劉蕓雅，劉哲鵬，王俊，梁會敏

艾塞那肽是一種胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動劑［1］。艾塞那肽特異性地作用于GLP-1 受體，通過環(huán)磷酸腺苷和/或其他細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的作用，增加葡萄糖依賴性的胰島素合成和體內(nèi)胰腺β 細胞的胰島素分泌，抑制胰高血糖素的過量分泌，并延緩胃排空，從而良好地控制血糖水平［2］。但是艾塞那肽作為多肽類藥物，在體內(nèi)穩(wěn)定性差導(dǎo)致了其生物半衰期短，口服吸收差，生物利用度低［3］。目前只能采用注射方式給藥，導(dǎo)致病人治療依從性低，使得其臨床應(yīng)用大受限制［4］。已有很多研究開始關(guān)注艾塞那肽緩釋口服制劑的開發(fā)。通過聚合物制備納米?？梢詫⒍嚯暮偷鞍踪|(zhì)類藥物包裹于其中，從而增加了藥物在胃腸道中的穩(wěn)定性，同時也可促進小腸上皮細胞對藥物的吸收，可以提高藥物的生物利用度［5］。

聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（actic-co-glycolic acid），PLGA］是一種生物可降解聚合物材料，用作納米粒載體可以保護藥物減少胃腸道的降解，增加了藥物穩(wěn)定性，從而提高生物半衰期，同時PLGA 的緩釋作用還能控制藥物緩慢釋放從而達到長效緩釋靶向目的［6］。PLGA 納米粒具有療效穩(wěn)定、生物相容性好與用量少等特點［7］。因此本研究選用PLGA作為納米粒載體材料。

本研究以PLGA 為載體，采用乳化復(fù)乳法（水包油包水，W/O/W）制備艾塞那肽納米粒，與傳統(tǒng)乳化法相比能解決藥物向外水相泄露的問題，從而提高了水溶性藥物的包封率［8］。本研究于2018 年10 月至2019 年8 月對納米粒制備的處方工藝進行了優(yōu)化完善，對制備的艾塞那肽進行含量檢測并完成含量分析方法驗證。通過體外表征和釋放評價PLGA納米粒（EX-PLGA NPs）的質(zhì)量和緩釋能力，說明了制備的PLGA 納米粒用于艾塞那肽口服給藥的可行性，為艾塞那肽抗糖尿病口服緩釋制劑的分析和開發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

1.1.1 試藥 醋酸艾塞那肽（EX，純度＞98%，批號20181101，上海蘇豪逸明制藥有限公司）；聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，乳酸/羥基乙酸=50∶50，分子量9 000，濟南岱罡生工程有限公司）；聚乙烯醇（PVA，批號T20120310，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；透析袋（分子量8 000～14 000，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Waters 2996 PAD 檢測器（美國沃特世公司）；Agilent? ZORBAX SB-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Agilent 公司）；超聲波細胞粉碎機（型號JY-150Y，上海熙揚儀器有限公司）；磁力攪拌器（型號78-1，上海助藍儀器科技有限公司）；Zetasizer 激光粒徑測定儀（英國Malvern 公司）；FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN透射電鏡（美國FEI公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米粒的制備與處方工藝優(yōu)化

1.2.1.1 制備方法 參考文獻［9-11］及課題組前期研究方法，采用乳化復(fù)乳法制備艾塞那肽PLGA 納米粒。稱取3 mg 艾塞那肽溶解于0.2 mL 的水中，為內(nèi)水相。稱取一定量的PLGA 溶于0.8 mL 丙酮和二氯甲烷的混合溶液中（各50%），為油相。將內(nèi)水相注入油相，在冰水浴條件下以95 W探頭超聲一定時間（超聲1 s 間隔2 s），形成初乳。再迅速將初乳注入3 mL一定濃度的PVA水溶液中，在冰水浴條件下95 W 超聲4 min（超聲1 s間隔2 s），形成復(fù)乳。最后在磁力攪拌下將復(fù)乳緩慢滴入26 mL 的0.5% PVA外水相，在通風(fēng)櫥內(nèi)以600 r/min 磁力攪拌使有機相完全揮發(fā)，得到帶有乳光的納米粒溶液。將納米粒溶液離心，并用純水重懸洗滌數(shù)次得納米粒沉淀，收集沉淀冷凍干燥得固體艾塞那肽PLGA納米粒。本研究前期通過單因素考察，固定了如下實驗參數(shù)：艾塞那肽的量為3 mg，內(nèi)水相量為0.2 mL。固定內(nèi)水相∶油相=1∶4，采用丙酮和二氯甲烷為混合油相以增加包封率。冰水浴下間歇95 W 超聲防止超聲溫度上升過快。復(fù)乳超聲時間為4 min，復(fù)乳與外水相體積比為1∶6.5，外水相乳化劑PVA 濃度為0.5%，磁力攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min。確定了初乳超聲時間為90～150 s；形成初乳中PVA 濃度范圍為1%～5%；PLGA和艾塞那肽的比例范圍為10～20。

