陳雪峰 王春琳 李榮華 顧志敏 徐賓朋 程海華 彭 菲

(1. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 國家羅氏沼蝦遺傳育種中心, 湖州 313001; 2. 寧波大學海洋學院, 寧波 315211)

羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)食性廣、病害少、生長快、營養(yǎng)價值高、經(jīng)濟價值高,是世界多地的重要養(yǎng)殖品種之一。我國于1976年從日本引進該蝦, 經(jīng)40多年的發(fā)展, 羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)處于世界第一。據(jù)不完全統(tǒng)計, 至2020年, 中國苗種年生產(chǎn)量達到300億尾, 養(yǎng)殖面積超過300 km2,總產(chǎn)量超過15×107kg。產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定快速發(fā)展得益于中國羅氏沼蝦育種項目的開展及選育良種的產(chǎn)業(yè)化推廣。浙江省淡水水產(chǎn)研究所自2006年開始以緬甸野生群體、浙江養(yǎng)殖群體和廣西養(yǎng)殖群體為基礎(chǔ)群體, 運用BLUP育種技術(shù), 經(jīng)過連續(xù)4年的家系選育, 2009年, 獲得了第一個經(jīng)中國水產(chǎn)原種和良種審定委員會審定通過的羅氏沼蝦選育新品種“南太湖2號”(品種登記號: GS-01-001-2009), 經(jīng)遺傳改良后, 羅氏沼蝦“南太湖2號”的生長速度和成活率顯著提高, 與商業(yè)苗種相比生長速度提高36.87%, 成活率提高7.76%。隨后, 以生長速度、成活率及餌料利用率為育種目標進行繼續(xù)選育, 至2018年, 核心育種群更新至第13代, 選育世代全世界最長。

然而, 傳統(tǒng)的選擇育種是基于性狀表型值進行選育, 育種周期長、效率低, 隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展, 高通量開發(fā)分子標記越來越便利, 分子標記輔助育種成為熱點, 與常規(guī)育種相比, 該技術(shù)有效地克服了常規(guī)育種過程中所采用的形態(tài)學標記存在數(shù)目少、受環(huán)境影響較大和不易直接選擇等缺點, 從而可加速育種進程, 提高育種效率, 縮短育種年限[1]。分子輔助育種中應(yīng)用最多的一類位點是微衛(wèi)星位點。微衛(wèi)星(Microsatellites)又稱簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeats, SSR), 具有多態(tài)性高、信息含量豐富和共顯性遺傳等優(yōu)點[2,3], 被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的種質(zhì)鑒定、遺傳結(jié)構(gòu)分析、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位等方面[4—6]。傳統(tǒng)SSR標記的開發(fā)是通過構(gòu)建基因組文庫進行篩選, 方法操作繁瑣, 費時費力且費用昂貴, 在一定程度上限制了SSR標記的研究與應(yīng)用[7]。近年來, 高通量測序技術(shù)的發(fā)展為全基因組水平篩選短串聯(lián)重復(fù)序列變異提供了基礎(chǔ), 已有大量基于高通量測序數(shù)據(jù)開發(fā)SSR標記的成功案例[8—10]?；谵D(zhuǎn)錄組測序結(jié)果挖掘SSR標記已在黃姑魚(Nibea albiflora)[11]、黃唇魚(Bahaba taipingensis)[12]、翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)[13]、東海帶魚(Trichiurus lepturus)[14]、雙須骨舌魚(Osteoglossum bicirrhosum)[15]、大口黑鱸(Micropterus salmoides)[16]、口蝦蛄(Oratosquilla oratoria)[17]、紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)[18]等水產(chǎn)動物中開展并獲得大量群體特異性位點。國內(nèi)外在水產(chǎn)動物中篩選與生產(chǎn)性能相關(guān)微衛(wèi)星標記的工作也得到了廣泛開展。Cnaani等[19]篩選得到與羅非魚(Oreochromis mossambicus)體長相關(guān)的微衛(wèi)星標記。Lu等[20]篩選得到與文蛤(Meretrix meretrix)生長相關(guān)的微衛(wèi)星標記; Hsu等[21]發(fā)現(xiàn)了石斑魚(Epinephelus tukula)中與生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標記。國內(nèi)學者在凡納濱對蝦(Litopeneaus vannamei)[22]、中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)[23]等品種中均發(fā)現(xiàn)了與生長相關(guān)的微衛(wèi)星標記。有關(guān)羅氏沼蝦SSR相關(guān)的研究工作已有開展, 但大多集中在群體遺傳結(jié)構(gòu)評估方面,目前尚未見運用SSR標記對羅氏沼蝦生產(chǎn)性狀進行關(guān)聯(lián)分析的研究。本研究對轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點進行了多態(tài)性篩選, 而后分別以家系、群體為研究對象, 進行SSR標記與體質(zhì)量關(guān)聯(lián)分析, 以期找到與體質(zhì)量相關(guān)的SSR標記, 為今后開展羅氏沼蝦的分子標記輔助育種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗蝦

2017年4月, 從浙江國家級羅氏沼蝦遺傳育種中心內(nèi)核心育種群中選取1尾雄蝦、1尾雌蝦進行交配, 構(gòu)建全同胞家系群(FS)1個。通過群體隨機交配, 構(gòu)建孟加拉封閉群(MJL)1個, 該群體為2014年從孟加拉國天然河流中引進, 引進后至本實驗前共經(jīng)歷3代人工隨機交配。兩個群體于5月份繁殖出苗, 設(shè)置養(yǎng)殖密度2萬/畝, 兩個群體分別養(yǎng)殖于2個池塘, 養(yǎng)殖4個月, FS群體隨機起捕119尾蝦, MJL群體隨機起捕199尾蝦, 測定每尾蝦的體質(zhì)量。剪取肌肉組織, 固定于95%的乙醇中用于DNA提取。

1.2 多態(tài)性SSR引物篩選

2017年本實驗室采用Illumina HiSeq? 4000高通量測序平臺對羅氏沼蝦卵巢組織進行轉(zhuǎn)錄組測序, 原始數(shù)據(jù)經(jīng)經(jīng)質(zhì)控、組裝后, 拼接獲得95379個Unigenes, 采用MISA軟件對Unigenes進行SSR檢測[24]。選取重復(fù)次數(shù)在5次以上的三堿基、四堿基或五堿基重復(fù)序列, 使用Primer Premier5.0軟件進行引物設(shè)計, 隨機選擇10個個體進行多態(tài)性SSR位點篩選, 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 基因組DNA提取

采用TaKaRa基因組抽提試劑盒對兩個群體的樣品進行基因組DNA抽提, 具體操作方法參照說明書, 1%的瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度, DNA樣品保存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增與熒光檢測

PCR反應(yīng)總體積為25 μL, 模板為基因組DNA 50 ng, 其他組分根據(jù)Taq酶(TaKaRa)說明書要求,在正向引物5′端標記熒光素FAM(藍色)。PCR反應(yīng)條件為: 94℃ 2min; 94℃ 30s, 60℃ 45s, 72℃ 2min, 30個循環(huán); 72℃延伸10min; 4℃保存。用ABI3730XL(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)DNA分析儀對PCR產(chǎn)物進行自動熒光檢測。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Genemapper4.0軟件生成每個位點的圖譜文件, 測出PCR擴增產(chǎn)物長度與熒光強度峰值, 獲得每個位點的基因型。Popgene1.32計算等位基因數(shù)(Numbers of the alleles,Na)、有效等位基因數(shù)(Numbers of the effective alleles,Ne)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)及Hard-weinberg平衡檢驗(P值)[25]。參照Botstein等[26]的方法計算多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)。利用GenAlEx6.5軟件進行群體間非偏Nei遺傳距離分析、群體配對遺傳分化系數(shù)Fst檢驗、群體配對GStatistics分析、分子方差分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)及主坐標分析(Principal coordinates analysis, PCoA)。利用structure2.3.4軟件計算群體結(jié)構(gòu), Structure Harvester在線工具(http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)確定最優(yōu)K值, distruct1.1軟件構(gòu)畫群體結(jié)構(gòu)圖。

利用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析, 首先對表型數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗, 應(yīng)用一般線性模型(General Linear Model, GLM)進行微衛(wèi)星位點與體質(zhì)量關(guān)聯(lián)分析, 并對同一位點不同基因型進行多重比較(LSD)。由于一些位點中某些基因型頻率太少, 不具統(tǒng)計分析意義。因此在實際統(tǒng)計分析中, 每種基因型的樣本數(shù)出現(xiàn)4次以上觀察值時才被考慮。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量表型值分布

