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        環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)檢測慢性阻塞性肺疾病伴下呼吸道感染病原菌397例價值研究

        2022-08-31 02:04:10溫雅黃娟杜焰家張偉強曾漢華朱旭華鐘子雙
        安徽醫(yī)藥 2022年9期
        關(guān)鍵詞:檢測方法

        溫雅,黃娟,杜焰家,張偉強,曾漢華,朱旭華,鐘子雙

        慢性阻塞性肺疾?。–OPD)是一種常見的慢性氣道炎癥,目前死亡率居全球第4 位。我國COPD的患病率及死亡率呈逐年上升趨勢,其診治為人們和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔[1]。COPD 病程分為穩(wěn)定期和急性加重期,下呼吸道感染是導(dǎo)致COPD 急性加重期(AECOPD)發(fā)生的重要原因,AECOPD 病人往往需要住院診治,或并發(fā)呼吸衰竭、肺性腦病、肺源性心臟病等嚴重并發(fā)癥,甚至需要呼吸機輔助通氣治療。據(jù)統(tǒng)計分析,COPD 伴下呼吸道感染病原體中細菌感染占約40%~50%,而且不同病程、基礎(chǔ)肺功能的AECOPD 下呼吸道感染的病原菌種類和分布均不同[2]。傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法檢測時間長,陽性率低,尤其對一些苛養(yǎng)菌的培養(yǎng)條件要求高,未能及時提供感染菌的臨床證據(jù),而環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是通過檢測病原菌核酸的分子生物學方法,能快速、靈敏地檢測出感染病原菌,常在24 h 內(nèi)就能檢測出相應(yīng)結(jié)果,在呼吸道感染早期階段就能及時提供病原學證據(jù),指導(dǎo)臨床抗生素的使用[3]。LAMP檢測方法近幾年逐漸普及臨床應(yīng)用[4-6],但其對COPD伴下呼吸道感染病原菌的檢測情況尚未見有文獻報道。故此,本研究通過回顧性探討LAMP(13 聯(lián))檢測方法對COPD 伴下呼吸道感染的病原菌的臨床應(yīng)用價值,主要是針對呼吸道細菌和非典型病原體感染的COPD病人。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料回顧性選取梅州市人民醫(yī)院2018年1 月至2020 年12 月診斷為COPD,臨床診斷伴有急性下呼吸道感染,符合納入與排除標準,臨床癥狀和檢查結(jié)果提示伴有下呼吸道感染,且接受抗生素治療的病人共397例,其中入住普通病房,包括呼吸內(nèi)科(2019 年改名為呼吸與危重癥醫(yī)學科)、中醫(yī)科、全科醫(yī)學科、感染性疾病科,均未接受呼吸機輔助通氣治療的病人共195 例,男177 例,女18 例,年齡(71.73±8.83)歲;入住重癥監(jiān)護室(ICU),因病情需要接受呼吸機輔助通氣的病人有202 例,男179例,女23例,年齡(73.86±9.31)歲;兩組病人的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.50,P=0.481;t=0.90,P=0.371)。本研究經(jīng)梅州市人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(梅市倫審2020-CY-18)。

        納入標準:①年齡范圍為18~100 歲;②根據(jù)我國COPD 基層治療指南《慢性阻塞性肺疾病基層診療指南(實踐版·2018)》[7]診斷為COPD,臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、咳黃膿痰、氣促加重,和/或伴有發(fā)熱、意識障礙等,檢查結(jié)果如影像學提示肺部感染,血清炎癥指標升高,提示伴有下呼吸道細菌或非典型病原體感染的病人;③經(jīng)病人和/或近親屬同意留取痰液/支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)/支氣管吸出物送檢LAMP(13 聯(lián))檢測和傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測;④臨床上均選用敏感抗生素抗感染治療,且治療有效果。排除標準:①合并活動性肺結(jié)核、肺癌、嚴重心肺功能障礙、凝血功能障礙的病人;②不同意留取痰液/BALF/支氣管吸出物送檢LAMP(13 聯(lián))檢測和培養(yǎng)檢測的病人;③臨床資料不完整或缺失病人;④痰液/BALF/支氣管吸出物不符合臨床檢驗標準的病人。

