程友斌，王政，褚朝森，孫靜

綿馬貫眾為鱗毛蕨科植物粗莖鱗毛蕨帶葉柄殘基的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，其味苦，性微寒，有小毒，具有清熱解毒和驅(qū)蟲(chóng)等功效［1］，主產(chǎn)于黑龍江、吉林等地，臨床用于治療疫毒感冒，蟲(chóng)積腹痛等疾患，現(xiàn)代藥理研究表明其有抗病毒、抗腫瘤和抗菌等作用，在國(guó)家《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中有推薦使用。近幾版《中國(guó)藥典》均將綿馬貫眾予以單列，然而因綿馬貫眾藥源植物歷史構(gòu)成較為混亂，曾用作貫眾的原植物有11科18屬58 種之多［2］，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期考證和市場(chǎng)規(guī)范，目前市場(chǎng)上仍有約5種以上植物的根莖被混充作綿馬貫眾使用，他們?cè)谕庥^形態(tài)特征上與綿馬貫眾十分相似，非鑒別經(jīng)驗(yàn)豐富者不能準(zhǔn)確感官鑒定，常規(guī)理化鑒別如紫外可見(jiàn)光譜法（UV）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、高效液相色譜法（HPLC）等質(zhì)量控制方法［3-4］均存在樣品處理程序復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力、難以完全滿足生產(chǎn)一線對(duì)其快速鑒別的需要，而紅外光譜法可從整體上把握中藥體系成分，具有取樣量小、快速、準(zhǔn)確，以及專屬性和特征性強(qiáng)等特點(diǎn)［5-9］，可較好填補(bǔ)綿馬貫眾的這一實(shí)際需求，目前國(guó)內(nèi)關(guān)于綿馬貫眾的研究［10-11］中尚未見(jiàn)到應(yīng)用紅外光譜法鑒別綿馬貫眾正偽藥材的報(bào)道，亦鮮見(jiàn)使用紅外光譜對(duì)5 種偽品藥材整體進(jìn)行鑒定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)于2019 年10 月至2020 年11 月以9 個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾與5 種偽品為研究對(duì)象，建立綿馬貫眾的紅外指紋圖譜，并結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)、相似度評(píng)價(jià)，聚類分析和主成分分析（PCA），為綿馬貫眾的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥材藥材購(gòu)于吉林敦化、和龍、蛟河、龍井、汪清、通化、延吉，黑龍江牡丹江和尚志，以及安徽亳州、河北安國(guó)、廣西玉林等地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥鑒定教研室潘宏林教授鑒定為綿馬貫眾、峨嵋蕨貫眾、鱗毛蕨貫眾、單芽狗脊蕨貫眾、狗脊蕨貫眾和蘇鐵蕨貫眾。憑證標(biāo)本存于江蘇省連云港中醫(yī)藥高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校中醫(yī)藥博物館，基源鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

1.2 儀器與試劑傅里葉變換紅外光譜儀（日本SHIMADZU 公司，型號(hào)IRPrestige-21），DLATGS檢測(cè)器、XS105DU 十萬(wàn)分之一電子分析天平（METTLER TOLEDO 公司），HY-12 粉末壓片機(jī)（天津天光光學(xué)儀器有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9240A上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），瑪瑙研缽（阜新縣偉成瑪瑙廠）；溴化鉀（光譜純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）。

1.3 方法

1.3.1 供試品的制備 取9份不同產(chǎn)地綿馬貫眾樣品，以及峨眉蕨貫眾、鱗毛蕨貫眾、單芽狗脊蕨貫眾、狗脊蕨貫眾和蘇鐵蕨貫眾等5 種偽品各一份于60 ℃干燥4 h，粉碎后過(guò)200 目篩，得到飲片粉末備用。取樣品粉末2 mg 至瑪瑙研缽中，加入120 ℃干燥后溴化鉀粉末作為分散劑，樣品與溴化鉀混合比例為1∶200，研磨均勻，取適量研磨后的粉末平鋪于紅外壓片磨具中，以25 MPa 壓力壓制60 s，取出，對(duì)光檢視，以樣片均勻，半透明為合格，作為供試品［12］。