1.2.1.2 包封率和載藥量測定 精密稱取一定量的EX-PLGA NPs 凍干粉末，按艾塞那肽含量測定步驟，取續(xù)濾液以高效液相色譜法（HPLC）測定樣品中艾塞那肽含量。按以下公式計算EX-PLGA NPs 的載藥量和包封率：載藥量=m包/m總×100%，包封率=m 包/m 藥×100%。式中：m 包為納米粒中包入的艾塞那肽質(zhì)量（mg），m 總為稱取EX-PLGA NPs 的總質(zhì)量（mg），m藥為投入的艾塞那肽總質(zhì)量（mg）。

1.2.1.3 Box-Behnken Design（BBD）響 應(yīng) 面 優(yōu) 化考慮到處方工藝的交互作用，選擇初乳超聲時間（A），形成初乳中PVA 濃度（B），PLGA 和艾塞那肽的比例（C）為考察對象，采用三因素三水平，以包封率為評價指標，選用BBD 響應(yīng)面分析法對處方工藝進行優(yōu)化［12］，設(shè)計因素水平見表1。

表1 BBD響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計三因素三水平

1.2.2 納米粒的體外表征與釋放

1.2.2.1 粒徑和Zeta 電位測定 稱取適量的EXPLGA NPs用純化水分散稀釋至合適的濃度，量取約1 mL 納米粒溶液分別置于粒徑池和電位池中，以激光粒徑分析儀測定EX-PLGA NPs粒徑和電位。

1.2.2.2 形態(tài)學(xué)考察 稱取適量的EX-PLGA NPs用純化水分散稀釋至合適的濃度，吸取稀釋后的樣品溶液10 μL 置于銅網(wǎng)上，放置一定時間使樣品溶液浸入銅網(wǎng)孔中，然后用濾紙吸走銅網(wǎng)上多余的溶液，室溫干燥后于透射電子顯微鏡下觀測EX-PLGA NPs形態(tài)并拍照。

1.2.2.3 納米粒體外穩(wěn)定性 將制備好的EX-PLGA NPs用純化水分散，分別在0、24、48、72 h時測定其粒徑和多分散性指數(shù)（PDI），考察其體外穩(wěn)定性。

1.2.2.4 納米粒體外釋放 采用透析袋法評價EXPLGA NPs 在pH 6.8 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中的體外釋放行為［13］。稱取一定量的EX-PLGA NPs 分散于1 mL 水中，置入透析袋中。同時稱取與EXPLGA NPs 中艾塞那肽等量的艾塞那肽原料藥溶于1 mL 的水中，置于透析袋中作為對照。每組做3 個平行實驗，然后將透析袋完全浸入20 mL 的釋放介質(zhì)PBS 中，在37 ℃下恒溫振蕩（100 r/min）。在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、60、72 h 取樣，取出來的樣品過濾后取續(xù)濾液注入HPLC 測量釋放介質(zhì)中艾塞那肽的濃度，計算藥物累積釋放百分率。

1.2.3 艾塞那肽含量測定方法的建立 參考文獻［14］艾塞那肽的分析檢測方法，擬定如下HPLC 方法。流動相條件：pH 2.5 磷酸溶液-乙腈進行梯度洗脫；檢測波長：220 nm；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。梯度洗脫程序見表2。

