江端，劉奧杰，凌偉

膿毒癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)，并產(chǎn)生危及生命的器官功能損傷［1］。膿毒癥的發(fā)病因素較多，研究發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌（G-）為主要致病菌，可能與G-中大量的內(nèi)毒素有關(guān)，內(nèi)毒素可激活Toll 樣受體-4放大炎癥信號(hào)，導(dǎo)致臟器損傷［2-3］。據(jù)報(bào)道，絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MEK/ERK）信號(hào)通路在膿毒癥所致的急性肺損傷中有重要作用［4］。姜黃素是姜黃屬植物塊莖中的活性成分，具有抗炎、抗氧化、降血脂、降壓、抗菌、解酒護(hù)肝、抗腫瘤等藥理活性［5-6］。近幾年，對(duì)于姜黃素的抗炎作用研究較多，研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過(guò)降低膿毒癥大鼠炎癥水平，保護(hù)其肝組織［7］。但姜黃素是否能通過(guò)MEK/ERK 信號(hào)通路減輕膿毒癥大鼠肺損傷尚不清楚，本研究于2018 年8 月至2019 年4月，采用SD 大鼠體外構(gòu)建膿毒癥動(dòng)物模型，擬觀察姜黃素對(duì)膿毒癥引起肺損傷的保護(hù)作用，并初步探究其分子機(jī)制，為膿毒癥的防治提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 膿毒癥大鼠模型的建立雄性、健康SD 大鼠75 只購(gòu)自南京君科生物工程有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2019-0112，使用許可證號(hào)SYXK（鄂）2018-0005；3 月齡，體質(zhì)量（200±20）g，SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)條件：溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，每12小時(shí)光照黑暗交替，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)［8］構(gòu)建膿毒癥大鼠模型，術(shù)后出現(xiàn)豎毛、乏力、眼眶有黏膜、顫抖等，并通過(guò)抽簽隨機(jī)選取2只造模大鼠病理檢測(cè)顯示肺組織明顯損傷，提示建模成功［9］。假手術(shù)組僅開腹取出盲腸再原位放回，不作結(jié)扎、穿孔處理。各組大鼠術(shù)后均進(jìn)行抗休克（腹腔注射40 mL/kg 乳酸鈉林格液）、抗感染（抗生素）處理，并注意保暖。

1.2 分組與干預(yù)75只雄性SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為五組：假手術(shù)組（對(duì)照），膿毒癥組，姜黃素低、中、高劑量組，每組15只。姜黃素低、中、高劑量組分別于膿毒癥造模術(shù)后24 h 腹腔注射劑量為50、100、200 mg/kg 的姜黃素（上海恒斐生物科技有限公司，純度≥98%，規(guī)格20 mg）［10］；假手術(shù)組和膿毒癥組大鼠以等量生理鹽水替代。觀察期間膿毒癥組，姜黃素低、中、高劑量組分別有5、2、3、1 只大鼠死亡，假手術(shù)組無(wú)大鼠死亡，另行造模補(bǔ)齊。

1.3 肺損傷的評(píng)價(jià)

1.3.1 蘇木精-伊紅（HE）染色 干預(yù)結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠并處死，取肺組織，固定于10%甲醛中，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片后，HE（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）染色，最后中性樹脂封片，顯微鏡（德國(guó)萊卡公司）下觀察其肺組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2 肺組織濕干比 按上述方法取肺組織，用濾紙拭去表面血液，稱重即為濕重；再置于烘箱中烘烤72 h至恒重，稱重即為干重，濕干比=濕重/干重。

1.3.3 支氣管灌洗液中總蛋白和白蛋白含量 參照上述方法取肺組織，用生理鹽水灌洗肺組織3次，收集支氣管灌洗液，以2 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清檢測(cè)總蛋白含量，采用BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Thermo公司）檢測(cè)總蛋白的含量。

1.3.4 髓過(guò)氧化物酶（MPO）活性 參照上述方法取肺組織，冰上勻漿，以2 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清，采用MPO 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)MPO的含量。

1.4 肺組織細(xì)胞凋亡的檢測(cè)采用TUNEL 檢測(cè)測(cè)定肺組織細(xì)胞凋亡情況，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，參照上述方法制備肺組織切片，經(jīng)脫蠟、水化、固定后，添加蛋白酶K 通透組織細(xì)胞，室溫下孵育15 min；再次固定后，加入平衡液，濕盒反應(yīng)10 min；加入TUNEL 反應(yīng)混合液，暗濕盒37 ℃下反應(yīng)1 h；滴加檸檬酸鈉緩沖液終止，反應(yīng)15 min；浸入過(guò)氧化氫封閉15 min；加入鏈霉親和素標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶，孵育30 min；進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木精復(fù)染；梯度脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片；顯微鏡下觀察肺組織中凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)（正常肺組織細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞呈棕色），計(jì)算凋亡指數(shù)（凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.5 肺組織中白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10 及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量的檢測(cè)參照上述方法制備肺組織勻漿液，參照酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海群己生物科技有限公司）說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，檢測(cè)肺組織中IL-6、IL-10及TNF-α的含量。