1.3.2 紅外光譜分析條件 將制備好的供試品壓片置于紅外光譜儀中測(cè)定，測(cè)定波數(shù)段為4 000～400 cm-1，掃描信號(hào)累加20 次，分辨率為4 cm-1，室內(nèi)溫度與濕度分別控制在24 ℃和25%～35%，掃描室實(shí)時(shí)扣除水和二氧化碳的干擾。掃描完成后，使用OMNIC8.2扣除背景，并進(jìn)行基線校正和自動(dòng)平滑處理，計(jì)算各樣品的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜平滑點(diǎn)數(shù)為17點(diǎn)。

1.3.3 方法學(xué)考察

1.3.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 從14 份供試品中隨機(jī)取一份按“1.3.1”項(xiàng)下制備方法壓片，測(cè)定，連續(xù)掃描6次，以所得紅外光譜數(shù)據(jù)相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)儀器的精密度。結(jié)果6 次所測(cè)光譜相似度均在0.99以上，顯示紅外光譜儀精密度狀態(tài)良好。

1.3.3.2 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 從14 份供試品中隨機(jī)取一份按“1.3.1”項(xiàng)下制備方法，平行壓片6 份，分別測(cè)定，以所得紅外光譜數(shù)據(jù)相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性。結(jié)果6份樣品光譜數(shù)據(jù)相似度均在0.98以上，表明本實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)性良好。

1.3.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 從14 份供試品中隨機(jī)取一份按“1.3.1”項(xiàng)下制備方法壓片，供試品置于干燥器中，分別在0、1、2、3、4、5 h 時(shí)各測(cè)試1 次，匯總光譜圖，并以所得紅外光譜數(shù)據(jù)相似度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定性。結(jié)果6個(gè)時(shí)段測(cè)定的光譜數(shù)據(jù)相似度均在0.98 以上，反映供試品在6 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2 結(jié)果

2.1 共有峰確定與偽品原始光譜之間的比較分析將14 份供試品按照“1.3.1”項(xiàng)下制備方法分別壓片、測(cè)定，得到9 個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾光譜結(jié)果，通過(guò)對(duì)該9 批紅外光譜的分析和比較，確定了16 個(gè)共有峰，分別是530、577、610、705、766 、859、1 018、1 154、1 201、1 257、1 284、1 372、1 444、1 627、2 925、3 357 cm-1，數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表1 9個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾（S1～S9）及5種偽品（W1～W5）來(lái)源及鑒定信息

將9批綿馬貫眾紅外光譜進(jìn)行平均計(jì)算后作為共有模式，再與5種偽品原始光譜進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示5 個(gè)偽品均存在一個(gè)吸收尖峰，而1 554～1 494 cm-1波段之間，共有模式為一個(gè)中等吸收肩峰，此外1 304～1 165 cm-1波段共有模式吸收強(qiáng)度小于偽品，其余波段吸收則均強(qiáng)于所有偽品。為進(jìn)一步探索各樣品吸收峰之間的差別，本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)行了二階導(dǎo)數(shù)分析。

2.2 二階導(dǎo)數(shù)光譜之間的比較分析綿馬貫眾共有模式與5種偽品二階導(dǎo)數(shù)圖譜比對(duì)見(jiàn)圖1，分析結(jié)果表明共有圖譜與5 種偽品在3 個(gè)不同波段上的吸收峰數(shù)目和強(qiáng)度均有不同，其中共有圖譜在4 000～3 500 cm-1波段為中等吸收，在1 748～1 604 cm-1波段吸收峰數(shù)目為4 個(gè)，5 種偽品與此不同。同時(shí)，對(duì)照原始光譜圖形，對(duì)1 554～1 494 cm-1波段之間光譜觀察，共有模式與5 個(gè)偽品在此區(qū)間均為峰谷。見(jiàn)表3。