表2 高效液相色譜法（HPLC）梯度洗脫程序

1.2.4 含量檢測方法的方法學(xué)驗證

1.2.4.1 專屬性 將輔料PLGA 和PVA 溶解配制成空白輔料溶液。以初始比例流動相溶液為空白溶液，分別取空白溶液、艾塞那肽溶液、PLGA 溶液和PVA 溶液的續(xù)濾液進樣，考察空白溶劑和輔料是否對艾塞那肽樣品峰有干擾，考察樣品峰理論塔板數(shù)，拖尾因子等指標。

1.2.4.2 溶液穩(wěn)定性 稱取艾塞那肽適量，用以初始流動相比例相當?shù)囊译妫?5%乙腈溶解配制成濃度為0.08 g/L 的艾塞那肽溶液，過濾后取續(xù)濾液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 各進樣1 次，記錄峰面積，對艾塞那肽溶液進行12 h的穩(wěn)定性考察。

1.2.4.3 標準曲線線性 以45%乙腈為溶劑，分別配制濃度為5、10、50、100、500 mg/L 的艾塞那肽溶液（n=2），取續(xù)濾液進樣記錄艾塞那肽峰面積，在此范圍內(nèi)考察其標準曲線線性。

1.2.4.4 回收率 配制3 份空白輔料溶液，每份取3個樣品（n=3）備用。艾塞那肽標示量濃度為0.08 g/L，空白輔料溶液中各加入相當于標示量的80%、100%和120%的艾塞那肽，取續(xù)濾液進樣記錄艾塞那肽峰面積，根據(jù)標準曲線線性計算艾塞那肽回收率。

1.2.4.5 精密度 稱取艾塞那肽原料藥適量，用45%乙腈溶解配制成濃度為0.08 g/L 的溶液，過濾取續(xù)濾液進樣，重復(fù)進樣6 次考察進樣精密度（n=6），隔天重復(fù)進樣考察中間精密度（n=12）。

1.2.4.6 定量限 稱取艾塞那肽原料藥適量，用45%乙腈逐級稀釋至信噪比為10左右時，溶液濃度確定為艾塞那肽的定量限。

1.2.5 艾塞那肽含量測定 測定方法：稱取艾塞那肽PLGA 納米粒適量，用10 mL 二氯甲烷充分溶解，用10 mL 純化水進行萃取，萃取5 次合并萃取液至100 mL容量瓶中，加入45 mL乙腈，加入純化水定容至刻度。配制成每1 毫升中約含0.08 mg 艾塞那肽的溶液，過濾后精密量取20 μL 續(xù)濾液注入液相色譜儀，記錄艾塞那肽色譜圖［15］。

另精密稱取艾塞那肽原料藥對照適量，用45%乙腈配制成每1 毫升中約含0.08 mg 艾塞那肽的溶液，同法精密量取20 μL 續(xù)濾液注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算艾塞那肽PLGA納米粒中艾塞那肽含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法計量數(shù)值以± s 表示，采用SPPS 18.0軟件進行多組間比較的單因素方差分析，采用Design-Expert 軟件中的BOX-Benhnken 組合設(shè)計法對制備工藝進行優(yōu)化。BBD 是響應(yīng)面優(yōu)化法中常用的試驗設(shè)計方法，可有效減少試驗次數(shù)，并可考察影響因素之間的交互作用，其優(yōu)化求解出的最優(yōu)工藝水平值不會超出最高值范圍。對實驗設(shè)計進行驗證時，P＜0.05 視為模型差異有統(tǒng)計學(xué)意義，擬合精度好可進行后續(xù)優(yōu)化；失擬誤差P＞0.05差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明在整個回歸區(qū)域內(nèi)擬合良好；相關(guān)性系數(shù)R2越大相關(guān)性越好；變異系數(shù)（CV）＜5%，表明實驗的可信度和精確度高［12］。

2 結(jié)果

2.1 BBD 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果實驗設(shè)計排列與包封率結(jié)果見表3，采用Design-Expert 軟件對表3中實驗數(shù)據(jù)進行二次多項式方程擬合，得到回歸方程：

