王麗娜

感染性休克（SS）是指病原菌及其毒素引起的以低血壓、代謝性酸中毒以及全身炎癥反應為特征的病理過程，給病人健康造成嚴重威脅［1］。在SS 發(fā)病過程中，肺是最早受累器官之一，數(shù)據(jù)顯示，約有50%病人伴有肺損傷，嚴重時可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征［2］。病原菌感染后釋放的毒性介質如脂多糖等可使免疫系統(tǒng)過度活化，產(chǎn)生大量的炎性因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6 等。這種破壞性的全身性炎癥反應是SS 肺損傷的主要病理過程，并有可能引起多器官功能障礙綜合征［3］。近年來研究顯示，丹紅注射液（DHI）除具有活血化瘀的功效之外，尚有良好的抗炎、肺保護作用［4］。2018 年4 月至2019 年8 月，本研究通過腹腔注射脂多糖建立大鼠SS 肺損傷模型，觀察DHI 對SS 大鼠肺損傷的保護作用，并初步探討其作用機制，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性SD 大鼠48 只，周齡范圍為6～8 周，體質量范圍為200～240 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2018-0024，實驗動物使用許可證號SCXK（冀）2017-0004，于25 ℃、55%相對濕度、12 h/12 h 光暗周期條件下飼養(yǎng)，自由進食水。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 主要試劑與儀器脂多糖（美國Sigma 公司），生理鹽水（山東華魯制藥有限公司），DHI（山東丹紅制藥有限公司），地塞米松（浙江仙居仙樂藥業(yè)有限公司），水合氯醛（上海信裕生物科技有限公司），核因子-κB（p65）［NF-κB（p65）］和κB 抑制因子α（IκBα）免疫組織化學染色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），TNF-α、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。BL-420 生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），恒溫烤箱，倒置顯微鏡（Olympus 公司），全自動酶標免疫分析儀（Biotex公司）。

1.3 大鼠模型制備及分組將所有48 只大鼠于實驗室環(huán)境下給予適應性喂養(yǎng)后，采用隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組、DHI 干預組和陽性對照組，12只/組。大鼠SS 模型建立方式［5］：腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，暴露右頸總動脈，插管連接生物機能系統(tǒng)（BL-420）以監(jiān)測血壓。待血壓穩(wěn)定后，模型組、DHI干預組和陽性對照組經(jīng)腹腔注射脂多糖15 mg/kg，觀察大鼠動脈壓直至大鼠達到休克狀態(tài)（動脈壓降低至基礎血壓2/3 以下時，脈壓小于20 mmHg 為判斷大鼠休克的指標），對照組給予等量的生理鹽水。大鼠SS 模型造模成功后，DHI 干預組立即經(jīng)腹腔注射DHI 2 mL/kg，陽性對照組經(jīng)腹腔注射1 mL/kg 地塞米松，模型組和對照組大鼠均予以等體積生理鹽水。

1.4 樣本采集及處理給藥24 h后，以10%水合氯醛5 mL/kg 腹腔注射將大鼠麻醉后固定，放血處死后嚴格無菌開胸取肺組織，留取右上肺組織，用生理鹽水沖洗表面血液并吸取表面水分，放入10%甲醛固定液中，常規(guī)包埋、切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色后鏡檢及讀片，取左肺組織置于-80 ℃超低溫冰箱凍存待檢。

1.5 大鼠肺濕/干質量測定取各時間點處死的大鼠肺組織，稱量其濕質量（W）后，置烤箱中于70 ℃條件下烘烤24 h 至恒重，稱量并記錄干質量（D），計算肺組織濕干質量比（W/D）。

1.6 大鼠肺組織TNF-α、IL-6檢測制備肺組織勻漿，離心后取上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測肺組織中TNF-α、IL-6 含量水平，操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.7 免疫組織化學法檢測肺組織NF-κB 及IκB-α蛋白表達病變組織以石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片至過膠玻片上，56 ℃條件下烤片2 h，使用二甲苯連續(xù)脫蠟3次，梯度乙醇脫二甲苯，水洗。采用免疫組織化學SABC 法染色。采用3%過氧化氫孵育5 min后，加入5%山羊血清孵育20 min，甩去多余液體，加入適當稀釋的兔抗鼠NF-κB（p65）多克隆抗體4 ℃下孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗后滴加羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗，37 ℃下孵育20 min，PBS沖洗后滴加SABC，37 ℃下孵育30 min。采用DAB 顯色，控制顯色時間，蘇木素輕度復染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察染色結果。IκB-α 染色步驟同NF-κB，所用一抗為兔抗鼠IκB-α 多克隆抗體。400 倍鏡下每張切片隨機選取5 個視野，利用Motic Images Advanced 3.2 圖像采集系統(tǒng)分析每個視野陽性細胞百分比，陽性細胞的百分比表示陽性染色面積占被測量面積的比值，最后取5 個視野均值作為測量值。