        1.2 方法檢測標本的獲?。鹤灾骺忍的芰ι泻玫牟∪巳朐海ㄈ胱∑胀ú》亢虸CU)后24 h內(nèi)在醫(yī)務(wù)人員指導(dǎo)下咳出深部痰液;年齡大或咳嗽能力差的病人則經(jīng)過支氣管鏡吸出深部痰液或經(jīng)過支氣管肺泡灌洗留取BALF,操作符合《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[8],獲取合格標本,并于2 h內(nèi)送檢。

        LAMP(13 聯(lián))檢測方法:所用方法為呼吸道病原菌核酸聯(lián)合檢測項目。首先需提取標本里病原菌DNA,病原菌基因組DNA的提取采用博奧生物公司生產(chǎn)的細菌DNA 提取試劑盒,按照廠家推薦的方案進行。通過檢測光密度(OD)260nm/OD280nm和OD260nm/OD230nm,使用Nanodrop 2000 TM 分光光度計(ThermoFisher Scientific 生產(chǎn))對純化DNA 樣品的質(zhì)量和濃度進行測量和評估。分離的DNA 保存在-20 ℃,待進一步使用。采用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒(博奧生物公司,中國北京)按照說明書,采用等溫擴增法和微流控芯片法相結(jié)合的方法,對病原菌進行LAMP檢測。采用呼吸道病原菌核酸檢測軟件對檢測結(jié)果進行可視化分析。檢測到13 種檢測細菌病原體:肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、肺炎支原體、肺炎衣原體、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

        傳統(tǒng)培養(yǎng)方法:按照臨床常規(guī)細菌/真菌培養(yǎng)操作標準,標本被接種在已處理的培養(yǎng)皿,經(jīng)孵化35 ℃恒溫培養(yǎng)箱,細菌檢測使用VITEK2 BioMerieux(法國)自動細菌分析儀,真菌檢測使用真菌分析儀。

        1.3 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計,均以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。其中計量資料以± s表示,采用兩獨立樣本t檢驗;計數(shù)資料以例數(shù)或構(gòu)成比表示,采用χ2檢驗,配對樣本間率的比較采用配對χ2檢驗;一致性檢驗采用Kappa 檢驗,Kappa≥0.75時表示兩者的一致性較好,0.40≤Kappa<0.75 時一致性一般,Kappa<0.40 時表示兩者的一致性較差。以統(tǒng)計學定義計算LAMP檢測方法的靈敏度、特異度。

        2 結(jié)果

        2.1 感染病原菌LAMP 方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果的比較入住普通病房和ICU 的COPD 伴下呼吸道感染的LAMP 方法檢測陽性率分別為45.13%、47.03%,均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法陽性率分別為9.74%、16.83%(χ2=9.72、9.99,P<0.001)。結(jié)合數(shù)據(jù)看,LAMP 方法陽性檢出率均偏高,提示有一定誤差。ICU 病房與普通病房LAMP檢測陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.44,P=0.704),ICU 病房傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果陽性率高于普通病房(χ2=4.04,P=0.038)。詳見表1,2。

        表1 普通病房COPD 195例感染病原菌LAMP與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果/例(%)

        表2 ICU病房COPD 202例感染病原菌LAMP與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果/例(%)

        2.2 LAMP 方法的靈敏度和特異度以傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果為標準,LAMP 方法對普通病房和ICU 病房的COPD 病人感染病原菌檢測的靈敏度分別為78.95%(15/19)、85.29%(29/34),特異度分別為58.52%(103/176)、60.71%(102/168)。具體例數(shù)見表1,2。

        2.3 不同標本的LAMP 方法檢測結(jié)果普通病房COPD 病人共收集180 份痰液、16 份BALF(共計196份標本),其中痰液的陽性率為47.22%,BALF 的陽性率為25.00%,兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);ICU 病房COPD 病人共收集199 份痰液,4 份BALF(共計203 份標本),其中痰液的陽性率為47.73%,BALF 的陽性率為25.00%,兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

        2.4 普通病房和ICU COPD 病人感染病原菌LAMP檢測結(jié)果的比較根據(jù)LAMP(13聯(lián))檢測結(jié)果,入住普通病房的COPD 伴下呼吸道感染病人的病原菌排在前三名為流感嗜血桿菌34例(17.44%)、耐甲氧西林葡萄球菌25例(12.82%)、銅綠假單胞菌13 例(6.67%)、肺炎鏈球菌13 例(6.67%);入住ICU的COPD 病人感染的病原菌排在前三名的為耐甲氧西林葡萄球菌43 例(21.29%)、流感嗜血桿菌14 例(6.93%)、肺炎鏈球菌13 例(6.44%)。其中,ICU 病房病人的耐甲氧西林葡萄球菌陽性率高于普通病房(P<0.05),普通病房病人中流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌陽性率高于ICU病房(P<0.05)。見表4。