包封率（%）=72.40-1.48A+2.18B+3.35C+1.55AB+0.90AC-0.75BC-10.10A2-9.00B2-9.80C2。

擬合方程的R2為0.995 2，該擬合模型具有高度顯著性（P＜0.05），該模型CV＝1.02%＜5%，校正系數(shù)R2Adj＝0.989 9，這說明預(yù)測的模型可以反映響應(yīng)值為98.99%的變化，說明本實驗設(shè)計的擬合程度良好，該擬合模型可以用于EX-PLGA NPs 的處方工藝優(yōu)化分析和預(yù)測［16］。通過表4 可知，影響包封率最大的是投料比，其次是乳化劑濃度，最不顯著的是超聲時間，投料比與超聲時間之間的交互影響最為顯著。

表4 方差分析結(jié)果

使用Design-Expert 軟件繪制A，B，C 三因素對指標包封率的三維響應(yīng)面圖，結(jié)果得到預(yù)測的最優(yōu)處方工藝為：初乳超聲時間為122 s，形成初乳中PVA 濃度為2.8%，PLGA 和艾塞那肽的投料比為14.9，預(yù)測包封率為72.40%。以最優(yōu)處方工藝條件制備3 批EX-PLGA NPs，測 得包封 率為（73.43±0.59）%，實際包封率值和預(yù)測值相比偏差不超過5%，說明優(yōu)化得到的最佳工藝處方條件可靠，預(yù)測性良好［16］。

2.2 納米粒的體外表征與釋放評價

2.2.1 粒徑和Zeta 電位 測得EX-PLGA NPs 粒徑為（157.2±3.1）nm，PDI 為0.164±0.008，粒徑分布如圖1所示，結(jié)果表明EX-PLGA NPs粒徑分布均一，分散性良好。測得EX-PLGA NPs 表面Zeta 電位為（-19.5±2.6）mV，表面電位絕對值較大，通過相互排斥作用有利于EX-PLGA NPs在溶液中的穩(wěn)定。

圖1 聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒的粒徑分布

2.2.2 艾塞那肽PLGA 納米粒形態(tài) EX-PLGA NPs透射電鏡圖顯示，制得的EX-PLGA NPs 呈球形，表面規(guī)則圓整，粒徑均一，分散性良好。

2.2.3 納米粒體外穩(wěn)定性 由EX-PLGA NPs 的體外穩(wěn)定性實驗結(jié)果可得，0、24、36、72 h 時EX-PLGA NPs 粒徑分別為（157.2±2.1）nm、（157.5±2.6）nm、（158.6±3.1）nm 和（159.7±3.2）nm（F=0.72，P=0.067），說明制備的EX-PLGA NPs穩(wěn)定性良好，無明顯團聚現(xiàn)象。

2.2.4 納米粒體外釋放評價 從釋放結(jié)果圖可以看出，在6 h 時，艾塞那肽原料藥累積釋放已經(jīng)高達95%，而EX-PLGA NPs 僅釋放34%，且EX-PLGA NPs 持續(xù)釋放至72 h 僅累積釋放71%，說明制備的EX-PLGA NPs具有緩釋效應(yīng)，見圖2。

圖2 聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒（EX-PLGA NPs）體外釋放

2.3 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.3.1 專屬性 考察空白溶劑和空白輔料對艾塞那肽出峰有無干擾，見圖3，空白溶劑無干擾，艾塞那肽峰與其他輔料峰分離良好，艾塞那肽峰理論塔板數(shù)11 693，拖尾因子1.017，峰形良好，專屬性強。

表3 BBD響應(yīng)面法的實驗設(shè)計與包封率結(jié)果

2.3.2 溶液穩(wěn)定性 由記錄的艾塞那肽峰面積值計算得12 h 內(nèi)峰面積的相對標準差（RSD）=0.69%，結(jié)果表明艾塞那肽溶液在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.3.3 標準曲線線性 以艾塞那肽濃度（X）為橫坐標，對應(yīng)艾塞那肽峰面積（Y）為縱坐標，艾塞那肽溶液標準曲線結(jié)果表明艾塞那肽溶液濃度在5～500 mg/L 范圍內(nèi)與對應(yīng)艾塞那肽峰面積呈線性關(guān)系，標準曲線方程為：Y=2 748.3X-11 330，相關(guān)性系數(shù)R2=0.999 9，得到曲線的線性良好。