表2 9個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾（S1～S9）及5種偽品（W1～W5）紅外圖譜相似度分析結(jié)果

圖1 綿馬貫眾共有模式與5種偽品（W1～W5）紅外二階導(dǎo)數(shù)光譜

表3 綿馬貫眾與5種偽品（W1～W5）的二階導(dǎo)數(shù)圖譜特征

2.3 相似度評(píng)價(jià)通過(guò)OMNIC 8.2 對(duì)所有供試品紅外光譜進(jìn)行標(biāo)峰，得到各吸收峰的波數(shù)與吸光度數(shù)值，以9 個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾供試品紅外光譜中共有峰吸光度的均值為參照，以?shī)A角余弦和相關(guān)系數(shù)評(píng)價(jià)相似度，分別計(jì)算不同產(chǎn)地綿馬貫眾及5 種偽品的相似度。由表2可知，9個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾之間相似度很高，相關(guān)系數(shù)均在0.96以上，夾角余弦也在0.98以上，說(shuō)明不同產(chǎn)地綿馬貫眾飲片質(zhì)量基本穩(wěn)定，具有很好的一致性。同時(shí)與峨嵋蕨貫眾、鱗毛蕨貫眾、單芽狗脊蕨貫眾、狗脊蕨貫眾和蘇鐵蕨貫眾之間表現(xiàn)出較低的相似性，其中相關(guān)系數(shù)較高的是狗脊蕨貫眾（0.801），狗脊蕨貫眾（0.728），夾角余弦計(jì)算結(jié)果同樣反映綿馬貫眾與狗脊蕨貫眾和單芽狗脊蕨貫眾較為接近，分別為0.918 和0.905，同時(shí)5 種偽品之間相似度也存在差距，以蘇鐵蕨貫眾差別最大，此結(jié)果與正偽品性狀鑒定結(jié)果一致。

2.4 綿馬貫眾與各偽品之間的聚類分析根據(jù)表2紅外光譜分析結(jié)果，以各峰位的吸光度為變量，采用組間連接方法，選取歐氏平方距離作為區(qū)間測(cè)度，通過(guò)SPSS 22.0作為統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分層聚類分析。結(jié)果可知在歐氏距離平方和為5 時(shí)，可以分成5 大類，其中9 個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾歸為一類（S1～S9），單芽狗脊蕨貫眾與狗脊蕨貫眾歸為一類（W3，W4），顯示二者親緣關(guān)系較近，而蘇鐵蕨貫眾（W5）、鱗毛蕨貫眾（W2）和峨嵋蕨貫眾（W1）則獨(dú)立分開(kāi)，分析結(jié)果與相似度分析相一致。見(jiàn)圖2。

2.5 綿馬貫眾與各偽品之間的PCAPCA 是將多個(gè)變量通過(guò)線性變換以選出較少重量變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，運(yùn)用PCA 方法可以在不降低光譜差異的前提下，減少數(shù)據(jù)維數(shù)，將每條光譜與其他光譜進(jìn)行比較［13-14］。將全部14批樣品紅外圖譜所有吸收峰吸光度值作為變量（見(jiàn)表2），通過(guò)SPSS 22.0 進(jìn)行PCA，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3 為14 批樣品的三維散點(diǎn)圖，所提取的3 個(gè)成分對(duì)分析結(jié)果的貢獻(xiàn)率分別是75.7%、14.4%和6.3%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了96.4%，包含了原數(shù)據(jù)中大部分信息，可知分析結(jié)果反映了樣品的真實(shí)情況。圖3 表明除了S1 和S8 產(chǎn)地為吉林敦化和通化的兩個(gè)樣品點(diǎn)稍有離散，其余綿馬貫眾樣品點(diǎn)基本重合（S2～S7），但仍然都較好地歸集到了一個(gè)區(qū)域，而W1～W5 全部偽品樣品點(diǎn)則完全離散，其中單芽狗脊蕨貫眾（W3）和狗脊蕨貫眾（W4）與綿馬貫眾距離相對(duì)較近，此結(jié)果與相似度分析和聚類分析保持一致。

