(biāo)準(zhǔn)仍為心內(nèi)膜活檢,因其有創(chuàng)性,活檢難度及風(fēng)險(xiǎn)較大,臨床應(yīng)用受限,而心電圖、臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)等準(zhǔn)確性差,一定程度影響臨床治療及預(yù)后判斷,易延誤病情[3]。研究報(bào)道,血液外泌體與柯薩奇B 病毒引起的VMC 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。微小RNA(miRNA,miR)是一種非編碼RNA,在外泌體中表達(dá)豐度比組織中高很多,且miRNA 可被包裹在外泌體中運(yùn)輸,發(fā)揮對(duì)其靶基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用,研究報(bào)道m(xù)iR-381、miR-133b 等多種miRNA 可參與心肌炎發(fā)生發(fā)展[5-6]。有研究報(bào)道,miR-148a 與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化作用機(jī)制有關(guān)[7],但關(guān)于miR-148a 與VMC 的關(guān)系研究尚不多見。因此本研究擬通過檢測(cè)血漿外泌體miR-148a 水平,探究其對(duì)VMC 的診斷價(jià)值,以期為臨床VMC 快速診斷提供一定參考?,F(xiàn)報(bào)告如下。
1.1 一般資料選擇2017 年9 月至2019 年6 月鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院收治的VMC 病兒112 例納入研究組。住院時(shí)間(23.67±5.32)d;治愈63 例,有效36 例,無效13 例,總有效率88.39%;年齡(9.12±2.24)歲,范圍為2~14 歲;男66 例,女46 例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)心血管學(xué)組和中華兒科雜志編輯委員會(huì)制定的《病毒性心肌炎診斷標(biāo)準(zhǔn)(修訂草案)》[8];(2)年齡不超過14 歲;(3)臨床資料完整。另選取同期門診健康體檢正常兒童112 例為對(duì)照組,年齡(9.06±2.15)歲,范圍為2~13 歲;男62 例,女50 例。兩組病兒年齡、性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并先天性心臟病者;(2)合并惡性腫瘤者;(3)合并嚴(yán)重肝、肺、腎等重要臟器功能障礙者;(4)合并血液傳染性疾病或自身免疫性疾病者。收集所有受試者臨床檢查資料,所有樣品采集及資料調(diào)查均取得病兒或其監(jiān)護(hù)人知情同意并簽字確認(rèn),本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。
1.2 主要試劑及儀器Exosome Isolation Reagent(貨號(hào)EX010)購(gòu)自上海歌凡生物科技有限公司;Trizol 試劑(貨號(hào)R0016)購(gòu)自上海碧云天科技有限公司;miRNA 提取試劑盒(貨號(hào)AM1561)、人心肌肌鈣蛋白I(cTnI)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(貨號(hào)MA1-20117)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen;Prime-Script ?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit(貨 號(hào)6210A)、Mir-X miRNA qRT-PCR SYBR Kit(貨 號(hào)638314)均購(gòu)自TaKaRa 生物公司;檢測(cè)超敏C 反應(yīng)蛋白(hs-CRP)試劑盒(50人份/盒,批號(hào)20122401706,武漢明德生物科技股份有限公司)。引物由華大基因合成。FC 型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司;7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司等。
1.3 方法
1.3.1 提取血漿外泌體 于VMC 病兒確診1 周內(nèi),采集病兒及同期受試兒童晨起空腹外周靜脈血5 mL,并于1 h 內(nèi)3 000 r/min 離心10 min,有效離心半徑10 cm,留取血漿。采用外泌體分離試劑盒分離血漿中外泌體,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。并于透射電鏡下鑒定外泌體形態(tài)。