2.3.4 回收率 根據(jù)艾塞那肽溶液線性標準曲線和回收率色譜圖峰面積值計算，得艾塞那肽回收率結(jié)果：80%、80%、80%、100%、100%、100%、120%、120%、120%回收率分別為99.25%、98.87%、99.58%、99.36%、98.49%、99.83%、98.92%、100.07%、99.51%，平均回收率（n=9）為99.32%，在98%～102%內(nèi)，回收率的RSD=0.50%，表明本方法準確度好。

2.3.5 精密度 重復(fù)6 次進樣精密度RSD 值為0.49%，中間精密度（n=12）RSD=0.95%，皆＜2%，結(jié)果表明本方法的重復(fù)性與重現(xiàn)性良好。

2.3.6 定量限 在此液相條件下艾塞那肽溶液的定量限為0.23 mg/L，信噪比為10.13，符合要求。

總結(jié)，該艾塞那肽液相分析方法經(jīng)過方法學(xué)驗證，專屬性強，線性范圍寬，準確性和重復(fù)性好，分析方法科學(xué)可靠，可以作為艾塞那肽納米粒中艾塞那肽含量測定方法［17］。

2.4 艾塞那肽含量測定測定以最優(yōu)處方工藝條件制備的3 批次EX-PLGA NPs 中艾塞那肽含量，并計算其載藥量和包封率結(jié)果如表5所示。

3 討論

3.1 EX-PLGA NPs的制備與處方工藝優(yōu)化報道中常見的PLGA 納米粒制備方法有：沉淀法，乳化法和乳化復(fù)乳法。本研究前期曾用這3種方法分別制備EX-PLGA NPs，沉淀法制備的EX-PLGA NPs 放置約2 h 后燒杯底部出現(xiàn)部分沉淀，納米粒溶液乳光消失；乳化法制備的EX-PLGA NPs 溶液呈乳白色且經(jīng)過檢測粒徑較大；乳化復(fù)乳法制備的EX-PLGA NPs 溶液呈淡黃色乳光，放置一段時間后觀察無沉淀且乳光依舊明顯，故本研究選用了乳化復(fù)乳法作為納米粒的制備方法。本研究前期使用了單因素法對各個處方工藝條件進行了優(yōu)化，考慮到初乳超聲時間，形成初乳中PVA 濃度，PLGA 和艾塞那肽的比例這3 個條件之間可能有交互作用，且優(yōu)化后的條件已接近最優(yōu)區(qū)域，故選用響應(yīng)面法優(yōu)化能快速找到最優(yōu)條件。

表5 3批次EX-PLGA NPs測定結(jié)果

3.2 艾塞那肽含量測定方法為了確定檢測波長，配制艾塞那肽溶液，PLGA 溶液和PVA 溶液，取續(xù)濾液注入色譜儀，開啟PAD 檢測器的全波長模式對各溶液進行全波長掃描。艾塞那肽溶液在190 nm 處有吸收峰，PLGA 溶液在245 nm 處有吸收峰，PVA 溶液在195 nm 處有吸收峰，經(jīng)過吸收峰的比較，考慮到檢測波長若太低會有很大的溶劑干擾峰，故其檢測波長定為220 nm。洗脫程序選擇了梯度洗脫是因為此前已使用等度洗脫進行了方法摸索，但艾塞那肽峰和鋪料峰不能良好分離且峰形不好，拖尾因子較大。用梯度洗脫的方法能將各峰良好分離且峰形良好。

圖3 空白溶劑、艾塞那肽、輔料聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）和輔料聚乙烯醇（PVA）色譜圖：A為空白溶劑；B為艾塞那肽；C為PLGA；D為PVA

3.3 小結(jié)本研究以優(yōu)化后工藝條件制備的EXPLGA NPs 粒徑分布均勻，載藥量和包封率高，穩(wěn)定性好，具有緩釋效果。建立了EX-PLGA NPs 中艾塞那肽含量的HPLC 分析方法，并完成了方法學(xué)驗證，該方法專屬性強，分析科學(xué)有效。本研究內(nèi)容可為艾塞那肽抗糖尿病口服緩釋制劑的開發(fā)提供研究和分析基礎(chǔ)。在本研究基礎(chǔ)上，下一步將對EXPLGA NPs在細胞水平及體內(nèi)藥效學(xué)進行探索，以證明EX-PLGA NPs口服治療糖尿病的有效性。