邵慧鑫 任憲云, 于振興 李 健, 劉 萍,

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心, 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室, 青島 266237)

日本對蝦(Marsupenaeus japonicus)俗稱車蝦、斑節(jié)蝦、花蝦, 隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、對蝦科(Penaeidae)、囊對蝦屬(Marsupenaeus), 在中國沿海地區(qū)廣泛分布[1], 其中, 福建、臺灣和廣東沿海地區(qū)資源豐富[2]。日本對蝦屬亞熱帶物種, 適宜生存溫度為25—29℃, 水溫高于32℃時生長受到限制,8—10℃時攝食減少, 5℃以下開始死亡[3]。北方池塘一般一年兩季養(yǎng)殖日本對蝦, 第 1 季4月底投放蝦苗, 在 7 月中下旬收獲; 第 2 季在6月底投放蝦苗, 在 11 月初收獲, 養(yǎng)殖周期為6個月, 低溫成為影響日本對蝦養(yǎng)殖周期的重要因素。

內(nèi)源性細(xì)胞凋亡(Intrinsic apoptotic) 又被稱為細(xì)胞凋亡的線粒體途徑, 通常由細(xì)胞毒性刺激物或環(huán)境脅迫因子等刺激激活[4]。在哺乳動物體內(nèi),Bcl-2 家族 (B-cell lymphoma 2 family) 在內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路中發(fā)揮著重要的作用, 其調(diào)控線粒體外膜通透性 (Mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP) 的上升, 導(dǎo)致一系列的線粒體蛋白(例如細(xì)胞色素 C、Endo G、SMAC/Diablo 和 AIF等) 向細(xì)胞質(zhì)中釋放[5,6], 細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素 C 在ATP的幫助下和凋亡酶激活因子 1 (Apoptotic proease activating factor 1, Apaf-1) 結(jié)合, 形成多聚體, 該多聚體與 Caspase-9 前體結(jié)合形成凋亡復(fù)合體 (Apoptosome), 進而激活 Caspase-9[7], 被激活的 Caspase-9 通過自我剪切活化過程, 在 dATP和ATP 的幫助下成功激活 Caspase-3, 從而導(dǎo)致內(nèi)源性凋亡通路被激活[8]。

Bcl-2 家族由凋亡調(diào)節(jié)因子 Bcl-X 及其同系物組成[9], 目前已發(fā)現(xiàn)25 個成員[10]。Bcl-2 家族的顯著特征是具有BCL同源結(jié)構(gòu)域[11]。Bcl-2 家族基因根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為兩類: 一類為抑凋亡基因(例如Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-W), 另一類為促凋亡基因(例如Bax、Bok、Bad和Bid)[12]。Bcl-2 家族抑凋亡基因和促凋亡基因的表達(dá)平衡是細(xì)胞發(fā)生正常凋亡現(xiàn)象最重要的原因[13]。Guo等[14]發(fā)現(xiàn)刺參(Apostichopus japonicus)Bcl-2基因通過阻止體腔細(xì)胞中細(xì)胞色素C的釋放來抑制細(xì)胞凋亡, 從而介導(dǎo)海參中的病菌感染。Cao等[15]研究表明慢性氟暴露下, Bcl-2 家族基因參與鯉(Cyprinus carpio) 肝臟的免疫應(yīng)答過程。Xue等[16]研究稱氨脅迫下鯉肝胰腺的凋亡可能是由氧化應(yīng)激通過p53-Bax/Bcl-2凋亡信號通路介導(dǎo)的。大量研究表明, Bcl-2 家族基因?qū)S持水生動物機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。而在甲殼動物中, 對于Bcl-2 家族基因的研究較少。因此, 探究日本對蝦凋亡通路相關(guān)基因很有必要。

本實驗以線粒體凋亡通路中的Bcl-2基因作為研究對象, 通過探究凋亡通路上的相關(guān)基因在低溫脅迫環(huán)境條件下的表達(dá)規(guī)律及其產(chǎn)物間的相互作用, 進而闡述其主要功能, 為培育日本對蝦耐低溫新品種, 推動產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用健康日本對蝦[體重: (14.24±1.12 g)]取自山東省昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司。對蝦在200 L的PVC桶中經(jīng)7d適應(yīng)性暫養(yǎng), 暫養(yǎng)水溫28℃、鹽度28、pH 8.0。暫養(yǎng)期間持續(xù)充氧, 每天早晚定時投喂2次并更換1/3的海水, 以保持水質(zhì)良好。

1.2 日本對蝦Bcl-2基因cDNA全長的克隆

從日本對蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫里查找、篩選得到Bcl-2基因的序列, 使用Primer Premier5.0設(shè)計引物(表 1)。利用巢氏PCR擴增法對Bcl-2基因進行克隆。將獲得的 PCR 產(chǎn)物切膠回收、載體連接并轉(zhuǎn)化、菌落 PCR鑒定、送樣測序。