119尾FS群體質(zhì)量介于3.12—53.82 g, 平均體質(zhì)量(24.18±1.13) g; 199尾MJL群的體質(zhì)量介于2.30—47.47 g, 平均體質(zhì)量(16.65±0.69) g。體質(zhì)量顯示出連續(xù)變異的特點, 表明體質(zhì)量性狀受多基因控制為典型的數(shù)量性狀。通過SPSS軟件進行正態(tài)性檢驗, FS群體體質(zhì)量性狀符合正態(tài)分布, MJL群體體質(zhì)量性狀不符合正態(tài)分布, 為了下一步分析,將MJL群體體質(zhì)量進行了SQRT轉(zhuǎn)換, 轉(zhuǎn)換后體質(zhì)量的分布符合正態(tài)分布(表 1)。

表1 體質(zhì)量(克)的表型數(shù)據(jù)及正態(tài)分布檢驗Tab. 1 Phenotype data of body weight (in g) and normal distribution test

2.2 轉(zhuǎn)錄組SSR引物篩選

共查找到18592個由1—6個核苷酸重復(fù)序列組成的SSR位點, 占Unigenes總數(shù)的比例為19.49%。單核苷酸重復(fù)類型比例最高, 達52.71%, 隨后依次為二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)類型, 占比分別為32.61%、15.90%、0.80%、0.05%和0.04%。在單、二、三核苷酸重復(fù)類型中, 數(shù)量最多的重復(fù)基元分別為A/T(9407個)、AG/GA(2244個)、AAT/ATA/TAA(344個), 數(shù)量最少的重復(fù)基元分別為C/G(392個)、CG/GC(12個)、CGG/GGC/GCG(15個; 圖 1)。隨機選取了63個位點進行了多態(tài)性篩選, 結(jié)果31個位點表現(xiàn)出多態(tài), 32個位點沒有多態(tài)性, 多態(tài)位點比例占49.2%(表 2)。

表2 多態(tài)性位點篩選結(jié)果Tab. 2 Screening results of polymorphism loci

續(xù)表2

圖1 羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中Unigenes的SSR分析結(jié)果Fig. 1 SSR analysis results of unigenes in transcriptome of M.rosenbergii

2.3 群體遺傳多樣性分析

在31個多態(tài)位點中, 選取19個位點進行遺傳多樣性分析。用19個微衛(wèi)星引物對FS群體與MJL群體進行PCR擴增, 結(jié)果顯示, 在FS群體中位點MR32與MR45沒有多態(tài)性, 整個群體中共檢測到40個等位基因, 平均等位基因數(shù)為2.1053, 有效等位基因數(shù)為1—2.6454, 平均值為1.6983, 觀測雜合度為0—0.9076, 平均值為0.4525, 期望雜合度為0—0.6246, 平均值為0.3804, 多態(tài)信息含量為0—0.5516, 平均值為0.3076, 有2個位點PIC值大于0.5, 2個位點PIC值小于0.25,15個位點的PIC值在0.25—0.5, 19個位點中, MR30與MR45位點符合Hard-weinberg平衡, 其余17個位點顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)偏離Hard-weinberg平衡; 在MJL群體中共檢測到65個等位基因, 平均等位基因數(shù)為3.4211, 有效等位基因數(shù)為1.0901—4.2309, 平均值為2.0941, 觀測雜合度為0.0854—0.6734, 平均值為0.4105, 期望雜合度為0.0826—0.7656, 平均值為0.4496, 多態(tài)信息含量為0.0805—0.7267, 平均值為0.3882, 6個位點PIC值大于0.5, 4個位點PIC值小于0.25, 9個位點的PIC值在0.25—0.5, 19個位點中,MR08、MR10、MR17、MR22、MR27、MR30、MR34、MR46與MR65位點符合Hard-weinberg平衡, 其余10個位點顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)偏離Hard-weinberg平衡(表 3)。

表3 兩個群體遺傳多樣性分析Tab. 3 Analysis of the genetic diversity of the two populations

利用GenAlEx6.5軟件分析, FS群體與MJL群體的Nei非偏遺傳距離為0.158, Nei非偏遺傳一致性為0.854。配對G-Statistics分析中Gst指數(shù)和G′st(Nei)指數(shù)分別為0.094 (P=0.001)和0.172 (P=0.001)。分子方差分析估測了由多位點多態(tài)性信息造成的方差的主要成分及各成分占比。估測總分子方差為4.868, 其中群體間差異導致的分子方差組分、群體內(nèi)個體間差異導致的分子方差組分和個體內(nèi)差異導致的分子方差組分及其占比分別為0.820(17%)、0.000(0%)和4.049(83%; 表 4)。F檢驗計算獲得的Fst、Fis和Fit分別為0.169(P=0.000)、–0.005(P=0.634)和0.165(P=0.000)?；蛄?Nm)為1.229。