1.3.2 檢測(cè)血漿外泌體miR-148a 水平 取50 μL外泌體樣本,采用Trizol 提取血漿外泌體總RNA,濃度及純度檢驗(yàn)合格(吸光度280nm/吸光度260 nm約1.8~2.0)后,逆轉(zhuǎn)錄得互補(bǔ)DNA(cDNA)。采用RT-qPCR儀對(duì)miR-148a 進(jìn)行擴(kuò)增。miR-148a 正向引物序列(5′ →3′) :ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCACTACAGAA,反 向 引 物 序 列(5′→3′):CACAGCTCGTAGAACAGGAGG。內(nèi)參U6 正向引物序列(5′→3′):GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,反向引物序列(5′→3′):CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。反應(yīng)體系(25 μL):SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2X)12.5 μL,cDNA(50 mg/L)2 μL,正反向引物(10 μmol/L)各1 μL,雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件:95 ℃,5 s;95 ℃,30 s;60 ℃,30 s;72 ℃,15 s;40 個(gè)循環(huán);添加溶解曲線。采用2-ΔΔCt法定量分析血漿外泌體miR-148a 相對(duì)表達(dá)水平。
1.3.3 檢測(cè)血漿cTnI、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、hs-CRP水平 采用ELISA檢測(cè)病兒血漿cTnI水平,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用DXC600全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血漿CK-MB水平。采用熒光免疫層析法檢測(cè)血漿hs-CRP 水平(50 人份/盒,批號(hào)20122401706,武漢明德生物科技股份有限公司)。血漿CK-MB 正常參考范圍:0~25 U/L,cTnI 正常參考范圍:0~0.2 μg/L。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料均符合正態(tài)分布以± s表示,兩組間比較行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)血漿外泌體miR-148a 與血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平的相關(guān)性。繪制受試者工作特征曲線(ROC 曲線),組間ROC 曲線下面積(AUC)比較行Z 檢驗(yàn),根據(jù)AUC比較血漿外泌體miR-148a、cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平對(duì)VMC 的診斷價(jià)值。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 血漿外泌體鑒定分離得到血漿外泌體在透射電鏡下呈大小不等、直徑約100 nm 典型圓形或橢圓形囊泡結(jié)構(gòu),見圖1。
圖1 透射電鏡下血漿外泌體形態(tài)
2.2 研究組與對(duì)照組兒童血漿外泌體miR-148a 水平比較研究組病兒血漿外泌體miR-148a 相對(duì)表達(dá)水平為(5.34±1.06),高于對(duì)照組(1.01±0.12)(t=42.96,P<0.001)。
2.3 研究組與對(duì)照組兒童血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平比較與對(duì)照組比較,研究組病兒血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水 平 均 升 高(P<0.05),見表1。
表1 兩組兒童血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP水平比較/± s
表1 兩組兒童血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP水平比較/± s
注:cTnI 為心肌肌鈣蛋白I,CK-MB 為肌酸激酶同工酶,hs-CRP為超敏C反應(yīng)蛋白。
組別對(duì)照組研究組t值P值例數(shù)112 112 cTnI/(μg/L)0.07±0.02 0.56±0.13 39.43<0.001 CK-MB/(U/L)42.01±5.36 106.13±17.82 36.47<0.001 hs-CRP/(mg/L)1.16±0.21 5.19±1.02 40.95<0.001
2.4 VMC 病兒血漿外泌體miR-148a與血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平的相關(guān)性Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示,VMC病兒血漿外泌體miR-148a與血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP水平均呈正相關(guān)(r=0.62、0.64、0.49,均P<0.001)。
2.5 血漿外泌體miR-148a 及血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平對(duì)VMC 的診斷價(jià)值比較血漿外泌體miR-148a 與血漿cTnI 診斷早期VMC 的效能一致,均優(yōu)于血漿CK-MB、hs-CRP,見表2。