1.8 統(tǒng)計學方法使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，以±s 表示計量資料，多組間比較使用單因素方差分析，多組間的兩兩比較使用SNK 法；計數(shù)資料采用率表示，行χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠行為表現(xiàn)對照組神態(tài)正常，皮毛順滑有光澤，進食正常；模型組腹腔注射脂多糖后，大鼠逐步出現(xiàn)活動減少，神態(tài)倦怠，皮毛雜亂無光，進食開始減少，反應力下降，且上述癥狀有加重趨勢，表現(xiàn)為躁動、寒顫、腹瀉等；DHI 干預組和陽性對照組在注射脂多糖初若干小時內(nèi)與模型組具有類似的表現(xiàn)，在給予DHI 和地塞米松干預后實驗大鼠活動增多，躁動、寒顫等癥有所減輕。觀察期內(nèi)對照組大鼠無一死亡，DHI 干預組和陽性對照組大鼠死亡率分別為8.33%（1/12），8.33%（1/12），顯著低于模型組的58.33%（7/12）（χ2=10.67，P=0.005）。

2.2 大鼠肺組織病理形態(tài)觀察HE 染色下可見對照組大鼠肺組織結構清晰，肺泡及間質無明顯充血、滲出及炎癥細胞浸潤，具有完整的肺泡壁。而模型組鏡下可見肺泡壁破壞嚴重，肺泡隔增厚，肺間質及肺泡腔嚴重水腫、滲出及出血，大量粒細胞浸潤及透明膜形成。DHI 干預組肺泡壁多數(shù)完整，肺泡隔較模型組明顯縮窄，腔內(nèi)僅見少許出血、滲出及炎癥細胞浸潤。陽性對照組可見肺泡壁多數(shù)完整，肺泡隔較模型組明顯縮窄，腔內(nèi)幾乎無出血、滲出及炎癥細胞浸潤。見圖1A。

圖1 各組大鼠肺組織染色圖：A為病理變化（蘇木精-伊紅染色×200）；B為NF-κB（p65）、IκB-α蛋白表達（免疫組織化學染色×200）

2.3 大鼠肺組織W/D 變化對照組、模型組、DHI干預組、陽性對照組大鼠肺組織W/D 分別為4.02±0.37、5.56±0.51、4.72±0.44、4.45±0.46（F=15.72，P＜0.001）；與對照組相比，模型組大鼠肺組織W/D顯著增加（P＜0.05），DHI 干預組較模型組降低（P＜0.05），陽性對照組與DHI 干預組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6檢測與對照組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-6 含量升高（P＜0.05），DHI干預組TNF-α、IL-6含量較模型組均下調(diào)（P＜0.05），陽性對照組TNF-α、IL-6 水平與DHI 干預組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.5 各組大鼠肺組織細胞中NF-κB 及IκB-α 蛋白表達對照組肺組織NF-κB（p65）、IκB-α 表達呈弱陽性免疫反應，陽性產(chǎn)物均多分布于氣管黏膜上皮細胞細胞質，NF-κB（p65）在細胞核中極少見或沒有，IκB-α 細胞核中未見。各組NF-κB（p65）、IκB-α陽性細胞百分比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組NF-κB（p65）、IκB-α呈強陽性免疫反應，均主要分布于氣管黏膜上皮細胞、浸潤炎癥細胞和血管內(nèi)皮細胞，NF-κB（p65）在細胞質和細胞核均可見，可見明顯的細胞核易位，IκB-α 見于細胞質內(nèi)，陽性細胞百分比均升高（P＜0.05）。給予DHI干預后，與模型組比較，肺組織NF-κB（p65）、IκB-α陽性反應均明顯減弱，陽性細胞百分比均下降（P＜0.05）。陽性對照組與模型組比較，NF-κB（p65）、IκB-α 均呈弱陽性免疫反應，陽性細胞百分比均降低（P＜0.05）；與DHI 干預組比較，NF-κB（p65）、IκBα 陽性細胞百分比均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1B，表2。

表1 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6水平比較/± s

表1 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-6水平比較/± s

注：TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，IL-6 為白細胞介素-6，DHI 為丹紅注射液。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組DHI干預組陽性對照組F值P值鼠數(shù)12 5 11 11 TNF-α/（μg/g）0.23±0.06 0.66±0.08①0.41±0.06②0.38±0.07②52.18＜0.001 IL-6/（ng/g）38.17±6.82 128.04±10.35①66.38±6.20②60.54±5.27②209.02＜0.001