表4 分子方差分析Tab. 4 Analysis of molecular variances (AMOVA)

主坐標分析計算獲取的前3個主成分占比分別為20.64%、8.95%和7.79%。通過第一個主成分組分, 能夠?qū)S群體和MJL群體區(qū)分為兩個集團, 但區(qū)分距離較小。

群體結(jié)構(gòu)分析顯示, FS和MJL兩個群體的多態(tài)性位點至少可以溯源至3個來源(最優(yōu)K值為3),MJL群體結(jié)構(gòu)較復(fù)雜, 多數(shù)多態(tài)性位點來源自3個來源的其中2個, 群體雜合度高, 存在大量高雜合度的個體; FS群體結(jié)構(gòu)較簡單, 絕大多數(shù)多態(tài)性位點來源自3個來源的另外一個(相對于MJL群體), 群體純和度較高。

2.4 SSR位點與體質(zhì)量關(guān)聯(lián)分析

利用GLM模型進行SSR位點與羅氏沼蝦體質(zhì)量關(guān)聯(lián)分析, 結(jié)果顯示, 19個SSR位點與FS群體體質(zhì)量沒有相關(guān)性, 而在MJL群體中, MR28、MR32、MR34和MR45等4個SSR位點與體質(zhì)量顯著相關(guān)(P<0.05; 表 5)。在MJL群體中對具有顯著差異的SSR位點進行不同基因型與體質(zhì)量多重比較, MR28位點277/285基因型個體體質(zhì)量均值極顯著高于277/289和285/285基因型個體(P<0.01), 顯著高于285/289、273/289、270/273和285/293基因型個體(P<0.05); MR32位點266/266和266/270基因型個體體質(zhì)量均值顯著高于270/270基因型個體(P<0.05);MR34位點210/214基因型個體體質(zhì)量均值顯著高于210/210和214/214基因型個體(P<0.05); MR45位點174/190基因型個體體質(zhì)量均值顯著高于182/182和182/190基因型個體(P<0.05; 表 6)。

表5 微衛(wèi)星位點與體質(zhì)量性狀的關(guān)聯(lián)性Tab. 5 Correlation between microsatellite loci and body weight

表6 基因型與體質(zhì)量多重比較Tab. 6 Multiple comparisons of genotype and body weight

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組SSR位點篩選

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展, 測序數(shù)據(jù)覆蓋度越來越高, 而測序成本越來越低, 成為大規(guī)模、高通量開發(fā)SSR標記的重要手段[27,28], 相比于傳統(tǒng)的SSR標記開發(fā)方法, 具有耗時少、數(shù)據(jù)量大和效率高等優(yōu)點, 已被用于甲殼動物的SSR標記開發(fā)。Nguyen等[27]從凡納濱對蝦轉(zhuǎn)錄組中篩選得到11173個SSR位點, SSR位點發(fā)生頻率為16.17%。Yan等[29]從口蝦蛄(Oratosquilla oratoria)轉(zhuǎn)錄組中篩選得到13737個SSR位點, SSR位點發(fā)生頻率為14.15%。本研究共查找到18592個SSR位點, SSR位點發(fā)生頻率為19.49%, 這種差異可能與 SSR 搜索標準、數(shù)據(jù)庫大小及物種等有關(guān)。本研究隨機選取了63個位點進行了多態(tài)性篩選, 結(jié)果63個位點都能有效擴增,表明了本次測序的拼接質(zhì)量較高, 其中31個位點表現(xiàn)出多態(tài), 由于是從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選得到的多態(tài)性位點, 位點可能與功能基因相關(guān), 可為后續(xù)與生長性狀關(guān)聯(lián)分析、遺傳圖譜構(gòu)建, QTL定位等提供有力支持。