表2 血漿外泌體miR-148a及血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP水平對(duì)VMC的診斷價(jià)值比較
以往研究多以血清標(biāo)本為載體篩選VMC 診斷生物標(biāo)志物,但由于血清蛋白含量豐富,易造成干擾,降低效率[9-10]。而因病兒心肌活檢組織不易獲取,在臨床早期VMC診斷中嚴(yán)重受限。本研究采用血漿外泌體為檢測(cè)標(biāo)本,外泌體是一種直徑約50~150 nm 的囊泡結(jié)構(gòu),大小不等,主要內(nèi)容物為miRNA、mRNA 及蛋白質(zhì)等,成分相對(duì)簡(jiǎn)單,其內(nèi)部成分及其分泌細(xì)胞來源與病理生理狀態(tài)有關(guān)[11-12]。趙宗磊等[4]在VMC 病人血漿外泌體中成功篩選10 個(gè)VMC 相關(guān)差異蛋白,其中視黃醇結(jié)合蛋白4 有潛力成為VMC早期篩查特異性生物標(biāo)志,提示血漿外泌體在VMC 發(fā)病機(jī)理中扮演重要角色。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,研究組血漿外泌體miR-148a表達(dá)水平升高。miRNA 在進(jìn)化過程中序列高度保守,其在外泌體中表達(dá)豐度顯著高于組織及循環(huán)miRNA,外泌體來源miRNA 相對(duì)穩(wěn)定不易被RNA酶降解,且與VMC 炎癥、免疫過程密切相關(guān)[13]。Fan等[14]研究報(bào)道,急性心肌炎血清外泌體miR-181a 和miR-30a 表 達(dá) 上 調(diào),上 調(diào)miR-181a 和miR-30a 可 通過靶向抑制細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3 表達(dá),促進(jìn)白細(xì)胞介素-6 分泌,促進(jìn)大鼠VMC 發(fā)生發(fā)展,相反抑制miR-181a 和miR-30a 可增加柯薩奇病毒B3誘導(dǎo)的VMC大鼠存活率。有研究報(bào)道,心肌活檢組織miR-148a 和miR-155 在急性VMC 病人中上調(diào),miR-148a 可與miR-155 協(xié)同靶向抑制急性VMC 中核因子-κB 通路來減少柯薩奇病毒B3 誘導(dǎo)的VMC大鼠心臟損傷[15]。綜合以上研究及本研究結(jié)果提示血漿外泌體miR-148a 水平升高可能與小兒VMC發(fā)生有關(guān)。
近年來小兒VMC 發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì),因缺乏特異性檢測(cè)指標(biāo),易造成重癥VMC 病兒誤診、漏診,導(dǎo)致病情進(jìn)展惡化、甚至猝死,給病兒及其家屬造成嚴(yán)重傷害。因此急需尋找小兒VMC 早期診斷的簡(jiǎn)單、無創(chuàng)、敏感、特異生物指標(biāo)。目前臨床多采用等心肌酶譜、炎性指標(biāo)等相關(guān)指標(biāo)輔助VMC早期診斷,但靈敏度或特異性低,影響診斷的準(zhǔn)確性[16-17]。本研究亦對(duì)臨床常用cTnI、CK-MB、hs-CRP指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,研究組病兒血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平均升高,且與血漿外泌體miR-148a 均呈正相關(guān)。cTnI、CK-MB 在正常機(jī)體外周血含量極少,特異存在于心肌細(xì)胞中,心肌損傷時(shí)可釋放入血使血漿含量增加,是心肌損傷的標(biāo)志性蛋白[18-19]。hs-CRP是一種常見急性炎癥反應(yīng)蛋白,機(jī)體發(fā)生感染或損傷時(shí),水平升高[20]。以上提示血漿外泌體miR-148a 水平升高可能與血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平升高有關(guān),協(xié)同影響VMC發(fā)生發(fā)展及心肌損傷。本研究進(jìn)一步進(jìn)行ROC 分析發(fā)現(xiàn),血漿外泌體miR-148a 及血漿cTnI、CK-MB、hs-CRP 水平對(duì)VMC 早期診斷的AUC 分別為0.94、0.94、0.83、0.86,其中miR-148a 與cTnI 一致,優(yōu)于血漿CK-MB、hs-CRP,提示血漿外泌體miR-148a 對(duì)小兒VMC 診斷有較高參考價(jià)值,可能成為診斷早期VMC的生物標(biāo)志分子。
綜上所述,血漿外泌體miR-148a 在小兒VMC中表達(dá)水平上調(diào),可能對(duì)小兒早期VMC有一定診斷價(jià)值,有潛力成為早期VMC 診斷的生物標(biāo)志分子。但由于本研究?jī)H為單中心研究,所納入的樣本量偏少,可能造成結(jié)果存在局限性,且關(guān)于miR-148a 診斷早期小兒VMC 的最佳閾值有待進(jìn)一步驗(yàn)證。因此,后期應(yīng)加大樣本量進(jìn)行多中心深入探究。