1.6 肺組織中活化胱天蛋白酶（cleaved-caspase）-3、caspase-9、MEK 及ERK 水平的檢測(cè)采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肺組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平，參照上述方法制備肺組織勻漿液，添加裂解液提取總蛋白，經(jīng)二喹啉甲酸法（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。上樣量為30～50 μg，配制10%濃縮膠和5%分離膠，進(jìn)行凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜后，進(jìn)行免疫反應(yīng)，最后暗室中顯影、定影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達(dá)為內(nèi)參，計(jì)算cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、磷酸化p）-MEK、MEK、p-ERK 及ERK 的相對(duì)表達(dá)量，蛋白一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布以xˉ±s表示，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織形態(tài)的影響HE染色顯示，假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整，間隔均勻；膿毒癥組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)明顯擴(kuò)張，間隔增大，肺泡壁增厚，并有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫；姜黃素低、中、高劑量組較假手術(shù)組仍有明顯的病理改變，但較膿毒癥組肺組織損傷明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象明顯較少。見圖1。

圖1 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織形態(tài)的影響（蘇木精-伊紅染色×200）

2.2 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺損傷指標(biāo)的影響與假手術(shù)組相比，膿毒癥組大鼠肺組織濕干比、MPO含量及肺泡灌洗液中總蛋白量顯著上升（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，姜黃素低、中、高劑量組肺組織濕干比、MPO 含量及肺泡灌洗液中總蛋白量顯著下降（P＜0.05），具有濃度依賴性。見表1。

2.3 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響膿毒癥組大鼠肺組織凋亡指數(shù)、cleaved-caspase-3及cleaved-caspase-9 水平較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）；姜黃素低、中、高劑量組凋亡指數(shù)、cleavedcaspase-3 及cleaved-caspase-9 水平較膿毒癥組明顯降低（P＜0.05），具有濃度依賴性。見圖2，表2。

2.4 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織炎性因子水平的影響膿毒癥組大鼠肺組織IL-6、IL-10 及TNF-α 水平較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，姜黃素低、中、高劑量組肺組織IL-6、IL-10 及TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），具有濃度依賴性。見表3。

圖2 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織中凋亡相關(guān)蛋白的影響

表2 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/± s

表2 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/± s

注：cleaved-caspase為活化胱天蛋白酶。①與假手術(shù)組相比，P＜0.05。②與膿毒癥相比，P＜0.05。③與姜黃素低劑量組相比，P＜0.05。④與姜黃素中劑量組相比，P＜0.05。

組別假手術(shù)組膿毒癥組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組F值P值鼠數(shù)1 5 15 15 15 15細(xì)胞凋亡率/%3.86±0.67 19.41±2.58①16.27±2.14②12.36±1.62②③8.59±1.26②③④59.41＜0.001 cleaved-caspase-3 0.13±0.05 0.58±0.13①0.45±0.14②0.33±0.12②③0.21±0.11②③④177.87＜0.001 cleaved-caspase-9 0.24±0.06 0.93±0.15①0.72±0.12②0.58±0.13②③0.39±0.10②③④81.64＜0.001

2.5 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織MEK/ERK 信號(hào)通路的影響與假手術(shù)組相比，膿毒癥組大鼠肺組織p-MEK/MEK 和p-ERK/ERK 水平明顯升高（P＜0.05）；與膿毒癥組相比，姜黃素低、中、高劑量組肺組織中p-MEK/MEK 和p-ERK/ERK 水平明顯降低（P＜0.05），具有劑量依賴性。見圖3，表4。