表2 各組大鼠肺組織NF-κB（p65）、IκB-α陽性細胞百分比比較/（%，± s）

表2 各組大鼠肺組織NF-κB（p65）、IκB-α陽性細胞百分比比較/（%，± s）

注：NF-κB（p65）為核因子-κB（P65），IκB-α 為κB 抑制因子α，DHI為丹紅注射液。①與對照組比較，P＜0.05。②與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組DHI干預組陽性對照組F值P值鼠數(shù)12 5 11 11 NF-κB（p65）陽性細胞1.92±0.26 7.79±0.71①3.96±0.40②3.90±0.44②226.82＜0.001 IκB-α陽性細胞1.87±0.22 6.96±0.81①3.01±0.38②2.95±0.35②186.03＜0.001

3 討論

SS 亦被稱為膿毒癥休克，是臨床導致肺損傷最常見的病因之一，約占肺損傷發(fā)病原因的40%左右。因此本研究采用常用的腹腔注射脂多糖的方法建立脂多糖導致SS 的大鼠模型，模擬臨床SS 肺損傷的發(fā)生，觀察DHI對SS肺損傷大鼠的治療作用并探討其作用機制。地塞米松作為臨床上常用的治療SS肺損傷的藥物之一，因此本研究選用地塞米松作為陽性對照藥物。本研究中，采用腹腔注射15 mg/kg脂多糖建立大鼠SS肺損傷模型。實驗中觀察到大鼠注射脂多糖后出現(xiàn)一系列SS 癥狀，如躁動、寒顫、腹瀉等表現(xiàn)，同時平均動脈壓降至基礎壓2/3以下，與文獻［6-7］報道相一致。肺組織HE 染色結果顯示，對照組肺組織結構清晰，模型組HE 染色中，肺泡壁破壞，炎癥細胞浸潤等符合SS 肺損傷病理表現(xiàn)。另外，模型組肺組織W/D 較對照組明顯增加，表明注射脂多糖后大鼠有明顯肺水腫表現(xiàn)，結合上述幾點可見本研究大鼠SS 肺損傷模型構建是成功的。

眾多研究顯示，SS 病程中免疫系統(tǒng)激活引起大量的炎性因子釋放，炎性介質進一步引起肺毛細血管通透性增加并造成肺損傷［8-9］。本研究中，DHI 可以明顯下調(diào)TNF-α、IL-6 水平，減輕肺組織水腫，改善肺組織炎癥細胞浸潤狀態(tài)，且作用與地塞米松相當。TNF-α 主要由巨噬細胞和T 淋巴細胞產(chǎn)生，參與肺組織損傷的炎癥反應過程［10］。IL-6是一種主要由單核一巨噬細胞分泌的炎性因子，可促進多種炎性因子的生成。李燕等［11］的研究顯示，TNF-α、IL-6等炎癥細胞因子水平在脂多糖所致的小鼠急性肺損傷模型中明顯升高，其變化與疾病進展明顯相關，這提示DHI 可能通過抑制炎癥細胞因子表達發(fā)揮保護肺損傷作用。

NF-κB 是一種重要的細胞轉錄因子，在免疫炎癥相關信號通路中居于核心地位［12］。正常生理狀態(tài)下，NF-κB 與IκB 結合，以非活性形式存在于細胞質中，在外源性配體刺激下，IκB-α 先后被磷酸化和泛素化，導致其構象發(fā)生改變并被降解，NF-κB 與IκB 解離后進入細胞核與靶序列結合，促進TNF-α、IL-6 等炎性因子的表達，參與肺損傷病理過程［13-14］。本研究中，免疫組織化學染色結果顯示，DHI可以明顯下調(diào)SS 大鼠NF-κB（p65）、IκB-α 的表達。宋麗娟等［15］的研究顯示，羥基紅花黃色素A 不同劑量組可以不同程度抑制脂多糖致急性肺損傷小鼠NF-κB的激活和NF-κB（p65）核轉位，并抑制早期炎性相關因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的大量釋放，其中羥基紅花黃色素A是DHI中紅花藥理功效的最有效水溶性成分。提示DHI 可能通過抑制SS 大鼠肺組織NFκB 活化，減少TNF-α、IL-6 等促炎細胞因子表達而發(fā)揮保護肺損傷作用。

綜上所述，在大鼠脂多糖致SS 肺損傷模型中，DHI 可能通過抑制大鼠肺組織NF-κB 活化，減少TNF-α、IL-6 等促炎細胞因子表達而發(fā)揮保護肺損傷作用。

（本文圖1見插圖9-1）