3.2 遺傳多樣性分析

評估遺傳多樣性是育種項目開展的重要環(huán)節(jié),對各類群體進行遺傳多樣性評價有利于進行科學的種質(zhì)資源管理及優(yōu)良品種的選育。之前, 許多學者已經(jīng)通過各種分子標記對羅氏沼蝦野生、養(yǎng)殖、人工定向選育群體的遺傳多樣性進行了比較分析, 其中SSR標記運用得最為廣泛, Karaket等[6]使用7個SSR位點對泰國3個品系的遺傳多樣性進行了評估, 結(jié)果顯示3個品系具有較高的遺傳變異,3個SSR位點顯著偏離Hard-weinberg平衡, 品系間的遺傳分化顯著。Kancee等[30]為了找到泰國5個養(yǎng)殖群體與2個野生群體的養(yǎng)殖性能下降的原因, 使用6個SSR位點對7個群體進行了遺傳多樣性分析,結(jié)果表明養(yǎng)殖群體與野生群體都具有較高的遺傳變異, 養(yǎng)殖性能的下降與遺傳多樣性水平可能不相關(guān)。Thanh等[31]使用6個SSR位點對來自中國廣東、浙江、上海和廣西的4個養(yǎng)殖群體及來自越南的2個野生群體進行遺傳多樣性分析, 6個群體的多態(tài)信息含量(PIC)均大于0.5, 表明遺傳多樣性高。本研究通過19個SSR位點對羅氏沼蝦FS與MJL兩個群體進行了檢測, 結(jié)果顯示, MJL群體的平均等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、期望雜合度和多態(tài)信息含量均高于FS群體, 這是由于MJL群體為孟加拉野生群體保種傳代而來, 雖然在保種傳代過程中會人為的挑選個體大的作為留種親本, 但遺傳背景的基礎(chǔ)較大, 而FS群體為一個全同胞家系群體, 遺傳背景相對單一。群體處于 Hardy-Weinberg平衡的基本條件應(yīng)是群體足夠大, 隨機交配, 同時沒有選擇、突變、遷移和遺傳漂變等現(xiàn)象, 本研究19個SSR位點中, MJL群體有10個位點偏離Hard-weinberg平衡, 遠低于FS群體的17個偏離位點數(shù), FS群體的親本來源為以生長速度為育種目標的育種核心群體, 經(jīng)過了高強度的人工定向選擇, 會不可避免地喪失某些特定的等位基因, 因此造成了大部分SSR位點偏離Hard-weinberg平衡。多態(tài)信息含量是衡量遺傳多態(tài)性的重要指標,PIC>0.5為高度多態(tài)性位點, 0.25

3.3 與體質(zhì)量相關(guān)的SSR標記

尋找與經(jīng)濟性狀緊密相關(guān)的微衛(wèi)星標記, 并進行標記輔助選擇, 已經(jīng)成為當前水產(chǎn)生物遺傳育種的研究熱點, 許多學者報道了在魚、蝦、蟹等水產(chǎn)動物中找到了與其生產(chǎn)性狀相關(guān)的SSR位點[29]。本研究從家系與群體兩個水平進行了羅氏沼蝦體質(zhì)量相關(guān)的SSR位點篩選, 19個SSR位點與FS群體的體質(zhì)量都沒有相關(guān)性, 而在MJL群體中, 找到4個與體質(zhì)量相關(guān)的SSR位點。本研究采用的是隨機群體關(guān)聯(lián)分析法, 是把19個位點在所選的群體中進行掃描, 通過方差分析找到與目標性狀相關(guān)聯(lián)的SSR位點, 可以全面分析19個位點的情況, 準確度好, 因而在MJL群體中所獲得的4個與體質(zhì)量相關(guān)聯(lián)的位點可靠性高。4個與MJL群體體質(zhì)量相關(guān)SSR位點中, 出現(xiàn)多個標記同一個性狀相關(guān), 說明這些位點存在多因一效的現(xiàn)象, 體質(zhì)量性狀是由一個以上的 QTL 所控制, 符合數(shù)量性狀位點的定義。本研究在FS群體沒有獲得與體質(zhì)量相關(guān)的位點, 而在MJL群體中獲得了4個與體質(zhì)量相關(guān)的位點, 可能是由于兩個群體的遺傳差異造成的, 不同群體會導致與性狀相關(guān)的分子標記存在差異, 因此本研究中所篩選到的與體質(zhì)量相關(guān)標記在其他群體的適用性值得進一步研究, 這也提示我們在今后運用SSR標記進行輔助育種的研究工作中, 必須需擴大群體的規(guī)模和類型, 進行多方比較與驗證, 從而提高標記輔助性狀選擇的準確性。