        表3 普通病房/ICU病房COPD病人不同標本感染病原菌LAMP檢測結(jié)果比較/份(%)

        2.5 不同病房COPD 感染病原菌培養(yǎng)結(jié)果分布特點普通病房和ICU 的COPD 伴下呼吸道感染的病原菌種類、例數(shù)和構(gòu)成比,均以銅綠假單胞菌居首位,其次是肺炎克雷伯桿菌、鮑曼不動桿菌。除了常見菌株外,還有較少見的產(chǎn)氣腸桿菌、紋帶棒狀桿菌、葡萄牙棒孢酵母,真菌主要有白絲酵母菌、曲霉菌。見表5。

        2.6 LAMP(13 聯(lián))檢測方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的一致性分析普通病房病人中銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌的Kappa 值分別為0.62、0.59;ICU 病房病人中銅綠假單胞、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌的Kappa值分別為0.87、0.76、0.58。見表6,7。

        2.7 COPD 病人感染病原菌LAMP 檢測與培養(yǎng)陽性結(jié)果不相符病例LAMP 方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法陽性結(jié)果大多數(shù)為一致,僅有8 份病例存在不一致情況。分析可能原因:培養(yǎng)陽性的病原菌不是LAMP檢測范圍的病原菌,且非典型病原體未能經(jīng)過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲取,可能存在混合感染可能;而有2份病例標本LAMP 檢測為肺炎克雷伯菌,培養(yǎng)卻為銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌,存在病原菌在檢測過程中穩(wěn)定性不同的原因,需要進一步探討。見表8。

        表4 普通病房和ICU COPD病人感染病原菌LAMP檢測結(jié)果比較/例(%)

        3 討論

        COPD 是常見的慢性氣道炎癥,是一種不可逆的但可以治療和預(yù)防的慢性呼吸道疾病。吸煙和空氣污染導(dǎo)致COPD 發(fā)生的重要病因,我們國家吸煙人口基數(shù)大,重工業(yè)行業(yè)正在不斷發(fā)展強大中,COPD 患病率也在逐年上升[9]。隨著醫(yī)學研究的深入,進一步探究COPD 的發(fā)病機制及轉(zhuǎn)化傾向,2021年COPD 全球創(chuàng)議(global initiative for chronic obstructive lung disease,GOLD)提出了COPD 與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)[10]。有研究證實了COPD 病人中肺部微生物組介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致肺癌發(fā)生的重要原因[11-12],細菌感染也是導(dǎo)致COPD 病情加重、肺功能進一步下降的重要原因。所以,研究COPD 呼吸道感染的病原菌分布特點不僅能為COPD 病人提供治療的臨床依據(jù),更能延緩疾病病程發(fā)展的速度,改善病人的預(yù)后情況,盡量避免肺癌甚至更多嚴重合并癥的發(fā)生。

        表5 不同病房COPD感染病原菌培養(yǎng)結(jié)果分布特點/例(%)

        表6 普通病房COPD病人感染病原菌LAMP和傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果的一致性分析/例

        表7 ICU病房COPD病人感染病原菌LAMP和傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果的一致性分析/例

        隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,呼吸道感染病原菌不僅僅只是通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲取,況且傳統(tǒng)培養(yǎng)方法往往是耗時長、培養(yǎng)條件要求苛刻,尤其對于一些入院前已經(jīng)使用過抗生素的病人,經(jīng)常得到培養(yǎng)陰性的結(jié)果,未能及時指導(dǎo)抗生素的選用。對于COPD 伴下呼吸道感染的病人,現(xiàn)臨床上通過檢測痰液標本病原菌核酸和血清學抗原/抗體的方法,能夠快捷有效地提供感染病原菌的證據(jù)。本研究采用的LAMP 檢測方法是一種新型的核酸擴增方法,LAMP 方法在病原學檢測的應(yīng)用價值已得到肯定,檢測范圍包括病毒、細菌、寄生蟲等,其衍生出來的分子生物學檢測方法也在不斷更新中[13-15]。此項檢查項目在該院的醫(yī)囑項目為“呼吸道病原菌核酸聯(lián)合檢測”,即使用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒,通過檢測病原菌DNA 的方法檢測出13 種病原菌。研究對象選擇為入住不同病房的COPD 病人,原因是本研究是回顧性分析,病人肺功能檢查資料不齊,未能從COPD 的肺功能等級角度分析,而是否使用呼吸機輔助通氣取決于COPD 病人的病情嚴重程度,伴有下呼吸道感染的致病菌的分布特點存在不同,分析結(jié)果可以顯示不同病情程度的COPD 病人伴有下呼吸道感染病原菌的分布特點,對臨床診療具有相應(yīng)價值。從統(tǒng)計結(jié)果看出,普通病房和ICU 病房的COPD 病人通過LAMP(13 聯(lián))方法檢測的病原菌的陽性率分別是45.13%、47.03%,均以單一感染為主,高于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法(P<0.001),這跟國內(nèi)的相關(guān)研究[5,16-17]結(jié)果基本相符。

        檢測標本采用痰液、BALF、支氣管吸出物,以痰液為主,痰液及BALF的LAMP方法檢測陽性率均差異無統(tǒng)計學意義,而既往的研究顯示痰液的陽性率比BALF 的高[5],因本研究采用回顧性分析,標本的數(shù)量差異較大,所以,不同標本的LAMP檢測結(jié)果仍須進一步研究探討,本課題組正在進行后續(xù)的BALF 呼吸道病原菌核酸檢測價值的研究中。普通病房和ICU 的COPD 病人的傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率分別是9.74%、16.83%(P<0.05),究其原因為:傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率低的原因有該院是地方三級甲等醫(yī)院,病人在入院前已經(jīng)使用抗生素治療;其中入住ICU 的COPD 病人伴有重癥呼吸道感染,病人缺失咳嗽、咳痰能力,病情需要無創(chuàng)/有創(chuàng)通氣治療,或者存在呼吸機相關(guān)感染的情況,常規(guī)采用床邊纖維支氣管鏡獲得肺部深部痰液,導(dǎo)致ICU 病房的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法結(jié)果的陽性率高于普通病房。

        表8 COPD病人感染病原菌LAMP檢測與傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性結(jié)果不相符病例

        根據(jù)LAMP 檢測結(jié)果,入住普通病房的COPD伴下呼吸道感染的病人的病原菌排在前三名為流感嗜血桿菌34 例(17.44%)、耐甲氧西林葡萄球菌25 例(12.82%)、銅綠假單胞菌13 例(6.67%)、肺炎鏈球菌13例(6.67%);而入住ICU的COPD病人感染的病原菌排在前三名的為耐甲氧西林葡萄球菌43例(21.29%)、流感嗜血桿菌14例(6.93%)、肺炎鏈球菌13 例(6.44%)。入住普通病房的COPD 病人的病情較輕,以社區(qū)輕癥感染為主,流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌為主,與國內(nèi)外流行病學調(diào)查[18]結(jié)果相符,但國內(nèi)缺少多中心臨床研究證據(jù)。其中流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌的培養(yǎng)例數(shù)為1、0例,因為流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌屬于導(dǎo)致人類呼吸道感染常見的苛養(yǎng)菌,在普通的培養(yǎng)環(huán)境不能生長,需要在培養(yǎng)皿中添加特殊的營養(yǎng)物質(zhì)[19],LAMP 檢測方法對于這種苛養(yǎng)菌的檢測具有快速靈敏、經(jīng)濟有效的優(yōu)勢,彌補了傳統(tǒng)培養(yǎng)對一些苛養(yǎng)菌不敏感的不足,能夠及時獲得感染致病菌的證據(jù),指導(dǎo)臨床用藥。普通病房COPD 病人經(jīng)LAMP方法檢測出有肺炎衣原體、嗜肺軍團菌,這兩種非典型病原體很難通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測出,經(jīng)常通過血清學方法檢測出,但血清學檢查經(jīng)常有滯后現(xiàn)象,國內(nèi)已有研究顯示LAMP 方法在檢測非典型病原體感染方面具有很大優(yōu)勢[20-21],本研究結(jié)果也顯示LAMP方法能夠檢測出呼吸道致病性非典型病原體。入住ICU病房的病人中可見耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)陽性率高(P<0.05),高于普通病房,過去的一些臨床研究顯示COPD 常見的感染病原菌以革蘭陰性菌為主,但是因COPD 呼吸道免疫防御能力的下降、長期吸入或全身使用糖皮質(zhì)激素、反復(fù)住院使用廣譜抗生素、合并院內(nèi)感染,入住ICU 的COPD 常常伴有肺部重癥感染,導(dǎo)致條件致病菌MRSA 感染的比例上升,甚至還有一些社區(qū)感染的情況發(fā)生[22-25],本研究顯示普通病房的COPD伴下呼吸道感染菌中MRSA 也位居前列,國外有臨床研究顯示COPD 是MRSA 感染的獨立危險因素[26],但是,MRSA 感染與COPD 的關(guān)系仍需更多的臨床研究進一步探討。從上述結(jié)果顯示,LAMP(13 聯(lián))涵蓋了COPD呼吸道感染最常見的致病菌,對COPD伴下呼吸道感染病原菌的檢測具有靈敏、快捷、有效的優(yōu)點。