表1 本實驗所用引物序列Tab. 1 Primers used in this study

1.3 日本對蝦Bcl-2基因的生物信息學(xué)分析

對日本對蝦Bcl-2基因進行序列分析(表 2)。

表2 生物信息學(xué)所用網(wǎng)址及軟件Tab. 2 URLs and software for bioinformatics analysis

1.4 低溫脅迫

本實驗設(shè)置4個溫度梯度: 10℃、16℃、22℃和28℃。降溫實驗在200 mm×300 mm×170 mm的水族缸中進行, 水體體積為9 L。使用冷凝機(GRTEHXB10N, 格瑞特節(jié)能設(shè)備有限公司)調(diào)節(jié)水溫, 各個溫度組經(jīng)過12h, 由28℃同時降至所設(shè)置的溫度,每組3個平行, 每個平行20尾蝦。在低溫脅迫前(0)和低溫脅迫 3h、24h和72h后取日本對蝦的鰓和肝胰腺置于液氮中速凍, 用于基因的表達(dá)分析。

1.5 siRNA干擾

本實驗所用到的siRNA均由上海生工用化學(xué)方法進行合成, 為確保合成siRNA具有較好的干擾效果, 用Bcl-2基因設(shè)計合成3對siRNA, 設(shè)計的雙鏈siRNA有以下特征: 正向鏈 21堿基是在19個堿基的靶序列加上3′端2懸頭TT的堿基; 反向鏈21堿基是19個與正向鏈互補的堿基, 3′端加2個堿基的懸頭TT。合成的RNA oligo劑型為凍干粉。

本研究在siRNA干擾后在10℃ 和28℃兩個溫度梯度中進行溫度實驗, 每個溫度梯度分為兩組,分別為RNAi組和NC處理組。將日本對蝦按量均勻分組, 在對蝦的第四尾節(jié)處按照1 μg/g蝦的量進行siRNA的注射, 對照組注射NC陰性對照(無意義的雙鏈) , 分別在脅迫后的3h、12h和48h(取48h時要在24h再注射一次) 取9尾日本對蝦鰓組織并編號保存于液氮中用于RNA提取。

1.6 日本對蝦Bcl-2基因的表達(dá)分析

參照TransZolUp Plus RNA Kit試劑盒(全式金公司)說明書提取總RNA, 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用Evo M-MLVRT Mix Kit (艾科瑞公司)進行模板制備, 具體步驟參照說明書, 反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于日本對蝦Bcl-2基因的表達(dá)特征分析。本實驗通過實時熒光定量PCR對Bcl-2基因進行組織表達(dá)分析, 檢測不同溫度、不同時間下的日本對蝦鰓和肝胰腺中Bcl-2基因的表達(dá)量, 實驗所用引物見表 1。實時熒光定量PCR通過使用Applied BiosystemsTM7500 Real Time PCR instrumen定量儀完成。具體實驗步驟參照SYBR?GreenPro TaqHS 預(yù)混型qPCR試劑盒Ⅱ(艾科瑞公司)。反應(yīng)完成后, 采用 Excel[17]進行統(tǒng)計, 并用2???Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量, 使用SPSS 19.0 軟件進行差異顯著性分析,P<0.05 表示差異顯著。

1.7 TUNEL檢測

本實驗所用TUNEL試劑盒購自羅氏公司, 具體方法參照試劑盒說明書。實驗步驟如圖 1所示。

2 結(jié)果

2.1 Bcl-2基因的cDNA全長及序列同源性分析

實驗獲得的日本對蝦Bcl-2基因(GenBank登錄號MW000345) cDNA全長為2432 bp, 其中ORF為726 bp, 共編碼241個氨基酸, 5′UTR長度為269 bp,3′UTR長度為1437 bp, 并且含有典型的加尾信號aataaa。3′UTR包含一個30 bp的polyA序列。預(yù)測理論等電點為5.90, 分子量為26.80 kD, 且不穩(wěn)定系數(shù)為63.87, 推測為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。SMART和Signal4.1 在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示,MjBcl-2基因具有Bcl-2基因家族的典型特征, 即存在BCL 結(jié)構(gòu)域, 并且在 C 端有一個跨膜結(jié)構(gòu)域。Blast在線軟件比對結(jié)果顯示, 日本對蝦Bcl-2氨基酸序列與凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei) 的同源性最高為76%。使用MEGA 6.0 軟件對日本對蝦Bcl-2基因進行系統(tǒng)進化分析(圖 1), 與凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦 (Penaeus monodon) 聚為一支, 親緣關(guān)系較近, 而與其他脊椎動物等進化關(guān)系較遠(yuǎn)(圖 2)。