3 討論

圖2 9個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾（S1～S9）及5種偽品（W1～W5）紅外光譜聚類分析譜系圖

圖3 9個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾（S1～S9）及5種偽品（W1～W5）紅外主成分分析圖

本實(shí)驗(yàn)選取9 個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾和5 種常見(jiàn)偽品作為研究對(duì)象，建立了綿馬貫眾紅外光譜共有模式，利用原始紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行圖形特征識(shí)別分析，利用相似度、聚類分析和PCA 的化學(xué)計(jì)量法進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明9個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾紅外光譜相似度較高，相似度均在0.960 以上，紅外光譜吸收曲線亦大致重疊，但部分波段吸光度有高低之分，顯示各地樣品的成分含量存在差異，此結(jié)果可能與樣品生長(zhǎng)地理環(huán)境之間存在關(guān)聯(lián)。共有光譜與5個(gè)偽品的比較結(jié)果顯示相似度最高的是W4狗脊蕨貫眾，其夾角余弦達(dá)到0.918，相關(guān)系數(shù)在0.801，其余依次走低，此趨勢(shì)與市場(chǎng)實(shí)際鑒別差錯(cuò)率情況相符。共有峰與偽品圖譜進(jìn)一步對(duì)比發(fā)現(xiàn)波段之間，5 個(gè)偽品均存在一個(gè)吸收尖峰，而共有模式為一個(gè)中等吸收肩峰。真?zhèn)螛悠返亩A導(dǎo)數(shù)光譜在1 554～1 494 cm-1區(qū)域雖然均為峰谷，但是谷形略有差別，此與原始光譜中的吸收峰和肩峰在二階導(dǎo)數(shù)中均顯示為峰谷特性有關(guān)，而二階導(dǎo)數(shù)在4 000～3 500 cm-1、1 748～1 604 cm-1和1 110～990 cm-1三個(gè)區(qū)域中吸收峰數(shù)目明顯不同，可資區(qū)別。進(jìn)一步采用聚類分析方法分析結(jié)果表明在平方歐氏距離為5時(shí)，即可將9個(gè)產(chǎn)地綿馬貫眾與5種偽品歸為4類，正品綿馬貫眾1類，5個(gè)偽品歸為3類。PCA 結(jié)果也再次驗(yàn)證了正品與偽品之間的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系，其中W3 單芽狗脊蕨貫眾和W4 狗脊蕨貫眾與綿馬貫眾離散度雖小，但依然能夠清晰分開(kāi)，W1 峨眉蕨貫眾、W2 鱗毛蕨貫眾和W5 蘇鐵蕨貫眾離散相對(duì)較大，總體離散特征與正偽品外觀形態(tài)相似度十分相符，說(shuō)明聚類分析和PCA 此兩個(gè)化學(xué)模式識(shí)別方法分析綿馬貫眾正偽品的紅外數(shù)據(jù)特征較為準(zhǔn)確。

相對(duì)于綿馬貫眾UPLC、HPLC 和PCR［15-19］等質(zhì)量分析手段而言，本紅外光譜鑒別實(shí)驗(yàn)研究方法取樣量小，制樣簡(jiǎn)單，分析速度快，并從整體上反應(yīng)綿馬貫眾的成分信息，采用化學(xué)模式識(shí)別分析結(jié)果準(zhǔn)確，可對(duì)市場(chǎng)長(zhǎng)期存在的綿馬貫眾易混淆品種問(wèn)題進(jìn)行快速甄別，為實(shí)際檢驗(yàn)和生產(chǎn)質(zhì)量的前期控制提供有效手段和科學(xué)依據(jù)。