        以傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果為標準,LAMP 方法對普通病房和ICU 病房的COPD 病人感染病原菌檢測的靈敏度分別為78.95%、85.29%,特異度分別為58.52%、60.71%,LAMP 方法對感染病原菌的檢測有比較好的靈敏度,但是因為傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果的陽性率低,不同標本的檢測結(jié)果有差異,導(dǎo)致特異度低的結(jié)果,所以本研究與國內(nèi)相關(guān)研究一樣采用一致性檢驗即Kappa 檢驗。經(jīng)LAMP 方法檢出銅綠假單胞菌與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測結(jié)果的一致性最高,Kappa 值為0.87,具有較好的一致性,鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌的Kappa 值為0.76、0.58,跟該院LAMP 技術(shù)相關(guān)研究及國內(nèi)一些研究結(jié)果相符合[5,27],但由于研究人群的不同,呼吸道感染致病菌菌種也有不同,根據(jù)既往的研究顯示,以痰培養(yǎng)結(jié)果統(tǒng)計分析,該院COPD 病人伴有呼吸道感染致病菌以革蘭陰性菌為主,銅綠假單胞菌居首位,前五名的還有鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌[28],因上文提到的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對苛養(yǎng)菌和非典型病原體培養(yǎng)困難,統(tǒng)計結(jié)果可能會偏向容易培養(yǎng)出的致病菌,這也側(cè)面說明了LAMP 方法可以檢測出COPD 病人的呼吸道感染致病菌,與痰培養(yǎng)結(jié)果有比較好的一致性,彌足了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的不足,有效獲得COPD 伴呼吸道感染病原菌的證據(jù),指導(dǎo)臨床治療。

        此外,此研究有8份病例存在不一致情況,分析可能原因:培養(yǎng)陽性的病原菌不是LAMP 檢測范圍的病原菌,特別是以真菌為主,且非典型病原體未能經(jīng)過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲取,可能存在混合感染可能;而有2 份病例標本LAMP 檢測為肺炎克雷伯菌,培養(yǎng)卻為銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌,存在病原菌在檢測過程中穩(wěn)定性不同的原因,需要進一步探討。

        綜上所述,LAMP方法在COPD人群中伴有下呼吸道感染病原菌的檢測方面具有靈敏、快捷的優(yōu)勢,尤其是對于難以培養(yǎng)出的苛養(yǎng)菌和非典型病原體的靈敏度高,能及時為COPD 病人的治療提供臨床依據(jù),具有非常重要的臨床意義,應(yīng)該普及臨床應(yīng)用。我們課題組主要是針對LAMP 檢測方法對COPD 伴急性下呼吸道感染病原菌應(yīng)用價值研究,通過上述結(jié)果可以分析該院LAMP檢測方法的運用狀況,分析不同呼吸道標本的檢測情況,我們也正在進行BALF 呼吸道病原菌核酸檢測價值的研究。本研究也有不足之處,比如樣本量較少,因回顧性分析缺失COPD 合并結(jié)核分枝桿菌感染的資料,COPD 伴下呼吸道感染病原體還包括一些不常見的菌群或真菌或病毒感染,需要聯(lián)合其他檢測方法。雖然LAMP 方法目前在臨床應(yīng)用上比較廣泛,但仍需要更多的臨床研究去探討其臨床應(yīng)用價值,促進分子生物學檢測技術(shù)不斷更新及改進,為病人的臨床診治帶來更多益處。

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