圖1 TUNEL檢測實驗步驟Fig. 1 TUNEL test steps

圖2 日本對蝦Bcl-2氨基酸序列 NJ 系統(tǒng)進化樹Fig. 2 NJ Phylogenetic tree of Bcl-2 amino acid sequence of M. japonicus

2.2 日本對蝦Bcl-2基因的組織表達(dá)分析

對日本對蝦眼柄、鰓、肌肉、肝胰腺、心臟、胃、腸和血細(xì)胞組織, 進行Bcl-2基因的熒光定量檢測, 結(jié)果表明,Bcl-2基因在所檢測8個組織中均有不同水平的表達(dá), 其中在肌肉中表達(dá)量最高, 然后依次是鰓、眼柄、肝胰腺、腸、胃、血細(xì)胞和心臟中表達(dá)量最低。

2.3 日本對蝦Bcl-2基因在低溫脅迫下的表達(dá)分析

日本對蝦在低溫脅迫后Bcl-2基因表達(dá)情況如圖 3所示, 不同溫度脅迫后,Bcl-2基因的表達(dá)發(fā)生了明顯變化。在10℃和16℃脅迫下, 鰓和肝胰腺中的Bcl-2基因的表達(dá)水平呈上升趨勢, 72h時到達(dá)峰值, 在各時間點均顯著高于對照組(P<0.05); 22℃脅迫下Bcl-2基因表達(dá)水平與對照組比無顯著差異。

圖3 日本對蝦Bcl-2基因在各組織中的表達(dá)Fig. 3 Distribution of Bcl-2 gene expression in different tissues of M. japonicus

2.4 siRNA干擾后的低溫脅迫實驗

對Bcl-2基因進行干擾, 在低溫脅迫后,Bcl-2基因和Caspase-3基因的表達(dá)在鰓組織中均發(fā)生了明顯變化(圖 4)。在Bcl-2基因被干擾后下調(diào)表達(dá)時,Caspase-3基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05; 圖 5)。由此推測,Bcl-2基因?qū)aspase-3基因有調(diào)控作用,為負(fù)反饋調(diào)節(jié)的作用。

圖4 日本對蝦鰓和肝胰腺Bcl-2基因相對表達(dá)量隨低溫脅迫時間的變化Fig. 4 Relative expression of Bcl-2 gene in gill and hepatopancreas of M. japonicus under low temperature stress

圖5 RNA干擾后MjBcl-2在鰓組織中的相對表達(dá)量Fig. 5 Relative expression of MjBcl-2 in gill tissue after RNA interference

2.5 TUNEL檢測結(jié)果

TUNEL結(jié)果顯示, 在28℃處理組中只有少量凋亡細(xì)胞, RNAi組和NC組隨著溫度的降低, 凋亡細(xì)胞數(shù)量不斷增加。28℃ RNAi組與NC組凋亡細(xì)胞的數(shù)量沒有明顯的數(shù)量變化, 而在10℃低溫處理組中, 可以看到, RNAi組凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯高于NC處理組(圖 6A)。圖 6B為鰓細(xì)胞凋亡率(凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)) 統(tǒng)計結(jié)果, 在12h后, 28℃ NC組、28℃ RNAi組、10℃ NC組和10℃ RNAi組細(xì)胞凋亡率分別為1.73%、2.35%、21.59%和33.70%(圖 7)。

圖6 RNA干擾后MjCaspase-3在鰓組織中的相對表達(dá)量Fig. 6 Relative expression of MjCaspase-3 in gill tissue after RNA interference

圖7 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果Fig. 7 Cell apoptosis detection result

3 討論

內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路作為調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要通路, 在維持機體正常生命活動中發(fā)揮著重要的作用, 哺乳動物的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路調(diào)控機體的免疫應(yīng)答[18,19]。本研究通過RACE技術(shù)成功克隆得到了日本對蝦MjBcl-2cDNA序列全長2432 bp, 其中, ORF為726 bp, 共編碼241個氨基酸。多序列比對結(jié)果表明,MjBcl-2具有與其他無脊椎動物高度相似的保守的 Bcl 結(jié)構(gòu)域。MjBcl-2氨基酸序列與凡納濱對蝦的同源性最高為76%。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示, 日本對蝦MjBcl-2基因與凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦聚為一支, 與擬穴青蟹 (Scylla paramamosain)聚為一類, 說明日本對蝦MjBcl-2基因在進化上是一個高度保守的基因, 與王磊等[20]對三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Bcl-2基因研究的結(jié)果一致。