3 討論

急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征是膿毒癥最常見的并發(fā)癥，而急性肺損傷是全身性炎癥反應(yīng)在肺部的表現(xiàn)，主要是炎癥細(xì)胞及因子的激活，誘發(fā)了一系列肺毛細(xì)血管和肺泡上皮細(xì)胞的損傷，改變毛細(xì)血管基底膜通透性，肺血屏障功能出現(xiàn)障礙后，大量富含有蛋白質(zhì)的液體進(jìn)入肺泡或肺間質(zhì)，導(dǎo)致肺水腫［11-12］。MPO 主要是中性粒細(xì)胞分泌的血紅蛋白，外界刺激激活中性粒細(xì)胞后，會(huì)釋放MPO參與宿主反應(yīng)，其高表達(dá)提示血管損傷嚴(yán)重［13］。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可以改善膿毒癥大鼠肺損傷，采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)構(gòu)建膿毒癥大鼠模型后，膿毒癥組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)明顯擴(kuò)張，間隔增大，肺泡壁增厚，并有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫，肺組織濕干比、MPO 含量及肺泡灌洗液中總蛋白量顯著上升，提示膿毒癥大鼠出現(xiàn)明顯的肺損傷：肺水腫、肺毛細(xì)血管損及肺高滲透性，與Zolali 等［14］研究相似，而姜黃素可明顯減輕大鼠肺水腫和肺高滲透性，保護(hù)其肺組織。

表1 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺損傷指標(biāo)的影響/xˉ± s

表3 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織炎性因子水平的影響/± s

表3 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織炎性因子水平的影響/± s

注：IL為白細(xì)胞介素，TNF-α為腫瘤壞死因子-α。①與假手術(shù)組相比，P＜0.05。②與膿毒癥相比，P＜0.05。③與姜黃素低劑量組相比，P＜0.05。④與姜黃素中劑量組相比，P＜0.05。

組別假手術(shù)組膿毒癥組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組F值P值鼠數(shù)15 15 15 15 15 IL-6/（ng/L）72.46±17.62 224.16±35.21①174.73±26.43②132.85±22.18②③101.74±16.52②③④89.34＜0.001 IL-10/（ng/L）6.25±1.49 27.63±5.81①23.57±4.42②17.34±3.19②③12.78±2.27②③④76.31＜0.001 TNF-α/（μg/L）2.15±0.46 7.54±1.34①5.72±1.02②4.28±0.91②③3.07±0.73②③④77.97＜0.001

圖3 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織MEK/ERK信號(hào)通路的影響

表4 姜黃素對(duì)膿毒癥大鼠肺組織p-MEK/MEK、p-ERK/ERK水平的影響/± s

注：p-MEK/MEK 為磷酸化絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶與絲裂原細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶比值，p-ERK/ERK 為磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶與胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶比值。①與假手術(shù)組相比，P＜0.05。②與膿毒癥相比，P＜0.05。③與姜黃素低劑量組相比，P＜0.05。④與姜黃素中劑量組相比，P＜0.05。

組別假手術(shù)組膿毒癥組姜黃素低劑量組姜黃素中劑量組姜黃素高劑量組F值P值鼠數(shù)15 15 15 15 15 p-MEK/MEK 0.48±0.07 1.25±0.14①1.08±0.13②0.81±0.15②③0.62±0.12②③④96.81＜0.001 p-ERK/ERK 0.52±0.09 1.34±0.15①1.16±0.14②0.97±0.13②③0.75±0.11②③④99.78＜0.001

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理后，膿毒癥大鼠肺組織中MEK、ERK 的磷酸化水平顯著下降，提示姜黃素可能通過(guò)下調(diào)MEK/ERK 信號(hào)通路，改善膿毒癥大鼠肺損傷。促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）家族是體內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，幾乎參與所有細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，MEK/ERK 是MAPK 家族的重要成員，與細(xì)胞凋亡、增殖、分化、炎癥反應(yīng)等過(guò)程密切相關(guān)［15-16］。但研究發(fā)現(xiàn)，根據(jù)不同的刺激信號(hào)，MEK/ERK 通路對(duì)細(xì)胞凋亡會(huì)有不同的作用；腫瘤細(xì)胞中MEK/ERK 激活具有抗凋亡的作用［17］，而急性炎癥中MEK/ERK 則有促凋亡作用，如膿毒癥等［18］。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑，其中caspase-3 和caspase-9 是關(guān)鍵蛋白分子［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以顯著下調(diào)成熟caspase-3和caspase-9水平，抑制膿毒癥大鼠肺組織細(xì)胞的凋亡。臨床研究證實(shí)，IL-6、IL-10 及TNF-α 在感染性疾病中有良好的診斷作用［20］。本研究結(jié)果顯示，姜黃素可顯著降低膿毒癥大鼠肺組織中IL-6、IL-10 及TNF-α 水平，提示姜黃素可有效改善膿毒癥大鼠炎癥水平，并緩解其免疫抑制，而減輕肺組織損傷。

綜上所述，姜黃素能夠改善膿毒癥大鼠肺組織病理?yè)p傷，減少肺組織細(xì)胞的凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，下調(diào)MEK/ERK 信號(hào)通路而保護(hù)肺損傷。但其抑制MEK/ERK通路具體的分子通路還需要深入研究，為姜黃素的臨床應(yīng)用提供理論支持。

（本文圖1見插圖9-1）