研究某基因功能的基本手段之一是了解該基因在不同組織器官中的表達(dá)模式[21]。熒光定量PCR結(jié)果顯示,MjBcl-2基因在日本對蝦各個組織中均有表達(dá), 肌肉中表達(dá)量最高, 其次為鰓, 心臟中表達(dá)量最低。在甲殼動物中, 鰓作為重要的免疫器官,在非特異性免疫過程中發(fā)揮著重要的作用[22]。MjBcl-2在鰓組織中高表達(dá), 表明其參與了日本對蝦的免疫調(diào)控過程。為驗證MjBcl-2是否參與了日本對蝦溫度脅迫過程, 進行了低溫脅迫實驗, 并檢測了日本對蝦在低溫脅迫后不同時間點在鰓和肝胰腺組織中mRNA的表達(dá)情況。實驗結(jié)果顯示: 低溫脅迫后,Bcl-2基因的表達(dá)發(fā)生了明顯變化。在10℃和16℃脅迫下, 鰓和肝胰腺中的Bcl-2基因的表達(dá)水平逐漸上升, 在72h到達(dá)峰值, 在各時間點均顯著高于對照組(P<0.05); 22℃脅迫下Bcl-2基因表達(dá)水平與對照組無顯著差異。因此, 推斷MjBcl-2基因參與了日本對蝦溫度脅迫過程。該結(jié)果與細(xì)菌感染后, 暗紋東方鲀 (Takifugu obscurus) 肝臟中Bcl-2mRNA呈先上升后下降趨勢[23]; 草魚 (Ctenopharyngodon idella)Bcl-2基因在應(yīng)對鎘脅迫的過程中表達(dá)量顯著上調(diào) (P<0.05)[24]的結(jié)果相似。凡納濱對蝦在低溫應(yīng)激1.5h后, 抗凋亡基因LvBcl-2上調(diào)(0.69倍,P<0.01)[25], 與MjBcl-2在受到低溫脅迫后的結(jié)果較相似。因為其與日本對蝦在進化關(guān)系上聚為一支, 推測在甲殼動物中Bcl-2基因在受到相同刺激后的表達(dá)模式具有相似性。

為進一步驗證日本對蝦MjBcl-2基因的功能機制, 利用 RNA 干擾技術(shù)對MjBcl-2基因進行沉默,在低溫脅迫后, 分別檢測了日本對蝦Bcl-2和caspase-3基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn), 當(dāng)對Bcl-2基因進行干擾時, 日本對蝦鰓組織中的Bcl-2基因呈下調(diào)表達(dá),而caspase-3基因呈上調(diào)表達(dá), 與張云濱等[12]在三疣梭子蟹中的干擾Bcl-2基因, 進而影響凋亡通路相關(guān)基因的結(jié)果一致。有研究表明, 在氨脅迫下鯉肝胰腺的凋亡可能是由氧化應(yīng)激通過p53-Bax/Bcl-2凋亡信號通路介導(dǎo)的[16]。推測日本對蝦Bcl-2基因也可能調(diào)控caspase-3基因, 但還需要進一步驗證。

利用TUNEL技術(shù), 檢測了MjBcl-2基因被干擾后, 日本對蝦鰓組織中細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果顯示,在日本對蝦MjBcl-2基因被干擾后, 鰓組織中細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯增加, 與刺參Bcl-2基因在被敲除后體腔細(xì)胞凋亡率顯著增加[14]的結(jié)果相同。這說明,日本對蝦MjBcl-2基因參與了細(xì)胞凋亡過程。在本研究中, 與正常溫度相比, 低溫脅迫下的干擾組凋亡細(xì)胞要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組, 猜測MjBcl-2基因被干擾后, 鰓組織中的識別機制遭到破壞, 凋亡細(xì)胞無法及時清除, 在鰓組織內(nèi)逐漸積累。

4 結(jié)論

細(xì)胞凋亡是由一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控所控制的自主死亡過程, 其在機體免疫和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著非常重要的作用[26—28]。Bcl-2 家族基因是影響線粒體凋亡途徑的重要因素之一, 其中Bcl-2基因極其重要, 作用主要是抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[29]。Caspase 蛋白酶家族在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用, 它們是細(xì)胞凋亡過程中的具體執(zhí)行者, 通過接受外界信號,以此來完成對特定蛋白底物的水解, 從而使細(xì)胞凋亡[30]。本實驗表明日本對蝦MjBcl-2基因可能參與了溫度脅迫下的細(xì)胞凋亡過程, 至于具體的調(diào)控過程, 目前尚不完全清楚。推測當(dāng)日本對蝦受到溫度脅迫時, 其體內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)通過傳導(dǎo)信號, 引起相關(guān)信號通路的變化,對外界刺激進行應(yīng)對。在今后的工作當(dāng)中, 通過對相關(guān)信號通路的研究, 探究日本對蝦Bcl-2具體功能, 為培育日本對蝦耐低溫新品種提供理論基礎(chǔ)。